馬鈴薯絲氨酸羧肽酶類蛋白StSCPL家族的鑒定及干旱脅迫響應分析

晉 昕,魏玉溪,陳正亮,王澤民,張國棟,楊江偉,張 寧,司懷軍

(1.省部共建干旱生境作物學國家重點實驗室, 甘肅 蘭州 730070; 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院, 甘肅 蘭州 730070;3.忻州師范學院生物系, 山西 忻州 034099)

氣候的異常變化導致各種生物和非生物脅迫頻發(fā),嚴重影響作物正常的生產(chǎn)種植。馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是世界上產(chǎn)量最高的非谷物糧食作物,同時也是淺根系作物,干旱等非生物脅迫不僅嚴重抑制其植株的正常生長發(fā)育,也是導致其塊莖產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降的主因[1-2]。因此,深入挖掘抗旱分子元件,研究馬鈴薯耐旱的分子機理,對未來培育抗性新品種意義重大。為了應對各種非生物脅迫,植物體內(nèi)形成了多水平且復雜的脅迫響應與耐受機制,主要是一系列生化和生理適應,依賴于脅迫相關(guān)基因的調(diào)控表達[3]。絲氨酸羧肽酶類(Serine carboxypeptidase like,SCPL)蛋白屬于SC羧肽酶中的S10家族[4-6],其在結(jié)構(gòu)和功能上與絲氨酸羧肽酶(Serine carboxypeptidase,SCP)基本相似,由催化中心和α/β水解酶三級結(jié)構(gòu)組成,均含有1個細胞內(nèi)分泌和轉(zhuǎn)運的信號肽、4個底物結(jié)合位點、多個N-糖基化位點以及與催化作用相關(guān)的進化保守區(qū)域[6-7]。

SCPL基因家族在生物和非生物脅迫響應過程中表現(xiàn)活躍,在不少作物上得到證實。番茄(SolanumlycopersicumL.)中,I型SCPL基因在機械損傷和茉莉酸甲酯(MeJA)誘導下顯著上調(diào)表達,因此被鑒定為“晚期創(chuàng)傷誘導基因”之一[8];水稻(OryzasativaL.)中,過表達OsBISCPL1的轉(zhuǎn)基因水稻植株對丁香假單胞菌的抵抗力顯著強于野生型水稻植株,且轉(zhuǎn)基因植株中OsPR1、OsPR2、OsPR5和OsPDF1.2等防御相關(guān)的基因均呈組成型上調(diào)表達。此外,過表達OsBISCPL1的植株對氧化應激的耐受性顯著增強,氧化應激相關(guān)基因表達量也顯著上升[9]。高感白粉病的黃瓜(CucumissativusL.)品種D8接種白粉病菌后,7個CsaSCPLs的表達水平顯著上升,1個(CsaSCPL1)呈明顯下調(diào)表達;在鹽脅迫處理下,黃瓜葉片中CsaSCPL2、CsaSCPL11和CsaSCPL19顯著上調(diào)表達,CsaSCPL1的表達量顯著下降;而黃瓜根中僅CsaSCPL11的表達量增加,CsaSCPL2、CsaSCPL16和CsaSCPL18均顯著下調(diào)表達[4]。小麥(TriticumaestivumL.)中,TaSCPL184-6D在干旱、鹽和ABA處理下均顯著上調(diào)表達,且其過表達系干旱處理后的存活率和脯氨酸(Pro)含量均顯著高于野生型,而丙二醛(MDA)含量顯著低于野生型;對TaSCPL184-6D過表達系進行鹽處理(150 mM NaCl)后發(fā)現(xiàn),所有轉(zhuǎn)基因株系的根長和鮮質(zhì)量均顯著優(yōu)于野生型[10]。在干旱、鹽堿、光照、缺氮、缺磷、極端溫度等多種非生物脅迫下,植物中花青素也常被誘導產(chǎn)生[11-14],同時原花青素也參與多種非生物脅迫響應[13]。研究顯示,在擬南芥中SCPL基因AT2G23000編碼一個花青素酰基轉(zhuǎn)移酶,該酶是合成酰化花青素的關(guān)鍵酶[15]。而SCPL18和SCPL18異構(gòu)體X3均參與了鐵皮石斛花青素的生物合成[16],可能在非生物脅迫中發(fā)揮作用。

SCPL基因在植物非生物脅迫響應中的重要作用已有報道,但其在馬鈴薯中的具體功能研究尚不多見。基于此,本研究通過全面描述馬鈴薯全基因組中SCPL基因家族的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、染色體位置和系統(tǒng)發(fā)育等,研究StSCPLs基因在激素處理、不同脅迫條件下的表達差異,同時通過高通量測序?qū)Ω珊的褪苄秃透珊得舾行婉R鈴薯品種中StSCPLs的表達差異進行分析。此外,初步構(gòu)建了lncRNA與StSCPLs互作調(diào)控網(wǎng)絡,以期為進一步分析馬鈴薯StSCPLs在干旱脅迫響應中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試驗處理

供試馬鈴薯品種為‘隴薯10號’(L,干旱耐受型)和‘大西洋’(D,干旱敏感型)[17]。篩選大小一致的馬鈴薯種薯(重量約150 g)種植在花盆中,置于溫室培養(yǎng),溫度(25±2)℃,自然光照射。待其發(fā)芽后,每周用完全營養(yǎng)液給植株澆水和施肥1次。植株生長至25 d時,選擇生長狀態(tài)整齊一致的植株進行干旱處理(每天16∶00對照組正常澆水,干旱處理組澆15%的PEG-6000水溶液),處理5 d后收集馬鈴薯植株頂部的第3～5片葉用于轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq),試驗設3個重復,每個重復10株。

選取生長狀態(tài)一致的‘大西洋’盆栽植株,進行干旱脅迫處理。其中對照組(CK)土壤含水量保持在75%～80%,干旱脅迫組為WS1、WS2和WS3共3組,其土壤含水量分別保持在55%～60%、35%～40%和15%～20%。每天2次(10∶00和16∶00)使用TDR-300傳感器(Spectrum R, Aurora, Illinois, USA)監(jiān)測土壤含水量。處理完成后收集馬鈴薯植株頂部的第3～5片葉,置于液氮中速凍,保存于-80℃,后續(xù)用于實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試驗,每個處理均包含3次生物學重復。

1.2 試驗設計

1.2.1 基因家族鑒定及進化分析 馬鈴薯基因組相關(guān)數(shù)據(jù)從馬鈴薯數(shù)據(jù)庫PGSC(http://spuddb.uga.edu/)下載,并構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫。在NCBI中下載已注冊的擬南芥SCPL轉(zhuǎn)錄因子序列,結(jié)合Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(http://xfam.rog/)中的隱馬爾科夫模型(HMM,e-value<0.01;PF00450),利用BLAST(e-value<1×10-5)比對鑒定,在全基因組水平鑒定篩選馬鈴薯SCPL家族初步比對的候選成員。在NCBI-CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb)進行結(jié)構(gòu)域比對分析,最終確定馬鈴薯SCPL家族成員。

1.2.2 基因結(jié)構(gòu)和氨基酸保守結(jié)構(gòu)分析 參照Wang等[18]方法分析馬鈴薯StSCPLs基因結(jié)構(gòu)。利用MEGA 7.0軟件中的Align by muscle程序?qū)︸R鈴薯與擬南芥SCPL家族成員的蛋白序列進行多序列比對,并采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap參數(shù)設置為1 000。

1.2.3 家族成員在染色體上的位置分析 參照Wang等[18]方法,同時運用TBtools(v1.0986)軟件繪制馬鈴薯SCPL基因在染色體上的分布圖,并對其進行共線性分析。

1.2.4 家族成員啟動子區(qū)順式作用元件分析 從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(http://solanaceae.plantbiology.msu. edu/pgsc)中獲取馬鈴薯StSCPLs基因啟動子區(qū)序列信息。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare)搜索轉(zhuǎn)錄起始位點(ATG)上游1.0 kb區(qū)域,以分析順式作用調(diào)控元件。

1.2.5 馬鈴薯SCPL家族表達分析 利用數(shù)據(jù)庫PGSC(http://spuddb.uga.edu/)中馬鈴薯基因在不同組織及生長時期的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)數(shù)據(jù),對馬鈴薯StSCPLs在不同組織及生長時期進行表達分析。利用數(shù)據(jù)庫PGSC(http://spuddb.uga.edu/)中馬鈴薯基因在不同脅迫條件下的RNA-Seq數(shù)據(jù),分析StSCPLs在非生物脅迫、生物脅迫及激素處理下的表達模式。

利用轉(zhuǎn)錄組測序分析干旱脅迫下馬鈴薯StSCPLs在2個不同抗旱性品種中的表達差異。測序及數(shù)據(jù)處理如下:以馬鈴薯mRNA為模板,用6堿基隨機引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,并以其為模板進行第二鏈cDNA的合成。完成文庫構(gòu)建后,采用PCR擴增進行文庫片段富集,使文庫大小為450 bp。然后,通過Agilent 2100 bioanalyzer對文庫進行質(zhì)檢。根據(jù)文庫有效濃度以及文庫所需數(shù)據(jù)量,將含有不同Index序列的文庫按比例進行混合。混合文庫統(tǒng)一稀釋到2 nM,通過堿變性獲得單鏈文庫。樣品經(jīng)過RNA抽提、純化、建庫之后,采用第二代測序技術(shù)(Next-generation sequencing,NGS),基于Illumina HiSeq測序平臺,對文庫進行雙末端(Paired-end,PE)測序(南京派森諾基因科技有限公司)。樣品經(jīng)過上機測序,生成FASTQ的原始數(shù)據(jù)(Raw data)。對每個樣品的下機數(shù)據(jù)(Raw data)分別進行統(tǒng)計,包括樣品名、模糊堿基所占百分比、以及Q20(堿基識別準確率在99%以上的堿基所占百分比)和Q30(堿基識別準確率在99.9%以上的堿基所占百分比)。數(shù)據(jù)過濾:(1)采用Cutadapt去除3′端帶接頭的序列;(2)去除平均質(zhì)量分數(shù)低于Q20的Reads。使用TopHat2的升級版HISAT2軟件(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)將過濾后的Reads比對到馬鈴薯參考基因組(DM_1-3_516_R44_potato_genome_assembly.v6.1.fa),計算相關(guān)基因表達量。

為進一步分析干旱脅迫下馬鈴薯StSCPLs表達模式,采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR KIT(艾科瑞,中國長沙),使用Light Cycler 96熒光定量PCR儀(羅氏,瑞士)進行qRT-PCR。反應總體積20 μL,其中10 μL 2×SYBRGreen Pro Taq HS Premix,0.8 μL引物(正向和反向引物各0.4 μL),1 μL cDNA(100 ng)模板及8.2 μL ddH2O。反應程序如下:95℃,30 s,隨后95℃,5 s和60℃,30 s,共40個循環(huán),內(nèi)參基因為StEF1α(GenBank ID: AB061263.1)。試驗設3個生物學重復和3個技術(shù)重復,并用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量,內(nèi)參基因為StEFla[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StSCPL家族的鑒定及進化分析

通過HMM(e-value<0.01)掃描、BLAST(e-value<1×10-5)比對和CDD搜索相結(jié)合的方法,在馬鈴薯中共鑒定出41個StSCPL成員。所有StSCPLs的登錄號均可在GenBank中獲得(表1)。馬鈴薯StSCPLs的41個基因存在長度差異,從1 053 bp(StSCPL9)到2 760 bp(StSCPL13)不等,編碼蛋白長度為350～919 aa(表1)。為進一步研究馬鈴薯SCPL的進化關(guān)系,利用擬南芥(54個)和馬鈴薯(41個)SCPL家族成員構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹(圖1,見14頁)。結(jié)果顯示,41個StSCPL分別屬于Group I～III 3個亞族。其中,I組成員最多(17個),II組為13個成員,III組最少(11個),與其他物種中SCPL的研究結(jié)果相似[10, 19-21]。

2.2 馬鈴薯StSCPLs基因結(jié)構(gòu)、染色體及古多倍化

外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)在基因家族的進化中起著至關(guān)重要的作用[4]。利用GSDS(Gene structure display server 2.0)分析獲得41個StSCPL基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,外顯子數(shù)目最少和最多的StSCPL基因均在Group I中,StSCPL24和StSCPL36均只含有1個外顯子,StSCPL29的外顯子數(shù)目最多(27個),其余StSCPL基因均包含多個外顯子(圖2A)。不含UTR區(qū)的馬鈴薯SCPL基因共發(fā)現(xiàn)9個,分別是StSCPL5～7、StSCPL10～13、StSCPL23、StSCPL29;除StSCPL29屬于Group I,其余均屬于Group III。41個StSCPL基因分布在除8號染色體外的11條染色體上(圖3,表1),集中分布在1～6號染色體上,其中1號和6號染色體上的StSCPL基因較多,分別為13個和8個。在3號、5號、9號和12號染色體上各分布有1個StSCPL基因。StSCPLs基因的古多倍化分析結(jié)果顯示,2個StSCPL基因(StSCPL40和StSCPL28)參與了1個片段重復事件。除片段重復外,還發(fā)現(xiàn)2次串聯(lián)重復事件,包含4個StSCPL成員(StSCPL39和StSCPL40;StSCPL17和StSCPL27),其中StSCPL40同時參與了片段復制和串聯(lián)復制(圖3)。

注:利用MEGA7中41個StSCPLs和54個AtSCPLs蛋白的保守氨基酸序列,通過ClustalW生成無根樹。亞族組由不同的顏色區(qū)分。

注:馬鈴薯1～12號染色體以圓形形式顯示;紅色曲線表示馬鈴薯StSCPL基因之間的復制關(guān)系。

2.3 馬鈴薯StSCPLs的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和保守基序

通過MEME(Multiple expectation-maximization for motif elicitation)分析確定了StSCPL蛋白包含的5個保守基序(圖2B)。結(jié)果顯示,不同StSCPL蛋白包含的基序數(shù)介于3～5個,長度為15～50個氨基酸。其中馬鈴薯StSCPL9和StSCPL21僅含有motif 1～3,而StSCPL4、StSCPL12、StSCPL23和StSCPL32各含有4個motif,其余絕大多數(shù)StSCPLs包含全部5個保守基序。StSCPL13含有的motif數(shù)目最多,包含了兩組motif 1～5共10個基序(圖2B)。以上結(jié)果表明,不同的StSCPL可能在植物生長發(fā)育和脅迫反應中的作用具有差異。

2.4 馬鈴薯StSCPLs啟動子區(qū)順式作用元件分析

為了進一步了解StSCPL基因潛在的調(diào)控機制,尤其是與脅迫響應和激素相關(guān)的調(diào)控機制,使用PlantCARE檢測了每個基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.0 kb序列中的順式作用元件。如圖4所示(見16頁),多種激素響應相關(guān)的順式作用元件在馬鈴薯StSCPLs的啟動子區(qū)被發(fā)現(xiàn),如ABA、MeJA、GA、SA和生長素響應元件;除基本基因表達控制元件(CAAT和TATA)外,與脅迫響應和激素相關(guān)的順式作用元件根據(jù)功能可分為9組。多數(shù)StSCPLs的啟動子區(qū)均發(fā)現(xiàn)了參與ABA和MeJA響應性的順式作用元件,ABA和MeJA已被證明廣泛參與植物對各類脅迫的防御,這表明多數(shù)StSCPL基因可能參與馬鈴薯脅迫響應。干旱響應元件,如脫水響應元件(DRE)和參與干旱誘導(MBS)元件的MYB結(jié)合位點,也被發(fā)現(xiàn)存在于多個StSCPLs啟動子中。其他非生物脅迫響應元件(如MYC)也在StSCPLs基因啟動子中發(fā)現(xiàn)。綜上可知,馬鈴薯StSCPLs可能廣泛參與非生物脅迫響應。

2.5 馬鈴薯StSCPLs響應脅迫表達分析

2.5.1 馬鈴薯StSCPLs在非生物/生物脅迫及激素處理下的表達分析 馬鈴薯StSCPLs基因在響應非生物脅迫中的功能目前尚不明確。為進一步了解StSCPL基因的潛在功能,利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(DM 1-3 516 R44─Gene Expression Matrix (TPM)-v6.1)分析了其在非生物脅迫下(鹽脅迫,150 mmol·L-1NaCl;高溫,35℃;甘露醇,260 μmmol·L-1處理24 h)的表達量。結(jié)果表明,大多數(shù)StSCPL基因能夠響應非生物脅迫,其中響應熱脅迫的成員較多(圖5)。鹽脅迫和熱脅迫下,分別有20個(StSCPL2/4/9/10/14/17/18/19/22/23/25/16/21/28/29/30/31/32/35/38)和8個(StSCPL1/2/5/6/15/25/37/38)基因上調(diào)表達。值得注意的是,StSCPL7和StSCPL29在鹽脅迫和高溫脅迫中呈現(xiàn)完全相反的表達模式,在鹽脅迫中上調(diào)表達,而在熱脅迫下表達降低(圖5)。在模擬干旱(甘露醇,Mannitol)處理下,StSCPL4/14/24/32/37等17個StSCPLs上調(diào)表達。StSCPLs基因家族成員在不同激素處理(50 μM ABA、50 μM GA3、10 μM IAA和10 μM BAP, 24 h)下的表達模式存在較大差異,多數(shù)家族成員對IAA和GA3處理響應較明顯,分別有27個和29個StSCPLs上調(diào)表達,還有17個成員在ABA處理下上調(diào)表達。同時,部分StSCPL基因同時響應激素和非生物脅迫,例如StSCPL14(鹽、干旱、ABA、IAA和GA3)、StSCPL35(鹽、干旱、ABA和IAA)等。在生物脅迫下,馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)侵染葉片時,StSCPL11和StSCPL12的表達量均上調(diào),其余成員表達量下調(diào)或者不變。此外,大部分StSCPLs在BABA(β-氨基丁酸,β-aminobutyric acid)處理后表達量升高。綜上所述,StSCPLs基因能夠響應不同的逆境脅迫和激素處理,這與啟動子順式作用元件分析結(jié)果相一致。

2.5.2 不同抗旱性馬鈴薯品種中StSCPLs在干旱脅迫下的表達分析 為深入了解StSCPL家族基因在干旱脅迫響應中的潛在作用,通過轉(zhuǎn)錄組測序分析耐受性不同的栽培品種L和D在干旱脅迫下StSCPLs的表達。結(jié)果表明,干旱脅迫導致StSCPLs表達譜發(fā)生顯著變化(圖6,見18頁),這與模擬干旱條件下的基因表達量變化結(jié)果相似(圖5)。而且,2個抗旱性不同的馬鈴薯品種中StSCPLs基因的表達存在明顯差異,如StSCPL3和StSCPL34在干旱敏感型品種中分別下調(diào)表達7倍和8倍,但其在干旱耐受型品種中的表達量無顯著變化。

2.5.3 干旱脅迫下馬鈴薯StSCPLs表達模式分析 為深入分析馬鈴薯StSCPL基因在干旱脅迫響應中的作用,根據(jù)RNA-Seq數(shù)據(jù),篩選出了干旱脅迫下表達量變化超過2倍的18個馬鈴薯StSCPL基因家族成員(StSCPL2,StSCPL3,StSCPL6,StSCPL8,StSCPL14,StSCPL16,StSCPL17,StSCPL19,StSCPL22,StSCPL24,StSCPL26,StSCPL27,StSCPL28,StSCPL31,StSCPL32,StSCPL34,StSCPL35,StSCPL38),利用qRT-PCR進一步分析了上述基因在干旱脅迫下的表達模式。結(jié)果顯示(圖7,見17頁),12個基因的表達模式呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,除StSCPL8外,這些基因的最高表達量均出現(xiàn)在土壤水分含量為55%～60%(WS1)時,隨著干旱程度的加重,其表達量不同程度下降,當土壤水分含量為15%～20%(WS3)時,大部分基因的表達量回落到與CK相同的水平,甚至顯著低于CK中的表達量。不同于其他基因,StSCPL3的表達量呈現(xiàn)先上升后快速下降,然后再次上升的變化趨勢。值得注意的是,StSCPL32的表達量隨干旱脅迫程度增加呈現(xiàn)上升的趨勢,其在WS3中的表達量顯著高于對照(圖7A)。另外4個StSCPLs的表達模式與上述基因完全相反,隨干旱脅迫程度的加劇表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢,僅StSCPL22在WS3中的表達量顯著高于CK,其余基因與CK差異不顯著(圖7B)。

2.6 LncRNA及其靶StSCPL介導的調(diào)控網(wǎng)絡

長鏈非編碼RNA(lncRNA)作為蛋白質(zhì)編碼基因的順式或反式調(diào)控因子,在植物響應非生物脅迫中發(fā)揮重要作用[22-24]。最近,轉(zhuǎn)錄因子StCDF1被鑒定為馬鈴薯lncRNAStFLORE的靶基因,StCDF1-StFLORE位點對營養(yǎng)繁殖和保持水分穩(wěn)態(tài)很重要[25-26]。為深入探究StSCPLs在馬鈴薯響應脅迫中的作用,進一步構(gòu)建了lncRNAs及其靶基因StSCPLs介導的調(diào)控網(wǎng)絡(圖8,見18頁)。在馬鈴薯中預測并鑒定了26個StSCPLs及其對應的23個lncRNAs,其中,StSCPL18受3個lncRNA順式調(diào)控,其次是StSCPL24、StSCPL27和StSCPL36,各受2個lncRNA調(diào)控。值得注意的是,StSCPL3/4/5/6/7受同一個lncRNAMSTRG.2301.1調(diào)控,而StSCPL9/10/11/12/13為同一個lncRNAMSTRG.4102.2的靶基因。結(jié)果表明,在馬鈴薯生長發(fā)育和脅迫響應中StSCPL可能通過多個維度發(fā)揮其調(diào)控作用。

注:所有確定的順式作用元件被分為9組(用不同的顏色表示)。

注:2個品種StSCPL差異表達基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)。D0、L0為對照,D1、L1為干旱處理后5 d。

3 討 論

植物SCPL蛋白屬于蛋白質(zhì)水解酶家族,目前多個物種中均已鑒定、分離到SCPL基因及其蛋白。研究顯示SCPL在植物生長發(fā)育(種子萌發(fā)、細胞程序性死亡、次生代謝產(chǎn)物的合成)及生物和非生物脅迫應答中發(fā)揮了重要作用。但是馬鈴薯SCPL基因家族的研究目前鮮見報道。本研究從馬鈴薯全基因組中鑒定出41個StSCPLs成員并進行了系統(tǒng)分析。SCPL基因家族成員數(shù)目在不同物種間差異較大,如擬南芥[21]、茶樹[20]、黃瓜[4]及葡萄[27]中分別為54、47、27個和59個,黃瓜中CsaSCPL基因數(shù)目明顯偏少[4],而小麥[10]中目前鑒定到的SCPL基因數(shù)目高達210個。研究顯示,上述物種中SCPL基因的數(shù)量與其自身基因組的大小并無關(guān)系,可能主要與基因復制事件有關(guān)[4],馬鈴薯中僅有5個成員參與了基因復制事件。馬鈴薯41個StSCPLs基因在其11條染色體上均有分布,且呈不均等分布(表1,圖3)。SCPL蛋白分布于3個不同的亞家族,在各亞家族的分布數(shù)量表現(xiàn)為Group II> Group I> Group III,本研究中馬鈴薯SCPLs的分布與擬南芥、茶樹等物種具有相似性[10, 20-21]。

研究表明,許多物種中SCPL基因表現(xiàn)出對ABA和多種非生物脅迫(脫水、鹽、滲透和冷脅迫)的響應誘導[10]。研究人員對小麥TaSCPL基因的啟動子序列的順式作用元件分析表明,TaSCPL基因的啟動子序列富集了干旱、ABA和MeJA響應元件[10]。本研究鑒定到大多數(shù)馬鈴薯StSCPLs基因的啟動子區(qū)域至少存在一種激素響應元件,且ABA響應元件和DRE干旱響應元件等脅迫響應元件廣泛存在于StSCPLs啟動子區(qū)域中。此外,激素和干旱脅迫處理顯示,大部分StSCPLs對ABA響應明顯,且在不同抗旱性的馬鈴薯品種中差異表達。這與擬南芥AtSCPL啟動子中廣泛存在對植物激素和非生物脅迫響應的順式元件(如ABRE和DRE)的結(jié)果相一致[28]。有研究顯示,擬南芥AtSCPL30基因的啟動子PD1～PD9在煙草轉(zhuǎn)基因植株的幾乎所有組織和發(fā)育階段都能實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的強組成型表達;在正常和脅迫條件下,啟動子PD2～PD7驅(qū)動轉(zhuǎn)基因表達始終高于CaMV35S啟動子,差異在2倍以上[29],表明其在擬南芥生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,可以在馬鈴薯中發(fā)掘類似的啟動子元件。

LncRNA主要參與基因轉(zhuǎn)錄和表達的表觀遺傳和轉(zhuǎn)錄調(diào)控[22],其已被證實與各種植物的脅迫響應有關(guān)[30-33]。研究顯示,lncRNA生長素調(diào)控的啟動子環(huán)(AtAPOLO)與轉(zhuǎn)錄因子WRKY42相互作用,在擬南芥應對寒冷時觸發(fā)根毛細胞生長,從而減輕低溫的影響[32]。在對棉花鹽脅迫的響應中,lncRNA973通過調(diào)控活性氧清除基因、轉(zhuǎn)錄因子和鹽脅迫相關(guān)基因的表達[32],使棉花能夠在鹽脅迫下生長。LncRNATCONS_00021861通過競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控與水稻的耐旱性相關(guān)[23]。最新研究表明,馬鈴薯lncRNAStFLORE通過負調(diào)控其靶基因StCDF1影響氣孔生長和日開放來調(diào)控水分損失,進而調(diào)節(jié)干旱脅迫下馬鈴薯塊莖發(fā)育[25]。而本研究預測了26個StSCPLs受不同lncRNA調(diào)控,其中8個StSCPLs由多個lncRNA調(diào)控;初步構(gòu)建了lncRNA和靶StSCPL相互作用網(wǎng)絡,有助于全面了解馬鈴薯StSCPLs在干旱脅迫響應中的功能。

4 結(jié) 論

在全基因組水平從馬鈴薯基因組中鑒定了41個StSCPLs基因,并根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育將其分為3個亞族。通過同源性分析鑒定出2個基因重復事件和1對同源基因。StSCPLs基因啟動子含有潛在的激素和脅迫響應相關(guān)元件,表明StSCPL基因可能參與多種激素和脅迫響應途徑。干旱脅迫下,StSCPL基因在抗旱能力不同的2個品種中差異表達;18個StSCPLs基因表達量發(fā)生顯著變化,其中14個呈現(xiàn)先上升后下降的表達模式,說明StSCPLs廣泛參與馬鈴薯干旱脅迫響應。LncRNA及其靶StSCPL介導的調(diào)控網(wǎng)絡顯示,StSCPL3和StSCPL34分別是lncRNAMSTRG.2301.1和lncRNAMSTRG.19548.1的靶基因,在不同干旱耐受性品種中顯著差異表達,可能是馬鈴薯對干旱脅迫響應的潛在靶點。本研究為深入研究馬鈴薯StSCPLs的功能提供了理論基礎。