宮頸癌患者血清miRNA-34a表達水平研究

鐘銀雪，劉宓，陳海星，陳學書，李覓

（貴州醫科大學附屬腫瘤醫院 醫學檢驗科，貴州 貴陽 550004）

宮頸癌是世界上第二常見的婦科腫瘤。在發展中國家，宮頸癌的發病率遠高于發達國家，病例數占世界宮頸癌總數的80%［1］。近年來，隨著我國社會經濟的發展、人們性觀念、生活習慣的改變，發現宮頸癌發病年齡呈現年輕化趨勢，發病率逐年上升［2］。高危型人類乳頭狀瘤病毒（highrisk human papillomavirus,HR-HPV）持續感染是宮頸癌的主要病因。其中HPV E6，E7 致癌蛋白在宮頸癌發生發展中發揮重要作用。宮頸癌時，HPV 病毒感染人體，HPV 基因組整合到宿主細胞，誘導HPV-E6 蛋白表達。E6 蛋白靶向結合P53 基因，通過泛素蛋白酶途徑降解P53，導致P53 有效性降低，P53 失活導致可與miR-34a 結合位點的啟動區域的蛋白數量的減少，從而下調大多數被HPV 感染的組織中miR-34a 的表達。進而調節細胞凋亡、使G1 期阻滯、DNA 修復和凋亡的蛋白失活，導致細胞增殖，促進腫瘤的發生［3］。

miR-34 家族（miR-34s）是一組高度保守的miRNA 家族，廣泛存在于節肢動物、線蟲綱動物及哺乳動物中。人源miR-34 家族包括miR-34a、miR-34b、miR-3c［4］。其中miR-34a 是miRNA 家族中一類高度保守的非編碼RNA，也是一種抑癌基因，它可通過靶定多種周期及凋亡相關蛋白mRNA 的3＇UTR 區而在轉錄后水平上對基因的表達進行負調控，使這些蛋白的mRNA 降解，細胞周期不向S 期轉換，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤的發生。反之如果miR-34a 表達降低，將會導致細胞增殖失控，凋亡抑制，最終形成腫瘤［5］。WANG 等［6］研究發現，HPV 能通過E6 癌基因直接和間接地影響miR-34a 使其表達下調。相反沉默宮頸癌細胞系E6 后，p53 和miR-34a 表達增多。有研究報道，miR-34a 表達從宮頸上皮內瘤變到宮頸癌逐漸下調，低的miR-34a 水平可能與病毒的整合、E6 蛋白的表達及P53 缺失有關［7］。

很多研究表明miR-34a 不僅在宮頸癌中表達異常，在多種癌癥包括肺癌及結直腸癌中也有異常表達。趙艷爭［8］發現，miR-34a 在肺癌患者血清中的表達水平明顯上調；OKADA 等［9］發現miR-34a 可抑制抑癌基因p53 負調節因子HDM4 表達，進而作用于p53 和miR-34a 形成的正反饋環，抑制肺癌進展。雒亞蒙等［10］發現結腸癌患者的血清miR-34a 基因表達水平較結腸腺瘤性息肉組和健康對照組顯著降低。趙春娟等［11］發現前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表達水平較前列腺增生組和健康對照組顯著降低。從上述研究中可以發現，miR-34a 在不同腫瘤中表達趨勢并不相同，在同一腫瘤不同疾病期，表達水平也存在差異。因此，這提示miR-34a 在各腫瘤中的致病機制可能并不相同。

本研究組之前通過分析HPV 感染宮頸癌患者宮頸細胞miR-34a 表達水平發現，HPV 陽性宮頸癌患者miR-34a 表達水平較宮頸炎和健康人群明顯升高，提示miR-34a 可能做為觀察宮頸癌發生發展的指標［12］。相較于宮頸細胞樣本，血清樣本更易獲得，但血清miR-34a 來源于全身各組織和器官，宮頸癌時其表達水平是否與宮頸細胞一致，值得探討；不同腫瘤時，血清miR-34a 水平變化趨勢是否一致，也值得研究。

因此，研究擬通過檢測貴州醫科大學附屬腫瘤醫院宮頸癌患者血清miR-34a 的水平，探討血清miR-34a 水平在宮頸癌中的可能變化；并與肺癌、結直腸癌以及健康人群血清miR-34a 水平進行比較，分析各組血清miR-34a 表達水平的變化趨勢，探討血清miR-34a 可能具有的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2020 年10 月至2021 年3 月在貴州醫科大學附屬腫瘤醫院收治的宮頸癌患者20 例（年齡23～67 歲），并納入同期健康體檢人群20 例（年齡21～77 歲）作為健康對照組，另納入確診的肺癌（年齡48～83 歲）和結直腸癌（31～80 歲）患者各20 例作為疾病對照。宮頸癌患者、肺癌患者、結直腸癌患者均依據臨床病理結果進行診斷，所有納入研究的患者入院前均未接受任何治療。本研究通過了貴州醫科大學附屬腫瘤醫院倫理委員會審查（倫理審批號：SL-20205088）。

1.2 實驗試劑與儀器

TAKARA RNAiso for Small RNA、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和 SYBR Green qRT-PCR試劑（日本寶生生物技術有限公司）。miR-34a 特異性引物（易錦生物有限公司）、異丙醇、75%乙醇、RNase-free 水等。ABI7500 實時熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）、BIOER Life Express 基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）、離心機。

1.3 miR-34a 的檢測方法

血清總RNA 提取：采用促凝真空采血管采集4 組人員靜脈血5 mL 3 000 rpm 離心10 min，吸取血清于無RNA 酶的EP 管中，標記好患者姓名，保存于-20℃冰箱備用。取500 μL 的血清加入1 000 μL 的RNAiso for Small RNA 后混勻室溫靜置5 min，12 000 g 4℃離心5 min，將600 μL 上清液移到新的1.5 mL tube 管中，加入200 μL 氯仿震蕩混勻靜置5 min，12 000 g 4℃離心15 min，將250 μL 上清液轉移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇靜置10 min 12 000 g 4℃離心10 min，棄上清，向沉淀中加入1 mL 的75% 乙醇12 000 g 4℃離心5 min，棄上清保留，沉淀室溫干燥后加入20 μL 去離子水（ddH2O）。

逆轉錄PCR：采用TAKARA Mir-XTMmiRNA First-Strand 試劑將所提總RNA 逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應體系：mRNA Buffer（2X）5 μL，RNA sample（0.25～8 μg）3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL，反應總體積10 μL。反應條件：37℃ 1 h，85℃ 5 min。

定量PCR：qRT-PCR 反應體系：miR-34a 樣本組：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，miRNA-specific primer（10 μmol/L）0.5 μL，mRQ 3'Primer 0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反應總體積為25 μL。U6 對照組：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，U6 Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，U6 Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL。反應條件：95℃ 10 s、qRT-PCR 95℃ 5 s、60℃ 20 s 重復40 個循環，95℃ 60 s、55℃ 30 s、95℃ 30 s 重復。采用實時熒光定量PCR SYBR GreenⅠ法檢測miR-34a，以U-6 為內參基因，反應結束后軟件自動生成熒光定量值動態曲線，并分析顯示結果及循環閾值（Ct）。

1.4 分析方法

2-ΔΔCt法分析基因相對表達量，其反映的是實驗組基因與對照組的倍數關系，使用U6 作為內參基因。2-ΔΔCt=2-［（實驗組目標基因循環數-實驗組內參基因循環數）-（對照組目標基因循環數-對照組內參基因循環數）］。

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計分析，采用GraphPad Prism 6 繪制圖表。Kolmogorov-Smirnova檢驗進行正態性分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗，非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距M（P25,P75）表示，組間兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組基本情況統計分析

宮頸癌患者、肺癌患者、結直腸癌患者及健康對照組年齡比較差異無統計學意義（χ2=41.175,P=0.254），見表1。

表1 研究對象的基本情況（n=20）

2.2 各組血清miR-34a 表達水平

經統計學分析發現，與健康對照組相比，宮頸癌組miR-34a 表達上調，差異有統計學意義（40.2 倍，Z=-2.948,P=0.003）；肺癌組miR-34a 表達上升（Z=-1.921,P=0.055），結直腸癌組表達下降，但差異均無統計學意義（Z=-0.407,P=0.684）。進一步比較發現，與結直腸癌組和肺部組相比，宮頸癌組miR-34a 表達明顯升高，差異有統計學意義（25.4 倍，P=0.005；93.4 倍，P＜0.001）。見圖1、圖2、表2。

圖1 癌癥組與健康對照組血清miR-34a 表達水平比較

圖2 癌癥組間血清miR-34a 表達水平比較

表2 各組血清miR-34a 表達水平比較

3 討論

做為miR-34 家族中的一員，miR-34a 在細胞凋亡、細胞增殖、細胞分化及細胞代謝等方面發揮著重要作用。它是抑癌基因p53 的直接作用因子，激活p53 后miR-34a 表達明顯上升，進而起到抑制腫瘤的作用［13］。有研究顯示，宮頸癌E6 異常表達會抑制p53 表達，進而抑制miR-34a 的表達，促進腫瘤發生發展［14］。多項研究均證實宮頸癌組織及癌細胞中miR-34a 表達降低［15］，但本課題組在之前的工作中，得到了與上述研究相反的結果［12］：課題組通過收集HPV 陽性宮頸癌患者的宮頸細胞樣本，采用qRT-PCR 檢測了4 種與E6/E7 相關的miRNA（miR-9、miR-21、miR-27b、miR-34a），發現miR-34a 表達與正常對照組和宮頸上皮內瘤樣變（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）組相比均明顯升高（2.987 倍,P=0.002；2.930 倍,0.010）（見圖3）。該研究結果提示，miR-34a 在宮頸癌的發生發展中可能通過多種機制發揮作用。目前關于miRNA-34a 在宮頸癌發生早期中的具體機制尚不完全清楚，而其在宮頸癌及癌前病變中的表達爭議也增加了研究的必要性，為完善其相關機制提供了可能性［16］。

圖3 宮頸脫落細胞miR-34a 在宮頸癌和CIN 時的表達

本研究通過收集宮頸癌患者血清，檢測其miR-34a 的表達水平發現，與健康人群相比，宮頸癌患者miR-34a 表達明顯升高（40.2 倍,P=0.003），與本課題組之前的研究結論相符，但與大部分研究結論相反。聶小鳳等［3］研究表明，宮頸脫落細胞中，miR-34a 在宮頸癌和高級別宮頸上皮內病變中的表達水平顯著低于它們在正常宮頸及低級別宮頸上皮內病變中的表達，且miRNA 34a 值隨著宮頸病變加重逐漸降低。舒慧敏等［17］研究也表明，miR-34a 在宮頸癌組織中表達降低，且在CIN組織表達也明顯降低，并指出miR-34a 表達下降發生在CIN 早期，甚至是在宮頸組織發生形態學改變之前。盡管大多數研究表明miR-34a 在宮頸癌中表達下調，但RIBEIRO 等［18］的研究與本研究相同，他們通過檢測患者的宮頸細胞顯示，miR-34a 的表達水平與未感染人群相比呈現明顯增高，考慮可能因為病毒感染使得細胞修復機制被激活，導致P53 通路激活進而誘導miR-34a 的表達。與舒慧敏等一樣，有研究人員認為，miR-34a表達受抑，是宮頸癌發展過程中的一個早期事件。隨著疾病發展，一些其它通路可能被激活，參與到疾病的發生發展中導致miR-34a 表達水平的升高［7］。本次研究結果也再次提示，miR-34a 可能通過多種機制在宮頸癌的發生發展中發揮作用。

多項研究顯示，除了宮頸癌以外，miR-34a 還在多腫瘤中表達異常，且不同腫瘤miR-34a 的變化趨勢并不一致，大多數腫瘤表達下降包括前列腺癌，結直腸癌，乳腺癌等，而肺癌時多研究顯示表達上升。卞俊杰等［19］研究表明，與健康對照組相比，非小細胞肺癌患者血清miR-34a 表達升高，并指出miR-34a 的含量與非小細胞肺癌患者的腫瘤負荷強度有關。雒亞蒙等［10］研究表明結腸癌患者的血清miR-34a 基因表達水平較結腸腺瘤性息肉組和健康對照組顯著降低。趙春娟等［11］用實時熒光定量PCR 技術檢測血清中miR-34a 的基因表達水平前列腺癌，發現前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表達水平較前列腺增生組和健康對照組顯著降低IORIO 等［20］研究表明miR-34a 在乳腺癌的表達明顯低于正常乳腺組織。為了解宮頸癌患者miR-34a 的表達與其它腫瘤是否存在差異，本研究選擇了中國人群發病率最高的肺癌和發病率第三的結直腸癌做為疾病對照組進行了研究［21］。研究顯示：與肺癌和結直腸癌患者相比，宮頸癌患者血清miR-34a 表達明顯升高（84.8 倍，P=0.005；25.4 倍，P＜0.001）。這提示，血清miR-34a 可能做為一個宮頸癌診斷的生物標志，值得進一步研究。本次研究也發現，與健康人群相比，肺癌患者血miR-34a 表達上升，結直腸癌患者血清miR-34a 表達下降，與其它研究的miR-34a 表達變化趨勢一致，但差異均不具有統計學意義。這可能與本次研究的標本量較小有關，未來需要增加樣本量進行驗證。通過分析肺癌及結直腸癌以及宮頸癌患者血清miR-34a 的表達水平也可發現，不同腫瘤其表達變化趨勢并不相同，這進一步證實miR-34a 在腫瘤發生發展過程中發揮著非常復雜的作用，可能存在多個靶點。腫瘤不同，病程不同，其激活機制亦不相同。

綜上所述，相較與健康人群以及肺癌和結直腸癌患者，宮頸癌患者血清miR-34a 表達明顯升高，提示miR-34a 可能做為宮頸癌診斷的生物學指標志來進行深入研究；血清miR-34a 的表達水平和肺癌變化趨勢一致，與結直腸癌相反，提示miR-34a 在不同腫瘤中可能通過不同的機制發揮作用，值得進一步探討。本次研究樣本量較小，可能會對結果產生影響，未來將通過大樣本量研究，對本次結果進行驗證。