液體活檢在原發性肝癌診療中的研究進展

胡靈溪,安薪宇(綜述),王榮琦(審校)

(河北醫科大學第三醫院中西醫結合肝病科,河北 石家莊 050051)

原發性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是我國第5位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因,該病起病隱匿,手術切除率低,復發和轉移率高,五年凈生存率僅為14.1%[1],發展敏感度、特異度高,精準、無創、簡便的肝癌早期篩查技術是臨床亟待解決的重大問題。液體活檢是指對實體腫瘤釋放到血液、尿液和唾液等體液中的腫瘤成分進行分析的技術,可實時監測機體腫瘤發生的分子改變,展現出患者癌癥惡性程度的完整分子圖譜,減少腫瘤播散的風險,未來可能成為替代性檢測手段。本文就當前液體活檢不同檢測物在診斷預后方面的應用價值及優缺點進行綜述,以期為原發性肝癌的診療提供幫助。

1 循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)

CTCs是指在原發性或轉移性腫瘤形成或發展過程中,因自發脫落或診療操作由腫瘤灶進入外周循環的腫瘤細胞,常被比作腫瘤的“種子”。

以往循環系統中的CTCs主要用來預測腫瘤的轉移,近年研究證實,早期癌癥患者外周血中同樣存在CTCs,因此CTCs也可用于早期診斷,尤其在診斷甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)陰性肝癌中有很高的準確性[2],與TNM分期、BCLC分期、血管侵犯、門靜脈癌栓、癌灶大小、癌灶數量、血清AFP水平顯著相關[3-4]。一項前瞻性研究發現,112例術前CTCs檢出率高的已接受癌灶切除術的肝癌患者中有101例(90.18%)呈CTCs陽性,12例乙型肝炎病毒(hepatitis B,HBV)患者中2例存在少量CTCs,在隨訪的5個月內均經CT/MRI檢測到小肝癌[5],說明對于肝癌高風險的患者,CTCs異常可能先于影像學改變,并可能成為在極早期檢測出肝癌的重要手段。Cui等[6]對CTCs在肝癌的診斷價值薈萃分析顯示,CTCs具有高度的特異度(95%),中等的敏感度(60%),具有出色的診斷價值(AUC=0.910)。CTCs除可用于肝癌早期診斷外,還可作為判斷預后的指標,用來評估治療效果[7],持續高CTCs負荷的患者在手術后顯示出腫瘤復發的傾向[8],治療前后CTCs數量的變化比單獨治療前的計數更能準確識別出肝癌復發與否,其在預測肝癌治療后復發的效能可能優于癌癥分期等傳統指標。

CTCs在外周循環系統中豐度低,近年來,分子檢測技術的飛速發展使得分離和檢測外周血樣本中的CTCs成為可能,CTCs具有完整的細胞形態和功能,能夠進行細胞培養和進一步的生物學分析,可為研究者提供原發腫瘤的病理特征以及完整的腫瘤學信息[9],另外,CTCs的深度測序可識別突變,其中一些突變與在原發腫瘤樣本中檢測到的突變不同,與肝組織活檢相比,CTCs可提供更全面的信息[10]。所以,CTCs是目前具有發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段,具有廣闊的應用前景。

2 循環游離DNA和循環腫瘤DNA(circulating free DNA and circulating tumor DNA,cfDNA and ctDNA)

cfDNA是指外周循環中存在于細胞外的部分降解的內源性DNA[11],大多數來源于骨髓和肝臟,也可來源于腫瘤細胞的釋放。cfDNA可代表腫瘤負荷并反映肝癌的遺傳特征,cfDNA水平越高,疾病越嚴重。ctDNA是指在腫瘤增殖過程中,凋亡或壞死的腫瘤細胞釋放或腫瘤細胞主動分泌的DNA片段,屬于cfDNA的一小部分,因其半衰期較短,可實時評估腫瘤狀態,使其成為早期診斷肝癌、評估治療效果并及時調整治療方案、監測腫瘤復發的理想選擇[12]。在肝癌患者中,cfDNA遺傳和表觀遺傳學改變與腫瘤的發生、發展及治療耐受有關,在肝癌各分期中都是可量化的,可通過深度測序檢測突變、拷貝數變異和甲基化特征等多種信息的變化,來區分是否發生癌變[11]。

2.1cfDNA突變 Nault等[12]通過全外顯子組測序對801例肝癌組織進行基因組分析發現,最常發生突變的基因依次是TERT(58.1%)、CTNNB1(30.7%)、TP53(18.7%)、ARID1A(13%)、白蛋白(11.4%)、APOB(9.4%)和AXIN1(9.2%)。單一的cfDNA突變作為肝癌的診斷標志物并不具有足夠高的敏感度,多個突變位點相結合可提高檢出效能,故cfDNA突變圖譜已被研發用于肝癌診斷及預后評價。Cai等[13]等通過綜合所有體細胞變異的動態變化將ctDNA突變譜圖進行整合,高度準確地評估患者的腫瘤負荷,平均比影像發現腫瘤早4.6個月,比AFP等血清學蛋白標志物具有更好的診斷效能,并可提前檢測出微小殘留病變,預測患者的無復發生存期和總生存期。現有更多研究表明,早期cfDNA入血豐度低,聯合蛋白標志物可提高其診斷效能。Qu等[14]提出了聯合蛋白標志物與cfDNA突變的肝癌篩查手段“HCC screen”,其在135例AFP或 US異常的HBsAg陽性患者中表現出85%的敏感度和93%的特異度,更為重要的是,331例AFP及US陰性患者中同樣表現出良好的診斷效能,敏感度和特異度高達100%和94%。Cohen等[15]將8種血清學標志物與16種cfDNA腫瘤相關基因相結合,建立的CancerSeek診斷模型已證明在早期肝癌的診斷中具有98%的敏感度和大于99%的特異度。除此之外,cfDNA突變可用于鑒定腫瘤基因圖譜以進行個體化治療。Ikeda等[16]通過ctDNA基因測序發現PTEN失活和MET激活的晚期肝癌患者行西羅莫司和卡博替尼治療預后更佳,ARID1A和BRCA2突變在卡培他濱治療的肝癌患者中隨全身治療明顯減少,并在疾病進展后患者出現TP53突變,因此,肝癌患者可根據突變基因制定治療方案,并通過連續分析ctDNA基因組圖譜監測患者的疾病進展并及時調整治療方案。

2.2cfDNA甲基化 cfDNA甲基化是基因表達的表觀遺傳學改變的核心機制,特定基因甲基化可反映相應腫瘤組織中DNA甲基化改變,因此基因的甲基化特征可用于識別cfDNA的組織來源[17]。局灶性高甲基化變化可導致腫瘤關鍵抑制基因失活,控制細胞周期和生長調節區域失調,降低對治療的反應。DNA甲基化的異常表觀遺傳改變通常發生在腫瘤形成或發展之前,可用于診斷早期腫瘤或識別高危人群。SEPT9是細胞分裂的關鍵調節劑,作為腫瘤抑制因子,廣泛存在于機體各個組織器官中[18]。一項法國研究分析98例肝癌患者和191例健康對照者中SEPT9的甲基化水平,發現SEPT9甲基化對肝癌的診斷準確率很高,AUC達0.940,但其對BCLCA期肝癌的敏感度僅為64%[19]。RASSF1A是癌癥進展的抑癌基因,在原發性肝癌中,RASSF1A通過啟動子高甲基化而失活,敏感度為66.7～100%。Wen等[20]檢測cfDNA中CpG島高甲基化的基因組(RGS10、ST8SIA6、RUNX2和VIM),發現該基因組在36例肝癌患者,17例肝硬化患者和38名健康對照者中的敏感度為94%,特異度為89%,并且5例AFP陰性的肝癌患者均被確診。在一項1 933例患者參與的大型研究中,Xu等[21]構建出BMPR1A等10個甲基化標志物的診斷預測模型,該模型在715例肝癌患者和560名健康對照者的訓練集中對肝癌的敏感度和特異度高達85.7%和94.3%,在383例肝癌患者和275例健康對照的驗證集中敏感度和特異度達83.3%和90.5%。另外,Xu等建立區分肝病和肝癌模型的綜合診斷評分“CD-SCORE”,有效地將肝癌患者與病毒性肝炎患者、脂肪肝患者以及健康對照者區分開來。由此可見,cfDNA甲基化可能是液體活檢中診斷早期肝癌更為有效的診斷標志物。

2.3cfDNA羥甲基 cfDNA羥甲基化是近年來備受關注的表觀遺傳學改變。5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)是通過11易位酶氧化5-甲基胞嘧啶而產生的啟動子。Cai等[22]開發并驗證了一種基于5-hmC的基因診斷模型“WD-SCORE”,該模型在2554例受試者中鑒別巴塞羅那肝癌分期0期和非肝癌患者(AUC=0.871)、癌灶直徑≤ 2.0 cm和非肝癌患者(AUC=0.851)、早期肝癌和具有HBV或肝硬化病史的高危人群(AUC=0.846)中均表現出優越的診斷效能,且明顯優于AFP。因此,5-hmC檢測技術作為一種非侵入性檢查手段,可以幫助HBV或肝硬化病史的高危人群及早發現肝癌。

M2P-HCC(methylation,mutation&protein,M2P)模型是一種基于cfDNA的液體活檢技術,通過檢測特異性靶基因甲基化、高發性體細胞點突變、相關性篩查蛋白三個層面的多維度指標,進行人工智能建模,建立肝癌早篩預測模型,如報告顯示陽性或預警,通過進一步影像檢查,可實現肝癌早發現、早診斷。一項基于1 615例乙型肝炎表面抗原陽性患者的多中心前瞻性研究數據顯示,M2P-HCC模型用于肝癌篩查的敏感度和特異度分別為88%、93%,明顯優于AFP聯合超聲檢查[1],對肝癌高危人群,特別是肝硬化患者可做肝癌篩查和監測的補充。目前該技術已應用于臨床。

3 外泌體(exosomes)

外泌體是正常細胞或腫瘤細胞釋放的直徑為50～150 nm的小膜狀囊泡,其內含有信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)、微小核糖核酸(microRNA、miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等多種核酸片段及蛋白質等,廣泛分布于血液、腹水、尿液和唾液等體液中[11]。

3.1miRNA miRNA是內源性非蛋白質編碼RNA家族的成員,大小為20～22個核苷酸。外泌體中miRNA-224、miRNA-93、miRNA-92b、miR-106a等在肝細胞癌患者中表達上調,miRNA-125b、miRNA-638、miRNA-122等表達下調,特定miRNA的差異表達可作為腫瘤潛在的標志物,用于腫瘤早期診斷。Cho等[23]研究發現,肝癌患者特別是癌灶直徑≤ 2.0 cm的患者,血清miR-10b-5p表達顯著上調,但HBV或肝硬化患者血清中未發現其表達增加,表明miR-10b-5p表達水平可用于區分早期肝癌與肝癌高風險患者,這可能是由于大部分miR-10b-5p來自肝癌細胞,其表達受肝臟炎癥和纖維化的影響小。Wang等[24]研究發現早期和晚期肝癌患者的miR-122、miR-148、miR-1246表達水平均顯著高于肝硬化和健康對照者(P<0.001),區分早期肝癌和肝硬化時,miR-148a明顯優于AFP(P<0.05),miR-122、miR-148a和AFP聯合診斷的敏感度和特異度分別達87.0%和90.0%。血清miRNA除可用于早期診斷外,還與腫瘤負荷、臨床預后密切相關。miR-125b是一種腫瘤抑制因子,可直接調節SMAD2/4、Sirtuin7、SUV39H1、LIN28B和PIGF,抑制肝癌的生長、遷移和侵襲,在Liu等[25]的隨機對照研究中,肝癌患者血清中miR-125b的表達降低,且與肝癌患者的癌灶數量、分化程度和TNM分期呈負相關,與水平較高的患者相比,miR-125b減少的患者復發時間(P<0.01)和總生存期(P<0.01)均縮短,可用于判斷患者預后。Nakano等[26]發現肝移植前miR-92b水平具有預測移植后肝癌復發的臨床價值,移植前AFP和miR-92b聯合檢測可進一步提高移植后患者肝癌復發的預測準確性(AUC=0.760)。外泌體可保護其內部miRNA免受降解,從而穩定存在于循環中,多研究表示,外泌體miRNA是比血清miRNA更有效的診斷生物學標志物[24],但外泌體的準確分離仍然存在一定的困難,限制了其在臨床中的廣泛應用。

3.2lncRNA lncRNA是長度>200個核苷酸的非蛋白質編碼轉錄物,是非編碼RNA中最廣泛的類別。有研究報道lncRNA在惡性膠質瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤等中呈異常表達,可能會成為新的腫瘤標志物,用于患者篩查診斷、治療療效和預后評估。Zeng等[27]薈萃分析發現,lncRNA診斷肝癌的敏感度、特異度可達85%、76%(AUC=0.880)。Xu等[28]利用血清外泌體中hnRNPH1 mRNA鑒別肝癌和HBV患者,其敏感度和特異度分別為85.2%和76.5%(AUC=0.670),與血清AFP聯合檢測診斷效能更高;另外,進一步研究發現,肝癌患者外泌體hnRNPH1 mRNA水平與Child-Pugh評分、門靜脈癌栓、淋巴結轉移、TNM分期和總生存期相關(P<0.05)。Wu 等[29]從155例接受肝移植治療的肝癌患者中收集血液和肝癌組織樣本,發現lncRNA HOTTIP 在肝癌組織中高表達,是肝移植后肝癌復發的獨立危險因素,并與總生存期縮短相關。由此可見,血清外泌體lncRNA水平在肝癌的早期診斷及預后評估中均具有重要的預測價值。

3.3蛋白質 Vesiclepedia數據庫顯示,外泌體中的蛋白質數量約為1 800個,根據外泌體中蛋白質的位置不同分為貨運蛋白和膜蛋白,在不同腫瘤發展過程中,外泌體中的貨運蛋白組成不同[30],He等[31]在肝癌細胞系衍生的外泌體中發現213種特有的蛋白質,Arbelaiz等[32]分析肝癌組和健康對照組中外泌體蛋白質的表達,發現肝癌患者外泌體中半乳糖凝集素3結合蛋白(galectin-3-binding protein,G3BP)和聚合免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,PIGR)顯著升高,這兩種蛋白對肝癌的早期診斷優于AFP,均是促進肝癌進展、腫瘤細胞轉化、侵襲和增殖的致癌蛋白,也被認為是HCC不良預后的生物標志物。鐵調素是人體鐵代謝的重要調節劑,鐵過量被認為是驅動肝癌發生發展的重要因素之一,肝癌患者血清外泌體鐵調素mRNA水平明顯高于健康人[33],可作為肝癌風險的診斷標志物。

另外,外泌體具有保護內部RNA及蛋白質、低免疫原性、可通過血管內皮組織等多種特性,故可用作藥物載體。Lou等[34]報道,轉染miR-122的間充質肝細胞可將miR-122包裹于分泌的外泌體,介導間充質肝細胞與肝癌細胞之間的miR-122通信,從而改變miR-122靶基因表達使肝癌細胞對化療藥物更敏感,顯著提高藥物的抗腫瘤效果。Tian等[35]將小鼠未成熟樹突狀細胞改造為外泌體膜蛋白,顯示出高效的靶向性和藥物呈遞功能,靜脈注射靶向外泌體可將藥物特異性遞送至腫瘤組織,從而抑制腫瘤生長而沒有明顯毒性。因此,外泌體有望成為肝癌靶向治療的藥物載體。

4 展望

液體活檢包含潛在腫瘤組織釋放的所有腫瘤成分,可獲取先于影像學改變的分子變化,并且不受特定穿刺活檢的限制,比AFP等血清學標志物更好地預測腫瘤發生或進展,可在肝癌早期診斷、療效監測、預后判斷、靶向藥物治療等臨床應用方面持續發揮巨大作用。因此,雖然液體活檢基因組具有不穩定性,檢測成本高,目前亦缺乏大規模的驗證性臨床研究,但隨著新技術的不斷研發,將加快肝癌分子診斷標志物的篩選和鑒定,為腫瘤的精準診療開辟新路徑。