鉀通道ZmK2;1在水稻中超表達提升水稻氮素利用潛力①

陳天祥，楊順瑛，蘇彥華*

鉀通道在水稻中超表達提升水稻氮素利用潛力①

陳天祥1,2，楊順瑛1，蘇彥華1,2*

(1 土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學院大學，北京 100049)

氣孔導度控制葉片對碳源(CO2)的獲取能力，通過影響光合作用對作物生產能力發揮作用。針對稻田過量施氮導致氮素利用效率趨緩的現狀，本研究對高氮投入時促進氮素吸收利用的調控策略進行研究。利用氣孔鉀通道基因超表達水稻遺傳材料，設置氮缺乏(LN，不施氮)、中量或減少氮投入(MN，200 kg/hm2)和過量施氮(HN，350 kg/hm2) 3個處理的田間試驗，對超表達植株在生育后期的氮素營養特征和生產特性進行研究。結果表明：超表達能改善水稻植株在各氮肥施用水平下的產量形成特征，差異化提升植株氮鉀含量，優化植株整體和劍葉的氮素營養特征，促進植株生物量積累，其劍葉在生育后期保持較高的光合效率(Pn)和氣孔導度(Gs)。另外，基因超表達有利于中量氮投入和過量施氮下水稻氮素利用效率的提升，尤其在過量施氮條件下，該基因過表達仍能夠促進氮肥農學效率(AEN)、氮素生理效率(PEN)和氮素收獲指數(NHI)。可見，利用氣孔鉀通道在水稻中超表達可以調節植株和關鍵功能葉氮鉀比，促進各施氮水平下的光合效率的同時提升水稻產量；在過量施氮時，依然能保持較高的光合同化能力，提升水稻氮素利用率和增產潛力。

氮素利用率；高氮投入；超表達；光合效率；增產潛力

氮素作為水稻產量形成的重要限制因子，其施用量的不同通過影響干物質和養分的積累與分配，對水稻產量形成發揮作用[1]。氮肥用量過高會降低淀粉合成能力和葉片、莖稈等組織中儲藏物質向籽粒轉運的能力[2-3]。植物葉片含氮量與光合強度密切相關，進而影響植株的干物質生產能力。在高氮供應時，水稻過表達導致植株氮同化關鍵酶活性達到飽和，碳同化步驟受到抑制[4]，而過表達在分蘗期和抽穗期的生物量顯著降低[5]。另外，和過表達水稻葉片光合參數和碳水化合物含量變化較大，高氮用量導致過表達植株在分蘗期和抽穗期的生物量顯著降低[6]。由此可見，強化銨吸收和同化關鍵基因表達對水稻植株的氮素利用有不同影響，植株體內碳氮含量的相對變化是造成植株氮素利用狀況惡化的重要原因。

光合同化過程是植物進行物質生產和生長發育的保證，不僅受葉片氮素含量變化的影響，也與氣孔運動特征密切相關。研究表明，鉀素在調節酶促反應、物質運輸和維持細胞滲透壓等生理過程的同時，也對氣孔運動發揮重要作用[7-8]。該過程由氣孔周圍的一對保衛細胞具體執行[9-10]。而保衛細胞對K+的吸收和釋放主要是由K+通道來完成[11-12]。在水稻中，其保衛細胞中表達的內向鉀通道和[13-14]和外向鉀通道負責調控保衛細胞鉀水平[15]，以此操控氣孔運動。氣孔導度是衡量植株光合特征的重要參數，氣孔運動的行為會直接導致氣孔導度的變化，其大小與葉片氮鉀營養特征有密切關系[16-17]。利用氣孔鉀通道基因超表達調節光合碳同化來改善水稻氮素利用特征的相關報道比較少見，本研究中涉及的基因是已經在玉米中被克隆的內向型鉀通道基因，該通道在保衛細胞鉀內流方面發揮重要作用[18]。因此，本研究利用基因在水稻中超表達，開展高施氮背景下通過干預氣孔導度，以氣孔調控的增碳策略為手段和出發點，對水稻氮素營養特征和產量形成特征進行研究，以期為水稻氮素利用效率的改善提供更多途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2020年稻作季在中國科學院常熟農業生態野外觀測站(31°15′15′′ N，120°57′43′′ E)進行。該研究站地處長江下游平原腹地，屬于亞熱帶北部濕潤季風氣候區，年平均氣溫為17 ℃左右，平均年降水量在1 200 mm左右。供試田塊土壤類型為潛育型水稻土，基礎土壤(0 ～ 20 cm土層)理化性質如下：pH 7.65、有機質36.82 g/kg、全氮1.66 g/kg、有效磷12.99 mg/kg、速效鉀53.12 mg/kg。

1.2 供試水稻材料的創制和鑒定

玉米基因的編碼序列[18]，克隆到由pCambia1301改造后的植物表達載體pUN1301中，置于Ubiquition啟動子的驅動之下。水稻愈傷組織轉化、植株再生委托武漢博遠生物技術有限公司進行。經潮霉素篩選的抗性再生植株進行種子繁種獲得T2代株系。T2代種子在含有潮霉素(50 mg/L)的培養基上再次篩選，并最終通過PCR確認。所得純合性轉基因株系用作試驗材料。轉基因株系中基因的超表達豐度，由qPCR確定，大致為內參基因的15倍。qPCR引物序列為-F：5′- GGAGACTATGCTGAGATAGATG-3′，R：5′-GG CTTTACACTTTATGCTTCCGG-3′。

1.3 試驗設計

本試驗設置氮缺乏(LN，不施N)、中度或減少氮投入(MN，200 kg/hm2)和氮過量施用(HN，350 kg/hm2) 3個處理條件。小區間做田埂隔離，并用塑料薄膜覆蓋埂體，保證各小區單獨排灌，株距和行距為0.2 m× 0.2 m。以尿素(46% N)為氮肥肥源，按照基肥∶分蘗肥∶穗肥=5∶2∶3的比例施用，其中基肥在插秧前施入，分蘗肥在7月中旬施入，穗肥在8月中旬施入。磷肥肥源為普通過磷酸鈣(12% P2O5)，鉀肥肥源為氯化鉀(60% K2O)。磷肥施用量為P2O590 kg/hm2，鉀肥施用量為K2O 120 kg/hm2；磷肥作為基肥一次施入，鉀肥分60% 基肥和40% 穗肥分別施用。各個氮水平條件的磷肥和鉀肥用量一致，各氮肥水平設置在12 m ×7 m的田塊中，劃分小區重復3次。灌溉、田間病蟲害防治按常規管理，其他管理措施統一按照臺站常規栽培要求實施。

1.4 測定內容與分析方法

分別于灌漿期、完熟期采集水稻植株樣品，各處理取有代表性植株，帶回室內獲取鮮物質量。然后在105 ℃殺青30 min，再在60 ℃烘干至恒重，稱量干物質量，粉碎后待測定含氮量。灌漿期采集劍葉，采集時間以齊穗期為基準(離收獲4周)，采集3份葉片作為生物學重復，做好標記帶回室內，烘干至恒重后稱量干物質量，待測定相關指標。

試驗于灌漿期在田間進行劍葉光合效率的測定。以齊穗期作為基準，每個小區選擇長勢一致的植株，采用Li-6400便攜式光合測定系統(Li-Cor，Lincoln，USA)測定每株主莖劍葉。測定時間為晴天的上午8:30—11:30，正式測試前，機器開機預熱20 min，設置光強為1 000 μmol/(m2·s)，CO2濃度為400 μmol/mol，流速500 μmol/s。

稱取一定量的粉碎后的樣品，采用H2SO4-H2O2消煮[19]。消煮液冷卻定容后按照測定要求稀釋至合適濃度范圍，消化液中的含氮量使用化學分析儀(Smartchem 200，Westco Co.，Italy)進行測定并計算，鉀含量采用火焰光度計測定并計算。

收獲時期各處理各株系收獲長勢均勻的植株，標記處理后裝入尼龍網袋帶回室內，用于后期的考種。分樣前先統計每份樣品的單株分蘗數和有效穗數并記錄。將稻穗進行脫粒，之后數取并稱量測定籽粒千粒重，獲取穗粒數，收集所有實粒并稱重，產量測定以1 m2植株為標準脫粒后處理測定。

1.5 相關指標計算

氮素利用效率的計算和評價指標分別采用氮素收獲指數[20]，以及氮素生理效率、氮肥吸收效率和氮肥農學效率[21]來表示。

氮肥吸收效率(REN，%) = (施氮區植株吸氮量–空白區的植株吸氮量) /施氮量×100

氮素生理效率 (PEN，kg/kg) = (施氮區的籽粒產量–空白區籽粒產量) / (施氮區植株氮積累量–空白區植株氮積累量)

氮肥農學效率(AEN，kg/kg) = (施氮區最終的籽粒產量–空白區最終的籽粒產量) /施氮量

氮素收獲指數 (NHI，%) = 籽粒最終氮積累量/植株最終氮積累量×100

1.6 數據統計

試驗數據采用Microsoft Excel 2019軟件進行計算處理；利用SPSS 13.0軟件進行數據統計和方差分析，通過鄧肯新復極差法進行顯著性檢驗，顯著性水平為0.05；采用Sigmaplot 12.5軟件進行制圖。

2 結果與分析

2.1 ZmK2;1超表達株系在關鍵生育期的生物量累積變化特征

對各施氮水平下超表達和野生型 (ZH-11)水稻植株氮鉀養分含量、生物量積累和氮鉀比等指標進行分析。由圖1A可以看出，施氮量的增加促進了野生型和轉基因水稻植株的氮素積累；在MN條件下，超表達植株的單株含氮量較野生型高出14.27%，差異達顯著水平(<0.05)；在HN水平下，超表達仍能促進水稻植株氮素吸收，但差異不顯著。就植株鉀素含量而言，野生型和轉基因水稻植株鉀素含量均有明顯提升(圖1B)，尤其在MN和HN水平下，超表達植株的單株含鉀量與野生型相比，顯著促進了植株鉀素吸收和積累。通過對單株生物量的分析發現(圖1C)，在各施氮處理下，超表達水稻植株的單株生物量均顯著高于野生型，尤其在MN和HN水平下，超表達水稻植株的單株生物量分別比野生型高出43.31% 和38.88%。另外，與野生型水稻植株相比，超表達植株氮鉀比在各施氮水平下均有所降低，尤其在LN和MN水平下，降低差異達顯著水平，HN水平差異不顯著；隨施氮量的增加，野生型和超表達植株氮鉀比先升高后趨于穩定(圖1D)?？梢?，超表達能夠促進水稻植株氮鉀養分的積累，特別在HN條件下，植株鉀素吸收的顯著增加，對協調植株氮鉀養分平衡發揮了作用，對植株生物量的積累有利。

2.2 ZmK2;1超表達對水稻關鍵功能葉氮鉀營養特征和光合特征的影響

植株生物量和籽粒產量的形成與灌漿階段關鍵功能葉(劍葉)氮鉀營養狀況關系密切。由圖2A可以看出，在各處理條件下，超表達水稻植株的劍葉含氮量均表現出高于野生型的趨勢，尤其在MN條件下，其較野生型高出14.46%，差異達到顯著水平(<0.05)；過量施氮條件下延續了這種趨勢，但差異不顯著，表明通過該基因超表達能夠增強劍葉氮素的獲取和分配潛力。另外，超表達水稻植株的劍葉含鉀量均顯著高于野生型植株(圖2B，<0.05)，尤其在MN條件下，超表達水稻植株的劍葉鉀含量較野生型高出49.85%，差異顯著(<0.05)；在HN條件時較野生型高出30.51%，仍然有顯著促進作用(<0.05)。通過對劍葉氮鉀比的分析發現(圖2C)，超表達水稻植株和野生型劍葉氮鉀比在各施氮條件下均表現出降低的趨勢，在MN和HN條件下，超表達植株劍葉氮鉀比相比野生型顯著降低(<0.05)，主要是由于該基因超表達導致向劍葉鉀素的分配能力增強。這種變化對其光合作用產生了積極影響，超表達植株劍葉光合效率和氣孔導度在同樣的處理條件下顯著高于野生型(圖2D、2E，<0.05)，特別在HN條件下，氣孔導度仍顯著高于野生型，光合效率較野生型高出17.07%，差異顯著(<0.05)。胞間CO2濃度隨施氮量增加趨于穩定(圖2F)。這些生理特征的差異表明，超表達通過影響劍葉氮鉀營養的獲取和分配，對其光合特征也產生促進作用。劍葉作為水稻進行光合生產的關鍵功能葉片，超表達可以促進植株在不同處理條件下的劍葉鉀分配，使得超表達植株劍葉氮鉀比顯著低于野生型，而這種變化使劍葉氣孔導度和光合效率都有顯著增加(<0.05)。在MN和HN條件下，兩種植株間劍葉胞間CO2濃度沒有明顯的變化，主要是因為超表達植株劍葉有較高的光合效率，對碳源有較強的同化利用能力所致；可見，超表達可以通過優化其氮鉀營養狀況改善高氮條件下的水稻光合同化效率。

(ZH-11為野生型水稻株系，ZmK2;1-OX為ZmK2;1超表達株系。A. 植株氮積累量；B. 植株鉀積累量；C. 單株生物量；D. 植株氮鉀比。*表示同一處理不同水稻株系間差異達P<0.05顯著水平，n=4，下圖同)

2.3 ZmK2;1超表達對水稻產量特征的影響

由表1可以看出，超表達對水稻產量構成特征參數有著不同程度的影響。在各個氮肥施用條件下，超表達水稻植株的單株分蘗數均高于野生型(ZH-11)水稻植株，尤其在MN和HN條件下，差異達到顯著水平(<0.05)，分別較野生型高出18.93% 和25%。通過對單株有效穗數的分析發現，在各個氮肥施用條件下，超表達水稻植株的單株有效分蘗數均高于野生型水稻植株，尤其在MN和HN條件下差異顯著(<0.05)，分別較野生型高出30.95% 和38.86%。通過計算成穗率發現，超表達植株成穗率在各施氮條件下均高于野生型植株，尤其MN和HN條件時顯著高于野生型(<0.05)，表明單株有效分蘗的形成數量隨單株總分蘗數增加同步增加。就單穗粒數而言，同樣在MN和HN條件下，超表達植株表現出顯著增加的趨勢(<0.05)，分別較野生型高出10.91% 和7.44%。在各個氮肥處理條件下，超表達水稻植株的千粒重均高于野生型植株，尤其在MN條件下，較野生型高出18.26%，差異顯著(<0.05)；HN水平時，千粒重仍能表現出優勢，表明超表達株系在高氮投入時仍維持較高的灌漿潛力。另外，通過分析籽粒產量的變化趨勢發現，在MN和HN條件下的總體產量水平趨于穩定，而超表達水稻產量較野生型分別高出20.21% 和17.11%。可以看出，中量施氮和高量施氮條件下超表達植株的產量均有顯著增加(<0.05)；尤其在高氮投入下，較高的成穗率、單穗粒數和千粒重是超表達植株發揮增產潛力的積極因素。

(A. 劍葉含氮量；B. 劍葉含鉀量；C. 劍葉氮鉀比；D. 光合速率；E. 氣孔導度；F. 胞間CO2濃度)

表1 ZmK2;1超表達對水稻產量構成特征的影響

注：表中數據表示為平均值±標準差；同列數據小寫字母不同表示同一處理不同水稻株系間差異達0.05顯著水平。

2.4 ZmK2;1超表達對水稻氮素利用效率和氮素分配的影響

由圖3A可以看出，增加施氮量明顯促進了野生型和超表達植株生物量的增加，且超表達植株的葉片持綠特征更明顯。圖3B的結果表明，在MN條件下，超表達能夠促進植株對氮素的吸收和積累，超表達水稻植株的氮肥吸收效率較野生型(ZH-11)水稻植株高出34.97%，差異達到顯著水平(<0.05)；在HN條件下，仍然保持了增加的趨勢，但差異不顯著。通過對水稻植株氮素生理效率的分析發現(圖3C)，在MN條件下，超表達水稻植株的氮素生理效率較野生型植株增加17.68%，達到顯著差異水平(<0.05)，并且在HN條件下延續了這種積極的變化趨勢。另外，在MN和HN條件下，超表達植株氮肥農學效率均顯著高于野生型(圖3D，<0.05)，表明該基因的超表達能夠耐高氮，并發揮一定的增產潛力。就氮素收獲指數而言(圖3E)，在MN和HN條件下，超表達植株分別較野生型高出39.47% 和51.88%，差異達顯著水平(<0.05)?？梢姡磉_植株能夠顯著促進施氮條件下水稻對氮素的吸收利用，氮肥農學利用率和氮素收獲指數隨之顯著提升，特別在高量施氮條件下，同樣能對植株氮素利用效率的提升發揮作用。由于基因超表達改善了植株氮鉀營養特征，使植株光合碳同化效率得以增強，這種變化也有利于籽粒產量形成，從而提升了高氮條件下的氮素利用潛力。

(A. 完熟期植株生長的代表性照片，Bar=1 dm；B. 氮素吸收效率(REN)；C. 氮素生理效率(PEN)；D. 氮肥農學效率(AEN)；E. 氮素收獲指數(NHI)；n=3)

3 討論

水稻干物質積累和分配與氮素和鉀素水平密切相關，提高鉀素用量可以增加水稻干物質累積速率[22]。鉀素營養潛力取決于它與植物代謝過程的關系[23]。而氣孔作為CO2進出植物體的重要門戶，其運動狀態將在很大程度上作用于光合作用，利用內向型鉀通道調控的手段，將比較有效地改善作物光合生產能力[24]。本研究發現，在各個氮素水平下，在水稻中超表達能夠促進氮素和鉀素的吸收。在中量施氮(MN)條件下，超表達植株氮鉀積累量均顯著高于野生型。在過量施氮(HN)條件下，超表達植株含鉀量和生物量仍能得到顯著提升，表明超表達有利于氮鉀營養吸收，而吸收水平的差異有利于協調植株氮鉀比，促進植株生長。

關鍵功能葉(劍葉)的光合特性能夠在一定程度上代表該植株的籽粒生產能力[25-26]。氣孔運動所導致的氣孔開度的變化影響光合過程，這種運動受鉀通道活性變化的控制[27]。在本研究中，劍葉氮鉀含量隨處理水平表現出升高的趨勢，鉀含量顯著高于野生型。超表達植株和野生型植株劍葉氣孔導度隨施氮量增加趨于飽和，在MN和HN條件下，超表達劍葉光合效率和氣孔導度顯著高于野生型，表明該基因超表達提升劍葉鉀含量的同時促進了氣孔開放。葉片鉀含量的提高會提升保衛細胞膨壓以保障氣孔開放[28]，進而提高葉片碳同化水平；光合效率的提升耦合了高施氮量下較高的劍葉含氮量，從而提升干物質生產能力。另外，氣孔導度與葉片鉀含量間存在顯著的正相關關系[29-30]。本研究中，各處理水平下，超表達植株和野生型水稻植株劍葉胞間CO2濃度表現出先升高然后穩定的趨勢，超表達植株和野生型間無明顯差異。可見，劍葉氮鉀水平的協同提高有利于光合同化效率，尤其在HN條件下，超表達植株劍葉仍能維持較高的光合效率和氣孔導度，這也是其胞間CO2濃度與野生型基本持平的原因所在。

水稻產量形成的過程實際上就是干物質合成、轉運和積累的過程，提高干物質積累是實現高產的前提[31]。增施氮肥可以顯著提高水稻的凈光合速率和產量，過量則不利[32]。氮鉀配施能夠對葉片氮鉀營養特征產生影響，進而在一定范圍內對光合碳同化過程產生積極作用[33]。本研究中產量構成因素的相關結果表明，超表達和野生型相比能夠提升植株的分蘗能力，對穗粒數、千粒重和籽粒產量有明顯的促進作用，表明該基因表達活性的增加能夠提升水稻植株的籽粒生產和灌漿能力，超表達通過改善植株和關鍵功能葉的氮鉀養分狀況促進了植株的氮素干物質生產能力，而這種變化得益于灌漿期較高的劍葉光合碳同化能力，對提升水稻生育后期的灌漿能力和產量形成有利。

氮素利用包括植株對氮素的吸收同化，以及向籽粒的分配效率[31]。本研究中，在MN和HN條件下，基因超表達能夠促進氮素吸收，超表達水稻植株的氮肥吸收效率明顯提高。在MN水平下，超表達水稻植株的氮素生理效率得到顯著提升，在HN條件下仍有優勢。氮肥農學效率表示增施氮肥的水稻增產效果，在MN和HN條件下，超表達植株氮肥農學效率均顯著高于野生型，尤其HN條件時，超表達水稻植株仍有增產優勢。然而，此前有研究通過關鍵銨吸收基因和同化基因的過表達，發現植株長勢均弱于野生型，籽粒生產能力減弱，認為是由于植株碳源供應的差異所致[4，6]?？梢?，高氮條件下，通過氣孔鉀通道基因超表達增強光合碳同化能力，能夠彌補高氮條件下植株碳不足的境況。另外，超表達植株氮素收獲指數在MN和HN條件下較野生型均有顯著提升，尤其過量施氮條件下，氮素收獲指數明顯提高，表明通過氣孔調控途徑增加光合碳同化的方式對協同提高籽粒氮分配有積極作用，高量氮投入所導致的水稻體內的高氮環境需要碳同化過程的協調，才能更好發揮氮素利用潛力。

4 結論

超表達水稻植株有較強的有效分蘗的形成能力，植株生物量和千粒重的提升表明超表達能夠促進水稻植株干物質積累和籽粒灌漿效率。在中量施氮時，超表達對植株氮鉀營養特征的改善使關鍵功能葉在生育期內保持較高的光合同化效率，促進植株體氮素利用效率和產量的提升。尤其在過量施氮條件下，超表達仍能促進氣孔開放和碳源的利用，提升水稻在高氮環境下的光合效率，這對植株氮素利用率和增產潛力的發揮有利。

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Overexpression of Potassium Channelin Rice Improves Nitrogen Utilization Potential

CHEN Tianxiang1,2, YANG Shunying1, SU Yanhua1,2 *

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Stomatal conductance controls the ability of leaves to acquire carbon sources (CO2), and it is closely related to crop productivity by affecting photosynthesis. In view of the current situation of slowing N use efficiency caused by N fertilizer overuse in paddy soil, it is necessary to study the regulation strategy of high N fertilizer input to promote N absorption and utilization. Therefore,overexpression transgenic lines were used to set up a field experiment of three conditions including N deficient (LN, no N application), moderate or reduced N input (MN, 200 kg/hm2) and N fertilizer overuse (HN, 350 kg/hm2), which were used to study the N nutrition characteristics and production traits in the later growth stage. The results show thatoverexpression can improve the yield characteristics for rice plants under each N application level. At the same time, the content of N and K are increased differentially, it optimizes nitrogen nutrition characteristics of the whole plant and key functional leaves (flag leaves), and promotes the accumulation of plant biomass. Besides, the flag leaf ofoverexpression plant maintains a promising photosynthetic rate (Pn) and stomatal conductance (Gs) during the later growth period. In addition,overexpression can promote the N use efficiency of rice under the N fertilizer moderate input and N fertilizer overuse, especially under the condition of N fertilizer overuse, the overexpression of this gene can still promote agronomic N use efficiency (AEN), physiological N use efficiency (PEN) and N harvest index (NHI). Obviously, overexpression of the stomatal potassium channelin rice can regulate the N/K ratio of plants and key functional leaves, promote photosynthetic rate, and improve the rice yield under different N application. In particular, under the condition of N fertilizer overuse, it can still maintain a high photosynthesis assimilation ability, and plays a positive effect on performing the N use efficiency and yield-increasing potential of rice.

N use efficiency; N fertilizer overuse;overexpression; Photosynthesis rate; Yield-increasing potential

S511.2；Q945.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2023.03.008

陳天祥, 楊順瑛, 蘇彥華. 鉀通道在水稻中超表達提升水稻氮素利用潛力. 土壤, 2023, 55(3): 520–527.

中國科學院戰略性科技先導專項(A類) (XDA24010201)資助。

(yhsu@issas.ac.cn)

陳天祥(1991—)，男，甘肅天水人，博士研究生，主要從事植物營養生理方面的研究。E-mail: 18795270435@163.com