補(bǔ)腎生血藥對(duì)順鉑損傷的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

巫 蓉 趙汗青 王文娟

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院/中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100069)

據(jù)國(guó)際癌癥研究所的統(tǒng)計(jì),世界范圍內(nèi)各種癌癥將從2012年的1 400萬(wàn)人增加到2025年的1 900萬(wàn)人,到2035年預(yù)計(jì)將達(dá)到2 400萬(wàn)人,而近幾年癌癥在中國(guó)是主要致死原因,且新增病例數(shù)最多[1-2]。化療在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)造成人體正常細(xì)胞的損傷。一般來(lái)說(shuō),損傷DNA的化療引發(fā)骨髓抑制的作用最強(qiáng),而損傷RNA的化療次之,影響蛋白合成者最小[3-6]。化療導(dǎo)致造血干細(xì)胞活性下降,表現(xiàn)為以白細(xì)胞下降為主的外周血全血細(xì)胞減少。

骨髓抑制的中醫(yī)病機(jī)不外乎脾腎兩虛、氣血不足、瘀血搏結(jié)。若邪毒傷腎,腎精虧損,精不養(yǎng)髓,髓不化血?jiǎng)t可致血液虧少[7]。臨床研究顯示骨髓抑制從腎論治,以扶正作為治療大法,具有很好的療效[8]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),補(bǔ)腎中藥可以改善外周血象,促進(jìn)骨髓造血干/祖細(xì)胞增殖分化,減少骨髓細(xì)胞凋亡,促進(jìn)造血生長(zhǎng)因子及其調(diào)控基因表達(dá),改善骨髓造血微環(huán)境等[9-11]。

為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎中藥對(duì)骨髓造血支持細(xì)胞的影響,本研究采用順鉑致小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stem Cell,BMSC)損傷為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以補(bǔ)腎生血藥進(jìn)行干預(yù),通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期、造血調(diào)控因子含量,明確補(bǔ)腎生血藥對(duì)化療后BMSC的影響,為臨床“從腎論治”化療后骨髓抑制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級(jí)(250±20)g雄性SD大鼠50只[許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011],SPF級(jí)(20±2)g雄性BALB/c小鼠8只[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006],由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：AEEI-2018-054)。

1.1.2 藥物 補(bǔ)腎生血藥[北京康仁堂藥業(yè)有限公司,各中藥(批號(hào))：熟地黃(18002151),炒山藥(18007841),枸杞子(18008012),山茱萸(17025331),川牛膝(18001591),菟絲子(18007002),鹿角膠(17025581),龜甲(18007921),生黃芪(18005751),當(dāng)歸(18003261)];順鉑(美國(guó)APExBIO,美國(guó),批號(hào)：A8321)。

1.1.3 試劑與儀器 Cell Counting Kit-8試劑盒(日本同仁,批號(hào)：FH783);AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)：20180416);小鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)、γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、干細(xì)胞因子(Stem Cell Factor,SCF)、白細(xì)胞介素-3(Interleukin-3,IL-3)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor,GM-CSF);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒(北京金海科隅生物科技發(fā)展有限公司,批號(hào)：20190901);流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó),型號(hào)：BD LSRFortessa定制型);酶標(biāo)儀(上海科華生物工程股份有限公司,型號(hào)：ST-360)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠含藥血清的制備：將SD大鼠隨機(jī)分為2組：空白對(duì)照組、補(bǔ)腎生血藥組,每組25只。空白對(duì)照組每日按1 mL/100 g質(zhì)量給予蒸餾水,補(bǔ)腎生血藥組每日按1 mL/100 g質(zhì)量給予相應(yīng)藥液,連續(xù)5天。于第5天給藥1～2 h內(nèi)由腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置2 h后,離心半徑10 cm,1 000 r/min,4 ℃離心20 min,收集血清,同組混勻,56 ℃水浴滅活30 min,經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾除菌,2 mL凍存管分裝,-80 ℃保存。

BMSC原代培養(yǎng)與分組：將小鼠用CO2麻醉后處死,浸泡于乙醇中。用剪刀剪開小鼠背部,將小鼠雙下肢皮肉分離取出,浸泡于生理鹽水中,移入細(xì)胞間。用剪刀和鑷子分離肌肉和股骨、脛骨,將骨置于5 mL含20%胎牛血清的α最小基本培養(yǎng)基(Alpha Minimum Essential Medium,αMEM)完全培養(yǎng)基中,剪開骨兩端暴露骨髓腔,用1 mL針管吸取培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔至骨髓發(fā)白。吹打細(xì)胞混勻,制成骨髓細(xì)胞懸液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后半棄液,加入2 mL含10%胎牛血清的αMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),2～3 d換液1次,至第7天細(xì)胞密度達(dá)到80%左右傳代。3～5 d傳代1次,傳至第3～4代時(shí)凍存部分細(xì)胞,其余細(xì)胞用于開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 給藥方法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSC,調(diào)整細(xì)胞密度,將細(xì)胞按106/mL濃度接種至6孔板,各孔均加入等量αMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素)培養(yǎng)2 d至貼壁,吸除培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)清洗各孔。施加各干預(yù)措施,于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后收獲細(xì)胞。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)順鉑、補(bǔ)腎生血血清對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BMSC,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105,按每孔100 μL接種于96孔板中。分別加入25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L順鉑培養(yǎng)液,0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%補(bǔ)腎生血血清,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔,于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,向每孔加入10 μLCCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSC,調(diào)整細(xì)胞密度為5×105,將細(xì)胞按2 mL/孔接種于6孔板中進(jìn)行分組及干預(yù)。干預(yù)48 h后,沖洗消化成細(xì)胞懸液,離心半徑10 cm,1 000 r/min,離心5 min去上清液。用Cell Staining Buffer清洗2次,再用PBS緩沖液清洗后離心去上清。加入1 mL Cell Staining Buffer重懸細(xì)胞,尼龍布濾膜過(guò)濾移至流式管中,于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞周期。

同樣方法收集細(xì)胞后加入500 μL Binding Buffer混勻,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,再加入5 μL碘化丙啶染色(Propidium Iodide,PI)混勻,室溫避光反應(yīng)5～15 min后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 培養(yǎng)液中造血調(diào)控因子含量檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)后接種至孔板,每孔2 mL,空白組用培養(yǎng)基1.8 mL加空白血清0.2 mL,模型組用順鉑培養(yǎng)基1.8 mL加空白血清0.2 mL,補(bǔ)腎生血組用順鉑培養(yǎng)基1.8 mL加補(bǔ)腎生血血清0.2 mL。各組細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞,離心半徑10 cm,1 000 r/min,離心5 min收集上清液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒分別檢測(cè)上清液中TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度順鉑作用和不同濃度補(bǔ)腎生血血清作用48 h的OD值及細(xì)胞增殖率 作用48 h后,25 μmol/L順鉑能抑制BMSC的細(xì)胞增殖活性(P>0.05),50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L順鉑能顯著抑制BMSC的細(xì)胞增殖活性(均P<0.001)。見(jiàn)圖1。其中順鉑濃度為50 μmol/L時(shí)細(xì)胞增殖率降至50%～60%,因此將順鉑的用藥濃度定為50 μmol/L。

圖1 不同濃度順鉑作用48 h的OD值及細(xì)胞增殖率

作用48 h后,5%和10%補(bǔ)腎生血血清能明顯增加細(xì)胞增殖活性(均P<0.01),7.5%補(bǔ)腎生血血清能顯著增加細(xì)胞增殖活性(P<0.001)。見(jiàn)圖2。因此,將補(bǔ)腎生血血清的用藥濃度定為7.5%。

圖2 不同濃度補(bǔ)腎生血血清作用48 h的OD值及細(xì)胞增殖率

2.2 各組TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量比較 與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量均顯著升高(均P<0.05),SCF、IL-3、GM-CSF含量均顯著降低(均P<0.05);與模型對(duì)照組比較,補(bǔ)腎生血血清組TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量均顯著降低(均P<0.05),IL-3含量明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、TGF-β、IFN-γ、SCF、IL-3、GM-CSF含量

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組各期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化(均P>0.05);與空白對(duì)照組、模型對(duì)照組比較,補(bǔ)腎生血血清組處于G1期的細(xì)胞比例顯著降低(均P<0.05),處于增殖期的細(xì)胞比例顯著增加(均P<0.05);補(bǔ)腎生血血清組較空白對(duì)照組處于S期的細(xì)胞比例顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組流式細(xì)胞周期

順鉑作用48 h后,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01),補(bǔ)腎生血血清組骨髓細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.001)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組流式細(xì)胞凋亡率(%)

3 討論

補(bǔ)腎生血藥由當(dāng)歸補(bǔ)血湯與左歸丸組成。當(dāng)歸補(bǔ)血湯出自“金元四大家”之一李杲的《內(nèi)外傷辨惑論》,為補(bǔ)益氣血的代表方,功用在于補(bǔ)氣生血,當(dāng)歸專能補(bǔ)血,陰中之陰,配合補(bǔ)益肺脾之氣的黃芪,氣旺則助血化生。黃芪用量5倍于當(dāng)歸,一則血虛陽(yáng)浮,氣不足則難以固里,陽(yáng)氣外亡,故而重用黃芪補(bǔ)氣而專固肌表;再者有形之血不能速生,并生于無(wú)形之氣,補(bǔ)氣即為生血,氣血相生,虛熱自退,即《黃帝內(nèi)經(jīng)》所謂“陽(yáng)生陰長(zhǎng)”。左歸丸見(jiàn)于《景岳全書》卷五十一,原文記載由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、龜甲膠、川牛膝、菟絲子組成。主要功用在于滋陰補(bǔ)腎,填精益髓。針對(duì)真陰不足證,重用熟地黃為君,大補(bǔ)真陰;山藥之補(bǔ)脾,山茱萸之補(bǔ)肝,補(bǔ)肝陰以助腎陰,化生肝血,兼有通利之性,流通血脈之功;合以補(bǔ)腎精之枸杞子,協(xié)助峻補(bǔ)精髓,督任之元,配合血肉有情之品側(cè)重補(bǔ)腎陽(yáng)的鹿角膠和側(cè)重補(bǔ)腎陰的龜甲膠。全方在補(bǔ)陰之中配伍補(bǔ)陽(yáng)藥,取“陽(yáng)中求陰”之義。以上山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠和龜甲均為臣藥,后加有補(bǔ)腎中之氣的菟絲子,以及補(bǔ)血益肝腎、強(qiáng)腰膝、健筋骨的川牛膝,二者為佐藥,進(jìn)一步加強(qiáng)補(bǔ)腎益精的功效。方名雖曰左歸,由方解可見(jiàn)實(shí)為三陰并補(bǔ),水火交濟(jì)之方,尤以滋補(bǔ)腎陰為主。

現(xiàn)代藥理研究表明,當(dāng)歸補(bǔ)血湯中已知成分如當(dāng)歸多糖、阿魏酸、黃芪多糖、黃芪異黃酮和黃芪皂苷均直接或間接參與了血細(xì)胞的生成,能夠多環(huán)節(jié)來(lái)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造血細(xì)胞增殖分化;還一定程度提高化療后患者的免疫力,最終改善患者的骨髓抑制[12]。現(xiàn)代臨床研究顯示：左歸丸常用于治療再生障礙性貧血及腫瘤放化療反應(yīng),能明顯升高腫瘤放化療患者外周血白細(xì)胞數(shù)[13]。

造血因子分為造血生長(zhǎng)因子、造血抑制因子。常見(jiàn)造血生長(zhǎng)因子包括SCF、IL-3、GM-CSF等。研究報(bào)道,化療可影響骨髓造血微環(huán)境,抑制SCF、IL-3、GM-CSF等造血生長(zhǎng)因子分泌,從而抑制造血細(xì)胞增殖、分化[14],SCF所作用的靶細(xì)胞是極早期的、具有多向分化潛能的造血干細(xì)胞,促使這類細(xì)胞由靜止的、休眠狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞周期或加快細(xì)胞周期的進(jìn)程[15]。IL-3主要作用于早、中期造血祖細(xì)胞的增殖和分化,可刺激多種骨髓細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[16]。GM-CSF與GM-CSF受體結(jié)合后促進(jìn)多種造血細(xì)胞增殖分化。GM-CSF主要起到維持粒-單系細(xì)胞的存活,促進(jìn)生長(zhǎng)和誘導(dǎo)分化的作用[17]。常見(jiàn)造血抑制因子包括TNF-α、IFN-γ、TGF-β等。作為造血抑制因子之一的TNF家族,主要有TNF-α和TNF-β,二者對(duì)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的作用在不同的集落刺激因子刺激下各不相同[18]。TNF-α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)成人造血功能方面也有報(bào)道[19]。IFN-γ是免疫介導(dǎo)的負(fù)性造血調(diào)控因子,其可抑制正常骨髓細(xì)胞分化、增殖,對(duì)造血干細(xì)胞生長(zhǎng)也具有抑制作用[20]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),骨髓中的IFN-γ還可抑制人和鼠骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)的原始細(xì)胞活性[21]。

本實(shí)驗(yàn)采用順鉑損傷的小鼠BMSC為模型,以補(bǔ)腎生血藥進(jìn)行干預(yù),觀察補(bǔ)腎生血血清對(duì)BMSC凋亡、細(xì)胞周期及造血調(diào)控因子的影響。干預(yù)48 h后BMSC凋亡率明顯增高(P<0.01),SCF、IL-3、GM-CSF含量均顯著降低(均P<0.05),TNF-α、TGF-β、IFN-γ顯著升高(均P<0.05)。該結(jié)果與文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道相似,提示化療可造成骨髓細(xì)胞凋亡,造血微環(huán)境受到一定的破壞。

根據(jù)中醫(yī)“腎精化血”“腎生髓,髓養(yǎng)血”理論,結(jié)合骨髓抑制的臨床表現(xiàn),本課題組認(rèn)為化療后骨髓抑制的基本病機(jī)為“腎虛髓損、精血虧虛”,因此除健脾養(yǎng)血、補(bǔ)氣生血等常規(guī)治療外,還應(yīng)重視從腎論治[24-25]。本研究結(jié)果顯示,補(bǔ)腎生血血清組骨髓細(xì)胞凋亡率明顯降低,G1期細(xì)胞比例顯著降低,增殖期細(xì)胞比例顯著增加,IL-3含量明顯升高,TNF-α、TGF-β、IFN-γ含量顯著降低。發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎生血血清可減輕化療造成的骨髓細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖,能促進(jìn)造血生長(zhǎng)因子分泌,并減少造血抑制因子分泌,提示補(bǔ)腎生血藥對(duì)改善化療后骨髓抑制具有一定的作用。但由于化療藥的不同,以及造血環(huán)境的復(fù)雜性,可能不同的化療藥對(duì)于造血因子有不同的調(diào)控作用,具體情況有待進(jìn)一步研究。此外,由于補(bǔ)腎生血血清的成分較復(fù)雜,今后還需要進(jìn)一步開展血清藥理實(shí)驗(yàn),以明確是補(bǔ)腎生血藥發(fā)揮的藥效作用,還是與血清的協(xié)同作用。

利益沖突聲明：無(wú)。