超聲-微波輔助提取酸漿宿萼多糖及其體外降糖活性

李成華，秦汝蘭，關穎麗，付艷艷，薛長松*，朱芳嬈，陳建宇

（1.通化師范學院長白山優勢生藥資源開發與利用實驗室，吉林 通化 134001；2.長春中醫藥大學附屬醫院腎病科，吉林 長春 130021）

酸漿（Physali alkekengi L.）別名紅姑娘，主要分布在吉林、內蒙古、四川、西藏等地[1]，具有清涼、消腫、利尿等功效。民間常用酸漿宿萼（果萼）代茶飲降低糖尿病患者血糖，效果非常好[2]。酸漿多糖具有多種生物活性[3]，能修復糖尿病小鼠的肝臟、腎臟，增強糖尿病小鼠的免疫活性，有抗衰老、抑制疲勞等作用[4]，還能促進乳酸桿菌生長，抑制大腸桿菌生長，調節腸道菌群[5]。超聲-微波協同輔助提取既擁有超聲產生的“機械和空化效應”，能迅速破裂植物細胞壁；又具有微波能使物料內外同時受熱的特性。植物細胞內的溶劑汲取微波能，溫度急速升高，能夠產生瞬時高壓，破碎植物細胞壁，強化物質提取[6]。超聲-微波協同提取法可以明顯縮短提取時間，節省能源消耗，且提高多糖提取率[7]。王佰靈等[8]優選超聲-微波雙輔助法提取延齡草多糖的工藝，研究表明超聲-微波雙輔助法提取工藝簡單便捷，方法切實可行，延齡草多糖提取率高于單獨超聲和單獨微波提取。李湘利等[9]運用超聲-微波協同提取雞樅菌多糖，縮短了提取時間，提升了多糖得率。

超聲-微波協同提取酸漿宿萼多糖相關的提取工藝參數貧乏及酸漿宿萼多糖降糖活力的相關試驗研究鮮有報道。本研究選用酸漿宿萼為試驗原料，采用超聲-微波協同提取酸漿宿萼多糖，通過酸漿宿萼多糖對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制能力測評其體外降糖活力，為酸漿宿萼多糖的更深入試驗研究提供有益借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸漿宿萼：自采于通化縣，30 ℃低溫烘干，粉碎過60 目篩，備用。

葡萄糖對照品（批號：161171-160921）：中國食品藥品檢定研究院；α-淀粉酶（≥10 000 U/g）、α-葡萄糖苷酶（≥50 U/mg）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）：上海伊卡生物技術有限公司。

XH-300PE 微波超聲波組合萃取儀：北京祥鵠科技有限公司；UV1900 紫外-可見分光光度計：上海菁海儀器有限公司；Thermo Forma 酶標儀：美國Bio-Rad公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多糖提取

標準曲線的繪制：超聲輔助蒸餾水溶解葡萄糖對照品制備0.2 mg/mL 葡萄糖對照品儲備液。取對照品儲備液2 mL 于10 mL 容量瓶中，加1 mL 5%苯酚溶液，5 mL 濃硫酸溶液水浴反應20 min，再用蒸餾水定容，于波長400～600 nm 間掃描，優選492 nm 為測定波長[10]。精密吸取對照品儲備液1.10、1.30、1.50、1.70、1.90、2.10、2.30、2.50 mL 于10 mL 容量瓶，492 nm 處檢測吸光度，參比液為蒸餾水，吸光度A 對濃度C 制作方程A=0.006 7C+0.016 2，R2=0.999 7。結果表示，葡萄糖在0.022～0.050 mg/mL 具有良好線性關系。

樣品中多糖含量測定：稱取經干燥箱干燥后的酸漿宿萼粉末1 g，石油醚脫脂3 h，超聲-微波協同浸提2 次，浸提液5 000 r/min 轉速下離心20 min，得上清液，75%乙醇醇沉，復溶，二次醇沉，干燥沉淀為酸漿宿萼多糖[11]。蒸餾水超聲溶解酸漿宿萼多糖于10 mL 容量瓶中，蒸餾水溶解并定容，于優選的測定波長處測吸光度，利用回歸方程算出濃度，求出多糖提取量。

1.2.2 單因素試驗設計

在超聲功率200 W、微波功率250 W、協同時間5 min 的條件下，考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]對多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、微波功率250 W、協同時間5 min 的條件下，考察超聲功率50、100、150、200、250 W 對多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、超聲功率150 W、協同時間5 min的條件下，考察微波功率200、250、30、350、400 W 對多糖提取量的作用；在料液比1∶20（g/mL）、超聲功率150 W、微波功率300 W 的條件下，考察協同時間2、3、4、5、6 min 對多糖提取量的作用；每組均進行3 次平行試驗。

1.2.3 星點響應面法優選提取條件

結合單因素試驗獲得的試驗結果，考察的工藝條件為料液比（A）、超聲功率（B）、微波功率（C）、協同時間（D），運用響應面法優選酸漿宿萼多糖提取的工藝條件。多糖提取量為響應值（Y）完成隨機試驗設計，各工藝因素水平見表1。

表1 工藝因素水平設計Table 1 Factors and levels of design

1.2.4 降糖活力檢測

蒸餾水超聲輔助制備0.125、0.5、2、8、16 mg/mL 系列濃度的樣品溶液，0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5 mg/mL 系列濃度的阿卡波糖陽性對照溶液。

1.2.4.1 對α-葡萄糖苷酶的抑制能力測定

參照表2 完成相關試驗，其中加入樣品和PNPG后都要求放置在提前預熱37 ℃烘箱中15 min，最后添加碳酸鈉使得反應終止，使用酶標儀選取540 nm 處檢測吸光度。

表2 抑制α-葡萄糖苷酶試驗設計Table 2 Experimental design for α-glucosidase inhibition

R葡萄糖甘酶=[A對照-（A樣品-A空白）]/A對照×100

式中：R葡萄糖甘酶為α-葡萄糖甘酶抑制率，%；A對照為對照組吸光度；A樣品為樣品組吸光度；A空白為空白組吸光度。

1.2.4.2 對α-淀粉酶的抑制能力測定

參照沈鵬等[12]的方法制備DNS 試劑。參照表3 完成相關試驗，加α-淀粉酶后放置在提前預熱的37 ℃水浴鍋中10 min，最后加入DNS 后，使用酶標儀選取540 nm 處檢測吸光度。

表3 抑制α-淀粉酶試驗設計表Table 3 Experimental design for α-amylase inhibition

R淀粉酶=[（A對照-A空白對照）-（A樣品-A樣品對照）-（A空白-A空白對照）]/A對照×100

式中：R淀粉酶為α-淀粉酶抑制率，%；A對照為對照組吸光度，A樣品為樣品組吸光度，A空白對照為空白對照組吸光度，A樣品對照為樣品對照組吸光度。

1.3 數據處理

試驗獲得數據選用Design-Expert 8.0.6、SPSS13.0軟件處理分析。

2 結果與分析

2.1 料液比對多糖提取量的影響

料液比對多糖提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on polysaccharides yield

由圖1 得知，一定程度內酸漿宿萼多糖提取量伴隨著溶劑量的增大而增加，提取溶劑量的增大拓寬了酸漿宿萼多糖和提取溶劑兩者間濃度差，更便于多糖的溶出[13-14]。料液比達到1∶30（g/mL）后總多糖提取量趨于穩定。這可能與隨著溶液體積變大，超聲波、微波能量發揮作用于物料上相對消弱，作用于溶劑上相對增強有關[14]。因此選擇料液比最佳條件為1∶20（g/mL）。

2.2 超聲功率對多糖提取量的作用

超聲功率對多糖提取量的作用見圖2。

圖2 超聲功率對酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

由圖2 得知，酸漿宿萼多糖提取量伴隨超聲功率的增大先升后降，當功率150 W 時，達到最大值，因此選擇超聲功率工藝參數為150 W。超聲波產生的振動能生成空化和剪切效應，更有益于酸漿宿萼細胞的破壁，超聲功率進一步加大反而破壞糖苷鍵有關[15]。

2.3 微波功率對多糖提取量的作用

微波功率對多糖提取量的作用見圖3。

圖3 微波功率對酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharides yield

由圖3 得知，酸漿宿萼多糖提取量隨微波功率的增大先升后降，微波功率300 W 時，達到最大值，因此選擇微波功率工藝參數為300 W。隨著溶劑溫度迅速上升，酸漿宿萼多糖提取率在功率250～300 W 時上升很快，隨后波功率更高溶劑溫度也更高，能破壞多糖結構，導致溶劑甚至暴沸，多糖提取量下降[16]。

2.4 超聲-微波協同時間對多糖提取量的作用

超聲-微波協同時間對多糖提取量的作用見圖4。

圖4 協同時間對酸漿宿萼多糖提取量的作用Fig.4 Effect of synergistic time on polysaccharides yield

由圖4 得知，酸漿宿萼多糖提取量隨超聲-微波協同時間的拉長展示出先增后降的趨勢，在協同時間4 min 時達到峰值，因此選擇協同時間工藝參數為4 min。超聲-微波協同提取溫度上升非?？?，提取時間越長溫度越高，高溫易使多糖水解，從而致使多糖的提取量下降[17]。

2.5 響應面法改進酸漿宿萼多糖提取工藝條件結果

響應面法所設計的試驗方案與結果見表4。

表4 擬合設計試驗方案及結果Table 4 Fitting design test scheme and results

使用Design-Expert 8.0.6 軟件采用響應面分析法對試驗結果進行分析，所得回歸方程：Y=26.64-0.30A-0.16B+0.67C+0.55D-1.41AB-0.51AC-0.41AD-1.72BC-0.58BD-0.38CD-1.06A2-1.18B2-0.42C2+0.60D2，R2=0.990 5。響應面法對酸漿多糖提取量的方差分析見表5。

表5 方差分析表Table 5 Variance analysis of orthogonal test

由表5 可知，模型P 值為0.000 5，表示回歸方程與實際試驗結果擬合性好，試驗誤差在合理范圍，證實該模型可以分析與預測酸漿宿萼多糖的提取量。各因素對多糖提取量的影響順序為C 微波功率>A 料液比>B 超聲功率>D 協同時間。

將表4 中試驗所得數據利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應曲面分析，獲得的曲面圖和等高線圖能直觀的反映2 個交相提取工藝對酸漿宿萼多糖提取量的影響。遵照上述回歸方程，分析A 料液比、B 超聲功率、C 微波功率、D 協同時間4 個考察條件對多糖提取量的作用，結果見圖5。

圖5 各因素交互作用對多糖提取影響的響應面圖Fig.5 Response diagram of the interaction of various factors on the extraction of polysaccharides

由圖5 可知，A 料液比、B 超聲功率、C 微波功率、D協同時間工藝參數間的交互作用對宿萼多糖提取量的影響。與其它考察因素比較，A 料液比和B 超聲功率、A料液比和C 微波功率、C 微波功率和B 超聲功率分別與多糖提取量呈相應明顯的二次拋物線關系，所構成的三維曲面圖形陡峻，且等高線圖形為橢圓，等高線較稠密，兩工藝參數間的作用對多糖提取量影響相對大[18]。

2.6 驗證試驗

試驗獲得的酸漿宿萼多糖提取的最佳條件：料液比1∶16.85（g/mL）、超聲功率160 W、微波功率316 W、協同時間3.88 min，多糖提取量為27.569 5 mg/g?？紤]實際操作性，提取工藝條件調整為：料液比1∶17（g/mL）、超聲功率160 W、微波功率320 W、協同時間4 min。在此優選工藝參數下，完成3 次驗證，獲得的酸漿宿萼多糖為（26.13±0.11）mg/g，與模型預期值形成的誤差為5.22%，證實該方程與酸漿宿萼多糖提取試驗完成較好擬合。

2.7 酸漿宿萼多糖降糖能力試驗研究結果

酸漿宿萼多糖降糖能力試驗研究結果見表6。

表6 酸漿宿萼多糖降糖能力結果Table 6 Hypoglycemic activity of polysaccharides

由表6 可知，酸漿宿萼多糖與陽性對照品對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制結果進行兩樣本T 檢驗，兩者降糖結果有差異，但不顯著（t=4.314、p=0.050，t=4.032、p=0.056）。抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性是醫治2 型糖尿病初期有效途逕[19-20]。酸漿宿萼多糖具有較好的降糖活性，可與醫治2 型糖尿病的慣用藥物協同使用。

3 結論

超聲-微波協同提取利用超聲波的空化和剪切作用乃至微波的加熱、破壁效用來提高酸漿宿萼多糖的提取量。通過回歸方程模擬相關試驗考察試驗因素間的函數關系來探尋各交互考察因素的最準確組合以及響應值的最理想值。本文優化了超聲-微波協同提取酸漿宿萼多糖的工藝，超聲-微波協同提取酸漿宿萼多糖用時4 min，該提取法更加省時、高效，酸漿宿萼多糖提取量高。酸漿宿萼多糖有降糖活力，可與醫治2型糖尿病的慣用藥物協同使用。本試驗為酸漿宿萼多糖的更深入科學研究提供參考。