circRNA_MYLK靶向miR-92a-3p調控急性B淋巴細胞白血病細胞增殖及凋亡

饒 琦, 王丹丹, 羅 婷

(四川大學華西醫院血液科, 四川 成都 610044)

急性淋巴細胞白血病是一種血液系統惡性腫瘤,其主要特征為骨髓造血干細胞或淋巴細胞分化異常且出現惡性增殖,臨床表現為貧血、感染等。化療是目前臨床治療急性淋巴細胞白血病的主要方式,但部分患者存在耐藥性從而降低治療效果,導致預后較差[1]。急性淋巴細胞白血病的發病機制尚未闡明,因而探究急性淋巴細胞白血病的致病機制有助于尋找該病的治療靶點。環狀RNA(circular RNA,circRNA)是由反向剪接形成的一種閉合環狀RNA分子,參與基因轉錄、轉錄后調控等過程,在急性淋巴細胞白血病中已發現異常表達的circRNA[2,3]。環狀RNA輕鏈激酶(circular RNA light chain kinase,circRNA_MYLK)是一種致癌circRNA,據報道,circRNA_MYLK在卵巢癌中表達量升高,可充當微小RNA-652(microRNA-652,miR-652)的海綿分子而促進卵巢癌細胞增殖[4]。但circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病中的功能和調控機制尚不明確。通過在線預測軟件顯示,circRNA_MYLK與微小RNA-92a-3p(microRNA-92a-3p,miR-92a-3p)存在靶向結合位點,研究表明,miR-92a在急性淋巴細胞白血病中表達下調[5]。因此,本研究旨在探討circRNA_MYLK對急性淋巴細胞白血病細胞增殖及凋亡的影響及其與miR-92a-3p的靶向調控關系,為進一步闡釋急性淋巴細胞白血病的發病機制奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1一般資料:選取2019年2月至2020年6月期間四川大學華西醫院收治的56例急性淋巴細胞白血病患者為研究組,患者均為B淋巴細胞型急性淋巴細胞白血病患者,其中,男36例,女20例,中位年齡10歲(6～14)歲。同時選取45例健康志愿者為對照組,其中,男25例,女20例,中位年齡11歲(7～16)歲。所有患者臨床資料完整且均經骨髓細胞形態學、免疫分型等診斷確診為急性淋巴細胞白血病。排除標準:接受急性淋巴細胞白血病治療患者;心臟、肝臟等重要臟器損傷患者;對藥物過敏患者;依從性較差者。人體組織樣本的收集和使用遵循《赫爾辛基宣言》,并獲得本院倫理研究會批準同意(批號:201901-15002)。

1.2試劑與儀器:人急性B淋巴細胞白血病細胞系(SUP-B15、NALM-6、BALL-1)均購自上海聯邁生物工程有限公司;DMEM培養液、胎牛血清購自南京森貝伽生物;淋巴細胞分離液購自廣州鼎國生物;TRIzol試劑、反轉錄試劑、qRT-PCR試劑均購自美國Thermo Fisher;circRNA_MYLK小分子干擾RNA(si-circRNA_MYLK,siRNA#1:5'-TACAGGTATGGCCTCACAAGT-3';siRNA#2:5'-ACTACAGGTATGGCCTCACAA-3')、miR-92a-3p寡核苷酸模擬物/抑制劑(miR-92a-3p mimics/anti-miR-92a-3p)及陰性對照(si-NC/miR-NC/anti-miR-NC)均購自廣州銳博生物;circRNA_MYLK過表達載體(pcDNA-circRNA_MYLK)及其對照空載體(pcDNA)均購自美國Invitrogen;CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶;兔抗人cleaved-caspase 8、兔抗人cleaved-PARP、兔抗人cleaved-caspase 3抗體與二抗均購自美國CST。cytation 5多功能酶標儀(美國Bio Tek公司);ABI Prism?7500型實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國Applied Biosystems公司);FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

1.3單個核細胞分離:取兩組研究對象的骨髓液樣本4mL,加入4mL淋巴細胞分離液,4℃,離心(999×g)20min,吸取離心管中的白霧狀層的單個核細胞轉移至另一無菌無酶的離心管內,然后加入2倍體積的PBS充分混勻4℃條件下經999×g轉速離心10min,棄上清后將細胞團置于-20℃保存。另外,將對照組研究對象的骨髓單個核細胞中分離得到淋巴細胞混合物,用流式細胞儀分選B淋巴細胞。

1.4實驗分組:培養SUP-B15細胞至對數生長期,將其濃度調整為2×104/mL,并接種于96孔板,每孔100μL。為干擾circRNA_MYLK的產生,用LipofectamineTM3000轉染試劑將circRNA_MYLK干擾序列siRNA#1和siRNA#2分別轉染至SUP-B15細胞以誘導細胞中circRNA_MYLK的改變。將SUP-B15細胞分為si-NC(轉染si-NC)、si-circRNA_MYLK(轉染circRNA_MYLK siRNA#2)、anti-miR-NC(轉染anti-miR-NC)、anti-miR-92a-3p(轉染anti-miR-92a-3p)、miR-NC(轉染miR-NC)、miR-92a-3p(轉染miR-92a-3p mimic)、si-circRNA_MYLK+anti-miR-NC(共轉染circRNA_MYLK siRNA#2和anti-miR-NC)和si-circRNA_MYLK+anti-miR-92a-3p(共轉染circRNA_MYLK siRNA#2和anti-miR-92a-3p)共8組。采用LipofectamineTM3000轉染試劑進行細胞轉染,轉染6h后更換DMEM完全培養液,并繼續培養48h。然后,收集細胞進行后續實驗。

1.5qRT-PCR檢測circRNA_MYLK、miR-92a-3p的表達水平:使用TRIzol試劑從兩組研究對象的單個核細胞、人急性淋巴細胞白血病細胞系(SUP-B15、NALM-6、BALL-1)和對照組研究對象的B淋巴細胞以及各組SUP-B15細胞中提取總RNA。以反轉錄合成的cDNA為模板進行qRT-PCR擴增反應。以GAPDH、U6為內參,應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測各孔Ct值并采用2-ΔΔCt法計算circRNA_MYLK、miR-92a-3p的相對表達量。circRNA_MYLK:上游引物:5'-CAGTGCATGCTGTTTGTTCA-3',下游引物:5'-TCGGAGCTTGACTTCCAG-3';GAPDH:上游引物:5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′,下游引物:5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′;U6:上游引物:5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物:5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3';miR-92a-3p:上游引物:5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3',下游引物:5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'。

1.6CCK-8實驗檢測細胞增殖:將各組SUP-B15細胞轉入96孔培養板(3000/孔),48h后每孔加入CCK-8溶液10μL孵育2h。采用酶標儀在450nm處測定各孔光密度值(OD值),并根據公式[存活率=OD值實驗組/OD值對照組×100%]計算細胞存活率。

1.7流式細胞儀檢測SUP-B15細胞周期:用胰蛋白酶消化各組SUP-B15細胞(2.5×105/mL)后經999×g轉速離心5min,加入預冷PBS洗滌細胞后再次加入PBS重懸細胞,加入70%乙醇3.5mL后置于4℃條件下孵育24h,相同條件下離心后棄上清,收集細胞沉淀后加入50μL RNaseA,于37℃水浴30min后加入450μL PI染色液染色30min(4℃),應用流式細胞儀檢測各孔細胞周期G0/G1期、S期、G2/M期所占比例。

1.8流式細胞術檢測SUP-B15細胞凋亡:轉染48h后收集2×105SUP-B15細胞,用預冷PBS沖洗。用200μL結合液重懸細胞后,加入5μL PI染色液和10μL Annexin V-FITC染色液,充分混勻,避光孵育15min,采用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。采用Flowjo V10軟件進行數據分析和圖形繪制。

1.9Western blot檢測cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白表達:用預冷PBS沖洗SUP-B15,用400μL RIPA裂解液在冰上裂解30min,離心后收集上清液,BCA法測定蛋白濃度。隨后,用SDS-PAGE分離各組蛋白20μg,將蛋白轉移到PVDF膜上。在室溫下封閉2h,將膜與cleaved-caspase 8(1∶1000)、cleaved-PARP(1∶1000)、cleaved-caspase 3(1∶1000)、GAPDH抗體(1∶2000)在4 ℃孵育過夜,然后用TBST洗滌3次(5min/次)。加入二抗(1∶5000)在室溫下孵育1h,然后用TBST洗滌3次(5min/次)。最后,均勻滴加ECL,將蛋白條帶顯現。以GAPDH作為內源性對照,采用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.10雙熒光素酶報告基因證實circRNA_MYLK與miR-92a-3p的靶向關系:starBase預測結果顯示,circRNA_MYLK和miR-92a-3p之間存在互相作用的核苷酸位點,將circRNA_MYLK與miR-92a-3p的互補序列與突變序列分別克隆至pmirGLO載體分別得到野生型載體WT-circRNA_MYLK、突變型載體MUT-circRNA_MYLK,用脂質體轉染法分別將WT-circRNA_MYLK、MUT-circRNA_MYLK與miR-92a-3p mimics、miR-NC共轉染SUP-B15細胞,培養24h后,檢測熒光素酶活性。用脂質體轉染法分別將pcDNA、pcDNA-circRNA_MYLK、si-NC、si-circRNA_MYLK轉染至SUP-B15細胞,于培養箱內培養24h后收集細胞并采用qRT-PCR實驗檢測miR-92a-3p表達。

2 結 果

2.1各組單個核細胞circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達比較:與對照組比較,研究組患者單個核細胞中circRNA_MYLK的表達量明顯升高(P<0.001),miR-92a-3p的表達量明顯降低(P<0.001),見表1。Pearson法分析急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達量的相關性,結果顯示,circRNA_MYLK與miR-92a-3p呈負相關(r=-0.9682,圖1a)。分離得到的兩組受試者脊髓中的單個核細胞及購買的SUP-B15細胞形態見圖1b。與正常B淋巴細胞比較,人急性淋巴細胞白血病細胞系SUP-B15、NALM-6和BALL-1細胞中circRNA_MYLK的表達量升高(P<0.001),miR-92a-3p的表達量明顯降低(P<0.001),見表2。其中SUP-B15細胞中circRNA_MYLK的表達量明顯高于NALM-6和BALL-1細胞,而miR-92a-3p的表達量明顯低于NALM-6和BALL-1細胞,故選擇SUP-B15細胞進行進一步實驗。

圖1 單個核細胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達量

表1 急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p的表達量

表2 circRNA_MYLK和miR-92a-3p在不同細胞中的表達

2.2干擾circRNA_MYLK表達效果:與對照組和si-NC組比較,siRNA#1組和siRNA#2組細胞中circRNA_MYLK的表達量降低(P<0.001),其中siRNA#2組circRNA_MYLK的表達量最低,見表3。因此選擇siRNA#2用于干擾circRNA_MYLK表達。

表3 干擾circRNA_MYLK表達效果

2.3干擾circRNA_MYLK表達對SUP-B15細胞增殖及細胞周期的影響:與si-NC組比較,si-circRNA_MYLK組細胞存活率、S期細胞比例下降,G0/G1期細胞比例升高(P<0.001),G2/M期細胞比例比較差異無統計學意義,見圖2,表4。

圖2 流式細胞術檢測細胞周期情況

表4 干擾circRNA_MYLK表達對SUP-B15細胞增殖及細胞周期的影響

2.4干擾circRNA_MYLK表達對SUP-B15細胞凋亡的影響:與si-NC組比較,si-circRNA_MYLK組細胞凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高(P<0.001),見圖3,表5。

圖3 干擾circRNA_MYLK表達對SUP-B15細胞凋亡的影響

表5 各組SUP-B15細胞凋亡的比較

2.5CircRNA_MYLK靶向miR-92a-3p:circRNA_MYLK與miR-92a-3p的結合位點如圖4A所示。miR-92a-3p顯著抑制WT-circRNA_MYLK報告基因的熒光素酶活性(P<0.001),但未顯著改變MUT-circRNA_MYLK報告基因的熒光素酶活性(圖4B)。pcDNA-circRNA_MYLK組與pcDNA組比較,miR-92a-3p表達下降(P<0.001);si-circRNA_MYLK組與si-NC組比較,miR-92a-3p表達增高(P<0.001),見圖4C。

圖4 circRNA_MYLK與miR-92a-3p靶向關系驗證

2.6MiR-92a-3p對SUP-B15細胞增殖、細胞周期、凋亡的影響:與anti-miR-NC組比較,anti-miR-92a-3p組細胞存活率、S期細胞比例增高,G0/G1期細胞比例降低(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平降低(P<0.001);與miR-NC組比較,miR-92a-3p組細胞存活率、S期細胞比例降低,G0/G1期細胞比例增高(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高(P<0.05),見圖5,表6。

圖5 miR-92a-3p對SUP-B15細胞凋亡的影響

表6 miR-92a-3p表達對SUP-B15細胞增殖細胞周期和凋亡的影響

2.7抑制miR-92a-3p表達逆轉干擾circRNA_MYLK表達對SUP-B15細胞增殖、細胞周期、凋亡的作用:與si-circRNA_MYLK+anti-miR-NC組比較,si-circRNA_MYLK+anti-miR-92a-3p組細胞存活率、S期細胞比例增高,G0/G1期細胞比例降低(P<0.001),凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平降低(P<0.001),見圖6,表7。

圖6 miR-92a-3p表達逆轉干擾對circRNA_MYLK表達的抑制對SUP-B15細胞凋亡的影響

表7 各組SUP-B15細胞增殖細胞周期和凋亡的比較

3 討 論

急性淋巴細胞白血病復發率較高且患者5年生存率較低,circRNA可通過調控miRNA表達調節急性淋巴細胞白血病細胞生物學過程,并被認為是治療急性淋巴細胞白血病的潛在靶點。作為一種促癌基因,circRNA_MYLK被報道可促進多種癌細胞的進展。例如circRNA_MYLK可通過miR-513a-5p/VEGFC信號傳導而促進腎細胞癌生長和轉移[6]。circRNA_MYLK通過充當miR-362-3p的海綿分子而促進肝細胞癌的進展。circRNA_MYLK通過調節miR-195/cyclin D1表達而促進喉鱗狀細胞癌的進展。circRNA_MYLK通過充當miR-195-5p的海綿分子而促進非小細胞肺癌細胞糖酵解和增殖[7]。但目前尚不清楚circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病中的表達情況和可能的作用機制。本研究結果顯示,circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中的表達量高于對照組,與circRNA_MYLK在癌細胞中的表達一致,提示,circRNA_MYLK高表達可能促進急性淋巴細胞白血病的發生及發展;干擾circRNA_MYLK表達可降低急性淋巴細胞白血病細胞存活率,G0/G1期細胞比例升高,S期細胞比例降低,提示,干擾circRNA_MYLK表達可通過誘導細胞周期阻滯而抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖。caspase 8級聯反應被激活后可促進cleaved-PARP、cleaved-caspase 3表達,誘導凋亡的發生[8,9]。本研究結果顯示,干擾circRNA_MYLK表達后急性淋巴細胞白血病細胞凋亡率和cleaved-caspase 8、cleaved-PARP、cleaved-caspase 3蛋白水平升高,提示,干擾circRNA_MYLK表達可促進急性淋巴細胞白血病細胞凋亡。以上研究結果首次表明circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病中起著癌癥促進作用。

MiRNA在多種生物過程中發揮重要的調節功能。miR-92a-3p在多種惡性腫瘤進展中的功能目前存在爭議。例如,miR-92a-3p可抑制維爾姆斯氏瘤細胞的侵襲性進展[10]。miR-92a-3p在子宮內膜癌中表達下調。然而,miR-92a-3p在胃癌組織中表達增加,并加速胃癌細胞的生長和轉移[11]。本研究發現,急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中miR-92a-3p的表達量降低,并抑制急性淋巴細胞白血病細胞增殖,促進細胞凋亡;表明miR-92a-3p在急性淋巴細胞白血病中發揮抑癌作用,可以作為潛在的治療靶點。本研究通過Pearson法分析急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中circRNA_MYLK與miR-92a-3p表達量的相關性,結果顯示,circRNA_MYLK與miR-92a-3p呈負相關,提示二者可能存在靶向關系。雙熒光素酶報告實驗和qRT-PCR分析證實circRNA_MYLK可靶向負調控miR-92a-3p的表達。為了進一步驗證circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病中的作用機制,本研究在干擾circRNA_MYLK表達的同時下調miR-92a-3p表達,結果顯示,抑制miR-92a-3p表達能夠逆轉干擾circRNA_MYLK表達對急性淋巴細胞白血病細胞增殖及凋亡的作用。提示,circRNA_MYLK可能通過靶向miR-92a-3p促進急性淋巴細胞白血病的進展。

綜上所述,circRNA_MYLK在急性淋巴細胞白血病患者單個核細胞中的表達量升高,而miR-92a-3p的表達量降低,二者呈負相關且存在靶向調控作用,干擾circRNA_MYLK表達可通過靶向上調miR-92a-3p表達,促進急性淋巴細胞白血病細胞凋亡及抑制細胞增殖。本研究有望為急性淋巴細胞白血病患者提供新的治療靶點。但circRNA_MYLK序列上富含多個miRNA的結合位點,circRNA_MYLK是否可通過靶向調節其他miRNA表達而發揮作用尚需進一步探究。