菌種保藏管法和冷凍真空干燥保藏法對(duì)金黃色葡萄球菌抗力的影響

裴正勝，張寧，邢國(guó)慶，王淏

（1.南召縣人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 南召 474650；2.南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 南陽(yáng) 473000）

金黃色葡萄球菌作為一種重要病原菌，在生活、科研及醫(yī)學(xué)中都至關(guān)重要，而菌種的管理及保藏直接影響微生物資源的應(yīng)用［1］。科學(xué)、可行、優(yōu)質(zhì)的保藏方式可避免微生物在傳代、保藏過程中出現(xiàn)死亡、活力下降等情況影響進(jìn)一步研究［2］。目前對(duì)于金黃色葡萄球菌保藏方法有菌種保藏管法及冷凍真空干燥保藏法，兩種方法各有優(yōu)劣且應(yīng)用廣泛，但是對(duì)于兩種保藏方式對(duì)金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)及抗力影響有待進(jìn)一步探討。菌種保藏管法操作簡(jiǎn)便且利用商品化瓷珠進(jìn)行保藏，在實(shí)用性方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，冷凍真空干燥保藏法利用冷凍及真空干燥使微生物在缺氧、低溫條件下保持較低生命活動(dòng)能力以達(dá)到長(zhǎng)期保藏效果［3］。本研究就此進(jìn)一步探討二者對(duì)金黃色葡萄球菌抗力影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

全部金黃色葡萄球菌菌株（BNCC353548）均由北納生物-北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供且本研究采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。84 消毒液（中威合一（山東）醫(yī)療科技有限公司）為含氯消毒劑并采用實(shí)驗(yàn)室去離子水配置為100 mg/L 有效氯溶液。

1.2 方法

1.2.1 菌種保藏管法 由專業(yè)人員將金黃色葡萄球菌進(jìn)行培養(yǎng)純化，隨后將純化后的球菌沾染于滅菌瓷珠上且封裝于適配保藏管中，最后將保藏管置于-80℃冰箱進(jìn)行保藏，共保藏四支，保藏時(shí)間分別為0.5 年、1 年、2 年、3 年。

1.2.2 冷凍真空干燥保藏法 首先用2%鹽酸處理安瓿管，然后由專業(yè)人員將金黃色葡萄球菌活化并加入無菌脫脂牛奶制備混懸液，依據(jù)分裝、冷凍、干燥操作流程進(jìn)行操作，最后封管進(jìn)行保藏，共保藏四管，保藏時(shí)間分別為0.5 年、1 年、2 年、3 年。

1.2.3 試驗(yàn)菌懸液 將4 支菌種保藏管法保藏的瓷珠分別取出并加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行培養(yǎng)（37℃,24 h），然后采用接種環(huán)（15 μL）將球菌（一環(huán)）依次接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（需單個(gè)典型菌落）進(jìn)行培養(yǎng)（37℃,24 h），最后用磷酸鹽緩沖液沖洗新鮮斜面培養(yǎng)物并制備試驗(yàn)菌懸液（5×108cfu/mL）。4 管冷凍真空干燥保藏法保藏的凍干粉分別采用1 mL 磷酸緩沖液溶解后加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行培養(yǎng)（37℃,24 h），按上述方法制備5×108cfu/mL 試驗(yàn)菌懸液。

1.2.4 中和劑鑒定試驗(yàn) 設(shè)置7 個(gè)試驗(yàn)組并依據(jù)中和劑鑒定試驗(yàn)進(jìn)行操作，長(zhǎng)菌結(jié)果以1 組少于2 組，2 組少于3～5 組（誤差率低于10%）且6 組不長(zhǎng)菌為準(zhǔn)，最終重復(fù)三次結(jié)果一致說明中和劑適宜。

1.2.5 殺菌試驗(yàn) 將500 μL 小牛血清與500 μL 試驗(yàn)菌懸液在20℃水浴條件下進(jìn)行混合，然后加入5 mL 消毒液并振蕩混勻，待混合物反應(yīng)5 min 后用移液槍取500 μL 加入中和劑（5 mL）試管并振蕩混勻，充分反應(yīng)10 min 后取樣稀釋并依次接種于滅菌皿中進(jìn)行培養(yǎng)（37℃,48 h，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）。將試驗(yàn)重復(fù)5 次且均進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)與殺菌率計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷凍真空干燥保藏法殺菌試驗(yàn)結(jié)果

冷凍真空干燥保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌率依次為99.031%、99.038%、99.052%、99.060% 且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=0.659,P=0.703），見表1。

表1 冷凍真空干燥保藏法殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌種保藏管法殺菌試驗(yàn)結(jié)果

菌種保藏管法保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌率依次為99.075%、99.195%、99.489%、99.971% 且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=11.465,P=0.003），見表2。

表2 菌種保藏管法殺菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 兩種方法對(duì)存活率影響比較

保藏0.5 年時(shí)，兩種保藏方法對(duì)金黃色葡萄球菌存活率影響比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），保藏1 年、2 年、3 年后，冷凍真空干燥保藏法保藏的金黃色葡萄球菌存活率明顯高于菌種保藏管法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 兩種方法對(duì)存活率影響比較（,%）

表3 兩種方法對(duì)存活率影響比較（,%）

3 討論

金黃色葡萄球菌菌種保藏對(duì)于科研、食品、工廠生產(chǎn)等均有重要意義且優(yōu)質(zhì)的保藏方式可有效提高菌種存活率，有利于后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作［4］。保藏方法基本原則是利用各種方法使菌種生命活力降到最低從而長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存以備下次使用，其中延長(zhǎng)保藏時(shí)間有多種方式（無氧、無營(yíng)養(yǎng)、干燥、低溫等）［5］。其中冷凍真空干燥保藏法及菌種保藏管法是近些年對(duì)于菌種保藏使用率較高的方法，二者均應(yīng)用廣泛且短時(shí)間保藏效果明顯，但是仍未有研究分析二者對(duì)于金黃色葡萄球菌保藏的優(yōu)劣及對(duì)菌種抗力的影響，本次研究中采用84 消毒液對(duì)不同保藏時(shí)間、保藏方法下金黃色葡萄球菌的存活情況進(jìn)行分析，殺菌率越高表示金黃色葡萄球菌抗力越低［6］，具體研究結(jié)果及分析如下。

冷凍真空干燥保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌率依次為99.031%、99.038%、99.052%、99.060% 且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明冷凍真空干燥保藏法無論是短期還是長(zhǎng)期保藏金黃色葡萄球菌，對(duì)于球菌殺菌效果影響較小［7］。分析原因冷凍真空干燥保藏法同時(shí)綜合了冷凍、干燥、無氧多種保藏條件，協(xié)同發(fā)揮缺氧、低溫、低營(yíng)養(yǎng)三方面保藏作用［8］，將微生物的代謝及生命活力將至最低以延長(zhǎng)保藏時(shí)間［9］。冷凍真空干燥保藏法長(zhǎng)時(shí)間保藏后對(duì)于微生物內(nèi)部代謝機(jī)制、途徑、正常結(jié)構(gòu)的影響較小，對(duì)細(xì)胞膜通透性、蛋白質(zhì)合成機(jī)制、核酸復(fù)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制影響均較小，因此金黃色葡萄球菌“休眠”狀態(tài)結(jié)束后抗力改變較小。

菌種保藏管法保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液對(duì)金黃色葡萄球菌殺菌率依次為99.075%、99.195%、99.489%、99.971% 且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明菌種保藏管法保藏金黃色葡萄球菌，對(duì)球菌殺菌效果影響較大，其中三年保藏后消毒液殺菌率明顯升高，因此此法長(zhǎng)期保藏可導(dǎo)致球菌抗力下降。分析原因菌種保藏管法利用冷凍、瓷珠二者優(yōu)勢(shì)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行保藏，短期保藏對(duì)微生物代謝影響較小，但是長(zhǎng)時(shí)間保藏后瓷珠上的微孔對(duì)菌種的干燥及吸附作用有限，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，保藏效果呈下降趨勢(shì)［10］。菌種保藏管法保藏過程中有空氣存在，距離嚴(yán)格無氧條件較遠(yuǎn)，因此長(zhǎng)時(shí)間保藏后容易影響微生物代謝模式，改變蛋白合成情況，再次接種試驗(yàn)后對(duì)消毒液抵抗力下降，因此3 年保藏的殺菌率較高。

保藏0.5 年時(shí)，兩種保藏方法對(duì)金黃色葡萄球菌存活率影響比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），保藏1 年、2 年、3 年后，冷凍真空干燥保藏法保藏的金黃色葡萄球菌存活率明顯高于菌種保藏管法（P＜0.05）。說明0.5 年保藏時(shí)，兩組方法對(duì)金黃色葡萄球菌存活情況影響較小，而長(zhǎng)期保藏后冷凍真空干燥保藏法金黃色葡萄球菌存活情況更好。分析原因相比于菌種保藏管法（吸附、低溫），冷凍真空干燥保藏法在保藏方式（低溫、真空、低營(yíng)養(yǎng)）上更具有優(yōu)勢(shì)，保藏過程中將金黃色葡萄球菌活力降至更低狀態(tài)且對(duì)微生物復(fù)蘇后正常代謝影響較小，因此試驗(yàn)過程中平均菌落存活情況更好。本研究結(jié)果與王凱［11］對(duì)冷凍干燥法研究結(jié)果一致，冷凍干燥法保藏金黃色葡萄球菌效果較好且對(duì)菌株生化結(jié)構(gòu)影響較小。

綜上所述，相比于菌種保藏管法，利用冷凍真空干燥保藏法長(zhǎng)時(shí)間保存的金黃色葡萄球菌對(duì)消毒液的抗力影響更小且存活率更高。菌種保藏管法操作簡(jiǎn)便，冷凍真空干燥保藏法操作復(fù)雜，但是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。實(shí)驗(yàn)室保藏金黃色葡萄球菌應(yīng)根據(jù)具體條件進(jìn)行選擇。