沒食子體外抗結(jié)腸癌活性提取物的篩選研究

阿麗亞·依拉木 白姣姣 阿布都艾則孜·艾爾肯 艾爾菲丁·艾尼瓦爾 木巴拉克·伊明江

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊,830011)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一,是多基因、多因素參與的復(fù)雜過程,有著很高的發(fā)病率和死亡率[1]。據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年結(jié)腸癌發(fā)病率居世界第3位,每年約有1 150 000人確診為結(jié)腸癌[2]。據(jù)報(bào)道,炎癥性腸病患者發(fā)生結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)逐年顯著增加[3-4],口服非甾體抗炎藥可降低腸道腫瘤的發(fā)生率和炎癥性腸病癌變的風(fēng)險(xiǎn),這也證實(shí)了炎癥癌變機(jī)制的存在[5-6]。手術(shù)切除、輔助化療是臨床治療結(jié)腸癌的主要手段,但在治療過程中其復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高,總體預(yù)后不理想。中藥治療結(jié)腸癌在改善術(shù)后狀態(tài)、降低不良反應(yīng)、提高化療效率、保守治療等方面具有一定的優(yōu)勢,因此安全又經(jīng)濟(jì)的天然藥物成為了治療結(jié)腸癌藥物研究的熱點(diǎn)[7-9]。

沒食子Quercusinfectoriagalls,QIG為癭蜂科昆蟲沒食子蜂Cynipsgallae-tinctoriaeOliv.的幼蟲寄生于殼斗科櫟屬植物沒食子樹QuercusinfectoriaOliv.幼枝上產(chǎn)生的蟲癭,在民間具有悠久的臨床實(shí)踐應(yīng)用記錄,常用于治療牙齦糜爛、口腔潰瘍、瘡瘍息肉、腸道潰瘍、肛門炎等[10-11]。沒食子酸(Gallic Acid,GA)是沒食子的重要成分之一,可從沒食子、五倍子、石榴皮等中藥中提取而得,對消化道腫瘤具有良好的抑制效果[12-13]。據(jù)報(bào)道,QIG能夠通過減少炎癥介質(zhì)的分泌減輕炎癥損傷,并通過清除自由基增強(qiáng)組織的抗氧化活性,改善炎癥介質(zhì)與抗炎因子之間的失衡,修復(fù)損傷部位[14]。目前已有研究證實(shí),QIG能夠有效治療潰瘍性結(jié)腸炎[15],但是對結(jié)腸癌的治療作用還未見報(bào)道。因此,本研究通過體外藥效實(shí)驗(yàn)觀察并評價(jià)QIG4種不同極性溶劑提取物以及其GA對2種常見的結(jié)腸癌細(xì)胞在不同濃度以及不同時(shí)間孵育之后的增殖抑制作用程度,篩選出抗結(jié)腸癌活性最佳的提取物,為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和Caco-2均購買于武漢普諾賽生物科技有限公司,批號分別為201201D11、201228D50。用含有10%胎牛血清(Fetal Calf Serum,FBS)、1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),置于37 ℃、5%CO2無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每隔1～2 d換液1次。待細(xì)胞生長至皿面積的70%左右時(shí),用胰酶消化傳代(其中HCT-116細(xì)胞消化1 min,Caco-2細(xì)胞消化5 min)。待細(xì)胞貼壁后,再進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 沒食子藥材(于2016年購自廣州市,由新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)教授鑒定為真品,標(biāo)本保存于新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室藥劑組,標(biāo)本號為20160305);沒食子酸(GA)對照品(北京索萊寶科技有限公司,規(guī)格為20 mg,批號：406K022);5-氟尿嘧啶(5-FU)(北京索萊寶科技有限公司,規(guī)格50 mg,純度99.0%,批號：1209KG022)。

1.1.3 試劑與儀器 高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(BI公司,以色列,批號：2043176),進(jìn)口澳洲FBS(BI公司,以色列,批號：04-002-1C),100×青霉素/鏈霉素雙抗混合液(BI公司,以色列,批號：03-031-5B/C),胰蛋白酶-EDTA(BI公司,以色列,批號：03-050-1BCS),谷氨酰胺(BI公司,以色列,批號：03-42-3BC),磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)(BI公司,以色列,批號：2038149),CCK-8試劑盒(Biosharp公司,批號：7010000),二甲亞砜(Dimethylsulfoxide,DMSO)(Sigma公司,美國,規(guī)格：500 mL,批號：WXBC7821V),丙酮、乙醇、甲醇等試劑均為分析純。智能恒溫電熱套(鄭州長城科工貿(mào)有限公司,型號：DRT-SX)、生物安全柜(Thermo公司,美國,型號：51027497)、高速離心機(jī)(湖南湘儀器械有限公司,型號：H17502)、電熱恒溫水浴鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司,型號：HHS-11-1)、電子天平(深圳無限量衡器有限公司,型號：MAX-A6003)、高壓滅菌鍋(Techcomp公司,型號：SX-500)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司,美國,型號：Forma 371)、倒置顯微鏡(Nikon公司,日本,型號：TS2)、全波長酶標(biāo)儀(Thermo Fisher公司,美國,型號：Multiskan GO)。

1.2 方法

1.2.1 QIG不同溶劑提取物的浸膏制備 取QIG干燥果實(shí),粉碎成過80目細(xì)粉,取50 g加入8倍量溶劑(丙酮、乙醇、甲醇、水)回流提取3次,每次0.5 h,合并提取液,減壓濃縮(50 ℃),減壓干燥(50 ℃)制成浸膏,分別得QIG丙酮提取物、乙醇提取物、甲醇提取物和水提物的浸膏[16]。

1.2.2 受試藥物母液的配制 由于QIG和GA均為水溶性物質(zhì),因此本實(shí)驗(yàn)選用PBS為溶劑。稱取適量QIG不同極性溶劑提取物,配制成100 mg/mL的母液;以DMSO為溶劑,稱取適量5-FU,配制成的10 mg/mL母液;待以上母液待充分溶解后,過膜(0.22 μm),分裝,貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 分組與給藥方法 將實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(不加任何藥物處理培養(yǎng)的細(xì)胞),給藥組分別為5-FU組(陽性對照,預(yù)實(shí)驗(yàn)得5-FU干預(yù)2種細(xì)胞24 h時(shí)后的IC50≈0.05 mg/mL,因此本研究中將其濃度設(shè)為0.05 mg/mL)和不同濃度的QIG醇提物組(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)。

1.2.4 CCK-8法實(shí)驗(yàn)檢測步驟 取對數(shù)生長的HCT-116、Caco-2細(xì)胞,胰酶消化后計(jì)數(shù),分別以每孔2 000個(gè)細(xì)胞均勻接種在96孔板里。待常規(guī)培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后,去除培養(yǎng)液。每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)空白調(diào)零孔(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液)用來校正。分別在培養(yǎng)12、24、48和72 h時(shí),再根據(jù)說明書每孔加入適量用培養(yǎng)液稀釋過的CCK-8溶液,置于培養(yǎng)箱中靜置2 h后,用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定各孔的吸光度(Absorbance,A)值,并計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率,增殖抑制率(%)=1-(給藥組A-空白調(diào)零孔A)/(空白對照組A-空白調(diào)零孔A)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用Graph Pad Prism 7軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)采用表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)或Dunnett′s T3檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QIG各提取部位浸膏得率 經(jīng)過粉碎過篩、加熱回流、濃縮干燥等提取過程,分別得到QIG丙酮提取浸膏35.09 g、乙醇提取浸膏38.98 g、甲醇提取浸膏37.74 g、水提浸膏34.43 g,并稱量得浸膏得率。見表1。

表1 QIG在不同極性溶劑中的浸膏得率

2.2 體外抗腫瘤活性測定 與空白對照組比較,QIG不同極性溶劑提取物組和GA組增殖抑制率均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見表2～3。且該作用具有濃度和時(shí)間依賴趨勢。各提取物對2種結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值各不相同,其中QIG丙酮、乙醇、甲醇、水提物在12、24、48、72 h后對HCT-116細(xì)胞的IC50值范圍分別為：0.313～0.988 mg/mL、0.131～0.53 mg/mL、0.107～0.379 mg/mL、0.1～0.262 mg/mL;對Caco-2細(xì)胞分別為1.093～1.382 mg/mL、0.404～0.53 mg/mL、0.246～0.341 mg/mL、0.134～0.312 mg/mL。在作用12、24、48、72 h后,乙醇提取物對HCT-116細(xì)胞對應(yīng)的IC50值為0.313、0.131、0.107、0.1 mg/mL;對Caco-2細(xì)胞對應(yīng)的IC50值為1.093、0.404、0.246、0.134 mg/mL,均為所有提取物的最小IC50值。比較分析得乙醇提取物對2種細(xì)胞活性抑制效果最佳,其在72 h時(shí)作用于HCT-116、Caco-2細(xì)胞的最大抑制率和IC50值分別為的76.55%和0.1 mg/mL、78.8%和0.134 mg/mL。另外,GA在作用72 h時(shí)HCT-116和Caco-2細(xì)胞對應(yīng)的最大抑制率和IC50值分別為86.54%和0.07 mg/mL、80.30%和0.083 mg/mL。見表4。

表2 QIG提取物對HCT-116細(xì)胞的生長抑制率

表3 QIG提取物對Caco-2細(xì)胞的生長抑制率

表4 各受試藥物對Caco-2和HCT116細(xì)胞的IC50值(mg/mL)

3 討論

QIG已被證實(shí)能夠治療炎癥性腸病,本研究重點(diǎn)探討QIG不同提取物的抗結(jié)直腸癌藥效差異,以期篩選出最佳抗癌提取物。本研究發(fā)現(xiàn)QIG的4種有效提取物和GA對2種人結(jié)腸癌細(xì)胞均有不同程度的生長抑制作用,且具有明顯濃度及時(shí)間依賴趨勢。通過綜合比較發(fā)現(xiàn),提取物當(dāng)中以乙醇提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞抑制作用最強(qiáng),另外GA作為QIG中的重要有效組分,也表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抑癌活性。課題組在前期的物質(zhì)基礎(chǔ)研究中得出,QIG藥材富含具有水溶性的多酚類成分占50%～70%,多酚具有很強(qiáng)的清除自由基的能力,可以通過清除活性氧化物抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生[17]。本研究證實(shí)了QIG的抗結(jié)腸癌作用,同時(shí)也提示含多酚類成分的藥材在未來的抗癌中藥研發(fā)領(lǐng)域中或許具有較大的開發(fā)價(jià)值。

5-FU是抗嘧啶類化療藥物,能夠通過阻斷脫氧核糖尿苷酸受細(xì)胞內(nèi)胸苷酸合成酶轉(zhuǎn)化為胸苷酸,而干擾DNA合成,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[18]。以5-FU為主的mFOLFOX6方案為目前公認(rèn)的治療結(jié)腸癌患者的一線用藥方案[19],因此本研究選擇5-FU作為陽性對照藥探討QIG醇提物的抗結(jié)腸癌效果。BOURDY等[20]在玻利維亞植物中篩選最佳抗瘧疾部位時(shí)證實(shí)極性指數(shù)較高的水(P′=9)、乙醇(P′=5.2)、甲醇(P′=5.1)和丙酮(P′=5.1)等溶劑能夠以不同的比例提取出植物中存在的具有廣譜生物活性的化合物。因此我們利用前人的提取方法,得到了4種QIG不同極性溶劑提取物。QIG富含水溶性多酚,這類成分在水提物當(dāng)中含量最高,然而在本次篩選最佳抗結(jié)腸癌提取物的實(shí)驗(yàn)中QIG乙醇提取物作用更強(qiáng),而且在另外一項(xiàng)研究中,QIG甲醇提取物和QIG丙酮提取物的作用最佳[16]?？傊?多酚含量的多少和QIG的藥效并沒有直接相關(guān),相同成分但比例不同的提取物對不同疾病的藥效也有所差異。故中藥成分的復(fù)雜性提示研究藥效強(qiáng)弱時(shí)不能單純從其中某類成分含量的多少來定論,若要從中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)研究其作用效果,需要更深入了解各成分的比例和剩下未知的成分。

本研究評價(jià)了QIG不同提取物對人結(jié)腸癌細(xì)胞的活性,成功篩選出了活性最強(qiáng)的乙醇提取物,為今后QIG抗腫瘤活性研究提供了理論參考。本研究的局限性為未能闡明具體是什么成分的差異導(dǎo)致了QIG提取物藥效的差異,這有待進(jìn)一步的研究。

利益沖突聲明：無。