慢性間歇性低氧暴露對大鼠肝臟鐵代謝的影響及機(jī)制研究

宋紀(jì)顯, 陳 琦, 賈翠玲, 李博良, 張 智, 趙亞碩

(河北省中醫(yī)藥結(jié)合氫醫(yī)學(xué)技術(shù)創(chuàng)新中心/河北中醫(yī)學(xué)院, 河北 石家莊 050200)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea,OSA)是一種典型的呼吸系統(tǒng)疾病,最主要的病理特征是慢性間歇性低氧(Chronic Intermittent Hypoxia,CIH),可引起代謝紊亂及炎癥反應(yīng)等,造成多器官損傷[1]。有研究證實(shí)CIH可導(dǎo)致十二指腸、肝臟、脾臟等器官的鐵代謝紊亂,但其具體機(jī)制尚不明確[2]。肝臟是調(diào)節(jié)鐵代謝的重要器官,其分泌的hepcidin是調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的主要物質(zhì),可參與鐵的吸收、釋放及利用[3],這主要依靠轉(zhuǎn)鐵蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(Transferrin-Transferrin receptor 1,Tf-TfR1)、二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal-ion transporter 1,DMT1)、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Ferroportin 1,FPN1)及鐵存儲蛋白(Ferrtin)來實(shí)現(xiàn)[4]。研究表明hepcidin的表達(dá)受白細(xì)胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)等炎癥因子的調(diào)節(jié),而CIH暴露后可誘導(dǎo)大量炎癥因子表達(dá)[5,6]。因此CIH暴露引起的炎癥反應(yīng)可能影響hepcidin的表達(dá)進(jìn)而造成機(jī)體鐵代謝失衡。故我們通過建立CIH大鼠模型,試圖闡明CIH暴露影響hepcidin進(jìn)而造成肝臟鐵代謝紊亂的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動物:SPF級雄性SD大鼠(200±20g),購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006,于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心動物中心進(jìn)行飼養(yǎng)(動物倫理編號:DWLL2020044)。

1.2主要試劑與儀器:亞鐵氰化鉀(Sigma-Aldrich,貨號:14459-95-1),血清鐵、總鐵結(jié)合力試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A039-1-1、A040-1-1),DMT1(+ire)、DMT1(-ire)抗體(Alpha diagnostic international,貨號:NRAMP21-S、NRAMP23-A),FPN1抗體(Alpha diagnostic international,貨號:543233S5),TfR1抗體(Invitrogen,貨號:13-6800),FTL抗體(Abcam,貨號:ab109373),STAT3、p-STAT3抗體(Affinity,貨號:AF6293、AF3294),β-actin抗體(Cwbiotech,貨號:CW0096)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量試劑盒(Takara,貨號:RR820A、RR047A),引物(Invitrogen),CIH氧艙(Oxyeycler Model 84,BioSpherix公司,美國)。

1.3動物模型和分組:在實(shí)驗(yàn)開始前,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。將SD大鼠(n=20)隨機(jī)分為常氧對照組(Normoxia)和模型組(CIH)。將模型組大鼠放置在動物間歇性低氧艙內(nèi),首先向艙內(nèi)充入100% 氮?dú)?使氧氣濃度從21%降至5%,持續(xù)1.5min,后1.5min內(nèi)向艙內(nèi)充入100% 氧氣使氧氣濃度逐漸恢復(fù)到21%,每天8h,共35d(參考本課題組前期文獻(xiàn)進(jìn)行)[7]。對照組大鼠在間歇性低氧艙內(nèi)充入空氣,以保證其他環(huán)境條件一致。

1.4樣本采集:造模結(jié)束后,采用腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行麻醉,通過股動脈采取大鼠血液。然后取大鼠肝臟,部分固定在 4%多聚甲醛,用于HE 染色、普魯士藍(lán)染色,部分放入凍存管內(nèi)于-80℃長期保存,用于Western blot及Q-PCR檢測。

1.5HE染色:采用HE染色觀察肝臟的結(jié)構(gòu)。將石蠟切片進(jìn)行脫蠟,梯度酒精復(fù)水。然后進(jìn)行蘇木精染色、分化、伊紅染色,之后梯度酒精脫水,封片。然后在顯微鏡下觀察。

1.6血清鐵、TIBC測定:血清鐵,將血清鐵與顯色劑在100℃水中反應(yīng)5min,離心后收集上清,在520nm處檢測吸收值。TIBC測定,將標(biāo)準(zhǔn)鐵(10mg/L)加入血清中室溫反應(yīng)5min,離心收集上清液。將上清液與鐵顯色劑混合,100℃反應(yīng)5min,然后在520nm處檢測吸收值。

1.7普魯士藍(lán)染色:切片脫蠟后用磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS pH=7.4)清洗,然后用3% H2O2室溫孵育20min,用PBS沖洗后于Perls’試劑中室溫浸泡6h。然后DAB加強(qiáng),蘇木精染色,脫水,最后用中性樹脂封片,顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞。

1.8Western blot:將肝臟組織裂解提取蛋白,用BCA試劑盒測定蛋白濃度。采用SDS-PAGE將蛋白進(jìn)行分離,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉后,孵育DMT1(+ire)、DMT1(-ire)、FPN1、TfR1、FTL、p-STAT3、STAT3、β-actin一抗4℃過夜。第2天TBST洗滌后,室溫孵育相應(yīng)二抗1h。最后,采用ECL法進(jìn)行化學(xué)成像,采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.9Q-PCR:采用Trizol方法從肝組織中提取總RNA。取1μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄提取cDNA。取40ng cDNA,加入基因特異性引物和2×SYBR Premix Ex Taq制成混合體系。采用實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行檢測,反應(yīng)步驟:孵育95℃ 5min,然后94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s共40個(gè)循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1CIH暴露后大鼠肝臟病理結(jié)構(gòu)改變:在正常肝組織中,HE染色顯示肝索呈放射狀分布,圍繞肝小葉中央靜脈排列,未見炎性細(xì)胞浸潤。與對照組相比模型組肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,胞漿中出現(xiàn)不同大小和數(shù)量的脂肪空泡,細(xì)胞核萎縮(見圖1)。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化(HE,n=6,×200,×400)

2.2CIH暴露后大鼠血清鐵含量變化:與對照組相比,模型組血清鐵含量及轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度顯著下降,未飽和鐵結(jié)合力顯著上升。對照組和模型組大鼠血清中總鐵結(jié)合力無顯著差異(見表2)。

表2 各組大鼠血清鐵血清總鐵結(jié)合力血清未飽和鐵結(jié)合力血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度水平

2.3CIH暴露后大鼠肝臟中鐵含量及FTL蛋白水平:普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示,與對照組相比模型組肝臟中鐵含量顯著增多(見圖2)。Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比模型組大鼠肝臟FTL蛋白水平明顯上升(見表3,圖3)。

圖2 各組大鼠肝臟普魯士藍(lán)染色(n=6,×200,×400)

圖3 各組大鼠FTL蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠FTL蛋白表達(dá)水平

2.4CIH暴露后大鼠肝臟中鐵代謝情況:與對照組相比,模型組DMT1(+ire) mRNA和蛋白水平,TfR1 mRNA和蛋白水平均顯著上升;DMT1(-ire) mRNA和蛋白表達(dá)無顯著變化(見表4、5,圖4)。與對照組相比,模型組肝臟FPN1 mRNA無明顯變化,蛋白水平顯著下降(見表5,圖4)。

圖4 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表達(dá)水平

表4 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1 mRNA表達(dá)水平

表5 各組大鼠DMT1(+ire) DMT1(-ire) TfR1 FPN1蛋白表達(dá)水平

2.5CIH暴露后大鼠肝臟中hepcidin表達(dá):與對照組相比,模型組肝臟hepcidin及IL-6 mRNA水平均顯著上升(見表6)。與對照組相比,模型組大鼠肝臟STAT3蛋白發(fā)生明顯磷酸化(見表7,圖5)。

圖5 各組大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表達(dá)水平

表6 各組大鼠hepcidin IL-6 mRNA表達(dá)水平

表7 各組大鼠p-STAT3/STAT 3蛋白表達(dá)水平

3 討 論

有證據(jù)表明OSA患者體內(nèi)鐵蛋白水平明顯升高,且與疾病嚴(yán)重程度成正比[8]。機(jī)體為適應(yīng)低氧環(huán)境,需要大量鐵元素以滿足氧氣運(yùn)輸,肝臟作為體內(nèi)調(diào)控鐵平衡的重要場所,也是受CIH影響的重要靶器官。當(dāng)機(jī)體鐵過載時(shí),肝臟能迅速吸收非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(non-transferrin-bound iron,NTBI)并儲存在肝細(xì)胞中[9]。本研究發(fā)現(xiàn)CIH暴露后大鼠血清鐵含量和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度下降而血清未飽和鐵結(jié)合力顯著上升,說明機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的能力下降;肝臟FTL蛋白表達(dá)上升,鐵沉積顯著增加;同時(shí)HE結(jié)果顯示CIH暴露后大鼠肝臟出現(xiàn)病理損傷,這說明CIH可以引起肝臟鐵沉積進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷。

肝臟中的鐵代謝,包括鐵的吸收、釋放和存儲都受到嚴(yán)格調(diào)控。機(jī)體鐵的吸收主要依靠TfR1和DMT1,二者分別吸收Fe3+和Fe2+,進(jìn)入到機(jī)體中的鐵部分通過FPN1輸出進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)以滿足生理活動需求,部分則儲存在鐵蛋白(Ferrtin)內(nèi)[10]。本研究結(jié)果顯示,CIH暴露后大鼠肝臟中TfR1和DMT1(+ire)的表達(dá)顯著增加,而FPN1表達(dá)顯著下降,這表明在CIH暴露期間,肝臟鐵攝取增多、輸出減少,導(dǎo)致鐵沉積。

Hepcidin是調(diào)控系統(tǒng)鐵代謝的中樞因子,高水平的hepcidin會抑制FPN1從巨噬細(xì)胞和肝臟中輸出鐵,導(dǎo)致血清鐵的下降[11]。本研究發(fā)現(xiàn)肝臟中hepcidin mRNA水平顯著升高,這說明hepcidin表達(dá)增加導(dǎo)致FPN1表達(dá)下降可能是CIH暴露引起肝臟鐵超載的主要原因。Hepcidin作為一種抗菌肽,在受到炎癥刺激時(shí)會被誘導(dǎo)表達(dá)。IL-6能夠引起STAT3磷酸化,激活的STAT3可與HAMP啟動子中的應(yīng)答元件結(jié)合,促進(jìn)hepcidin的轉(zhuǎn)錄,上調(diào)hepcidin的表達(dá)[12]。本研究結(jié)果顯示,CIH暴露后大鼠肝臟中IL-6表達(dá)增加,p-STAT3/STAT3的比值也顯著上升,這表明CIH 暴露可通過IL-6/STAT3通路造成肝臟中hepcidin的高水平表達(dá)。

綜上所述,CIH暴露可以通過IL-6/STAT3通路導(dǎo)致肝臟hepcidin高表達(dá),進(jìn)而下調(diào)FPN1表達(dá)、增加TfR1和DMT1(+ire)介導(dǎo)的鐵攝取,造成肝臟鐵過載。這進(jìn)一步闡明了CIH引起肝臟鐵超載的具體機(jī)制,但仍需臨床相關(guān)研究加以驗(yàn)證。