Design-Expert軟件設(shè)計優(yōu)化萬壽菊黃酮提取工藝及抗氧化活性、抑菌活性測定

韓秀枝，曹源，詹躍勇，2，秦令祥，2，3*

（1.漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300；2.漯河市食品研究院有限公司，河南 漯河 462300；3.河南和生食品有限公司，河南 漯河 462300）

萬壽菊（Tagetes erecta L.），又名金盞花、臭芙蓉等，是一年生草本植物，屬被子植物門、雙子葉植物綱、菊目、菊科、萬壽菊屬，原產(chǎn)于墨西哥及中美洲，在我國各地均有種植。萬壽菊中含有多糖、黃酮、揮發(fā)油、氨基酸、生物堿、萜類等多種功能成分[1-6]，具有提高免疫力[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]、抑菌[11]、降血脂[12]和抗動脈粥樣硬化[13]等功效。萬壽菊黃酮（Tagetes erecta L.flavonoids，TEF）是萬壽菊中主要的生物活性成分之一，具有較高食用和保健價值，其花中含有的黃酮較多。

目前，常用的黃酮提取方法有熱回流法、溶劑法、微波法、超聲波法等[14]，這些方法各有利弊。郭耀東等[5]在常壓條件下采用超聲輔助提取TEF，得到了最佳工藝條件；上述方法大都需要高溫或高壓或常壓，容易導(dǎo)致黃酮被破壞[15-16]。負(fù)壓技術(shù)利用原料在真空負(fù)壓下產(chǎn)生強(qiáng)烈的空化和機(jī)械效應(yīng)，使其細(xì)胞壁在較低溫度下破碎，其活性成分不易降解，最大限度地保留其生物活性。超聲法一般是在常壓下進(jìn)行，其提取溫度通常較高，容易使黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生降解和活性降低。為了彌補常壓法和黃酮在高溫下會降解的不足，本文擬采用負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助提取TEF，利用Design-Expert 軟件設(shè)計優(yōu)化提取條件，通過數(shù)學(xué)模型獲得最佳條件，同時研究其抗氧化活性和抑菌活性，為TEF 的提取、應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬壽菊：亳州中藥材市場；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司；硫酸亞鐵、無水乙醇、氫氧化鈉、三氯甲烷、硝酸鋁、亞硝酸鈉、水楊酸、過氧化氫、四氯化碳、正丁醇、聯(lián)苯雙酯、維生素C（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-bitter hydrazine，DPPH）試劑：武漢卡諾斯科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波清洗器（KM-300DE）：昆山美美超聲儀器有限公司；無油真空泵（VP-1800V）：東莞市盛飛真空設(shè)備有限公司；臺式高速離心機(jī)（TD6M）：紹興市蘇珀儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE500）：上海遠(yuǎn)懷實業(yè)有限公司；紫外可見分光光度計（N6000S）：青島精誠儀器儀表有限公司；手提式高速萬能粉碎機(jī)（DFT-50）：上海化科實驗器材有限公司；臺式真空干燥箱（DZF-6020）：中新醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 萬壽菊預(yù)處理

將萬壽菊清洗干凈，置于低溫烘箱烘干，再用粉碎機(jī)粉碎，過0.18 mm 篩，備用。

1.3.2 TEF 的提取流程

萬壽菊粉→按料液比1∶20（g/mL）加入70%乙醇溶液→放入超聲波清洗器中，按照負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助法的條件提取→離心（5 000 r/min，15 min）→濃縮→純化[17]（AB-8 型大孔樹脂）→濃縮→真空干燥→制得TEF。

1.3.3 TEF 得率測定

參照符群等[18]的方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色法測定。TEF 得率（A，%）的計算公式如下。

式中：C 為提取液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為提取液的體積，mL；M 為萬壽菊樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 TEF 提取單因素試驗

以TEF 得率為指標(biāo)，固定乙醇濃度70%、料液比1∶20（mg/mL）、提取溫度50 ℃、負(fù)壓0.08 MPa、超聲波功率400 W、超聲時間30 min。分別考察不同負(fù)壓（0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 MPa）、超聲功率（250、300、350、400、450 W）、超聲時間（10、20、30、40、50 min）對TEF 得率的影響，每組試驗重復(fù)3 次。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以TEF 得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。試驗因素與水平見表1。

表1 試驗因素與水平Table 1 Test factors and levels

1.3.6 抗氧化活性的測定

1.3.6.1 DPPH 自由基清除能力測定

根據(jù)吳楊洋等[19]的方法進(jìn)行測定。

1.3.6.2 羥基自由基清除能力測定

根據(jù)王迦琦等[20]的方法進(jìn)行測定。

1.3.7 抑菌活性的測定

根據(jù)李曉嬌等[21]的方法，利用2 倍稀釋法，將TEF用無菌水配成系列梯度濃度的樣品液，備用。采用龔祥等[22]的濾紙片法，將圓形濾紙片滅菌后，放在含供試菌的培養(yǎng)皿上，用移液管移取5 μL TEF 樣品液滴在濾紙片上，置于生化培養(yǎng)箱中，35 ℃培養(yǎng)24 h，測其抑菌圈直徑，加無菌水的濾紙片作對照，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為開始出現(xiàn)抑菌圈時的濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

各試驗均重復(fù)3 次取平均值。采用SPSS 軟件和Design-Expert 12 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 負(fù)壓對TEF 得率的影響

負(fù)壓對TEF 得率的影響見圖1。

圖1 負(fù)壓對TEF 得率的影響Fig.1 The effect of negative pressure on TEF yield

由圖1 可知，隨著負(fù)壓的升高，TEF 得率先升高后下降，在負(fù)壓為0.08 MPa 時，達(dá)到最大值。這是由于負(fù)壓升高，負(fù)壓作用于料液產(chǎn)生的空化氣泡增多，其空化效應(yīng)和機(jī)械振動作用增強(qiáng)，導(dǎo)致萬壽菊細(xì)胞壁破裂速度、程度和數(shù)量增加，胞內(nèi)黃酮擴(kuò)散、溶解增多，得率升高；當(dāng)負(fù)壓為0.08 MPa 時，由負(fù)壓導(dǎo)致的細(xì)胞破裂基本完全，黃酮溶出基本徹底，再繼續(xù)升高負(fù)壓，提取溫度會下降，黃酮的擴(kuò)散、溶出減小，得率略有下降。因此，負(fù)壓取0.08 MPa 為宜。

2.1.2 超聲功率對TEF 得率的影響

超聲功率對TEF 得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對TEF 得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on TEF yield

由圖2 可知，隨著超聲功率的增大，TEF 得率先升高后略有降低，在400 W 時達(dá)到最高。這是因為超聲功率增大，其空化、機(jī)械效應(yīng)增強(qiáng)，萬壽菊細(xì)胞的破裂程度、數(shù)量增大，得率提高；當(dāng)超聲功率400 W 時，細(xì)胞破裂基本完全，黃酮基本溶出完全，再繼續(xù)增大超聲功率，黃酮溶出也不再增加，反而過高的超聲功率會破壞部分黃酮結(jié)構(gòu)，降低其得率。因此，超聲功率取400 W 為宜。

2.1.3 超聲時間對TEF 得率的影響

超聲時間對TEF 得率的影響見圖3。

圖3 超聲時間對TEF 得率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic time on TEF yield

由圖3 可知，隨著超聲時間的延長，TEF 得率呈先升高后下降的趨勢，并在30 min 時達(dá)到最大。這是因為超聲時間延長，超聲波的空化和機(jī)械作用增強(qiáng)，萬壽菊細(xì)胞壁破裂程度和數(shù)量增大，黃酮溶出增多，得率提高；當(dāng)時間超過30 min 后，過長的超聲時間，會使部分黃酮結(jié)構(gòu)破壞，得率下降。因此，超聲時間取30 min為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 回歸方程的建立

在單因素的基礎(chǔ)上，以負(fù)壓（A）、超聲功率（B）和超聲時間（C）為3 個影響因素，TEF 得率（Y）為響應(yīng)值，試驗方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

采用Design-Expert 12 軟件，對表2 的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程Y=5.16+0.352 5A+0.053 8B+0.108 8C+0.042 5AB-0.032 5AC-0.030 0BC-0.730 0A2-0.852 5B2-0.757 5C2。

2.2.2 回歸模型的方差分析

對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of regression model

由表3 可知，該回歸模型的P＜0.01，表明模型極顯著；失擬項P=0.151 5＞0.05，不顯著，擬合度較好，說明該模型可信度高；另外，模型的決定系數(shù)R2=0.999 7，說明模型擬合程度良好。R2Adj=0.999 2，說明該模型能解釋99.92%響應(yīng)值的變化，自變量和響應(yīng)值間線性關(guān)系顯著。綜上所述，該模型可用于TEF 的提取工藝優(yōu)化。從顯著性結(jié)果可知，A、B、C、AB、A2、B2和C2項影響極顯著（P＜0.01），AC、BC 影響顯著（P＜0.05）。根據(jù)F 值大小可知，各因素影響順序為A＞C＞B。

2.2.3 響應(yīng)面分析

利用Desgin-Expert 12 軟件繪制的各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Response surface and contour map of interaction of various factors

由圖4 可知，AC 和BC 響應(yīng)面較彎曲，等高線呈橢圓形，說明AC 和BC 之間的交互作用顯著（P＜0.05），AB 的響應(yīng)曲面更陡峭，曲面更彎曲，說明該交互作用極顯著（P＜0.01），這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 最佳條件的預(yù)測及驗證試驗

通過模型的建立，預(yù)測最佳工藝條件為負(fù)壓0.082 MPa、超聲功率401.81 W、超聲時間30.66 min，理論TEF 得率為5.21%。考慮到實際操作，對最佳工藝條件修正為負(fù)壓0.08 MPa、超聲功率402 W、超聲時間30 min，對此條件下建立的模型進(jìn)行驗證試驗，重復(fù)3 次，得到實際TEF 得率平均值為5.18%，與預(yù)測值相對誤差0.58%，表明該模型可靠。

2.3 抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 DPPH 自由基清除能力

不同濃度的TEF 對DPPH 自由基的清除能力見圖5。

圖5 不同濃度的TEF 對DPPH 自由基的清除能力Fig.5 The scavenging ability of different concentrations of TEF on DPPH free radicals

由圖5 可知，隨著TEF 和VC質(zhì)量濃度的增大，其清除DPPH 自由基的能力均不斷增強(qiáng)。當(dāng)TEF 濃度為250 μg/mL 時，清除率為81.73%，弱于同濃度的VC，說明其在適宜的濃度下，有較強(qiáng)的清除DPPH 自由基能力。

2.3.2 羥基自由基清除能力

不同濃度的TEF 對羥基自由基的清除活性見圖6。

圖6 不同濃度的TEF 對羥基自由基的清除活性Fig.6 The scavenging activity of different concentrations of TEF on hydroxyl radicals

由圖6 可知，隨著TEF 和VC質(zhì)量濃度的增大，其羥基自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，并呈正相關(guān)，當(dāng)TEF濃度為250 μg/mL 時，羥基自由基清除率為83.28%，比同濃度的VC略低，表明其在適宜的濃度下，具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力。

2.4 抑菌活性測定結(jié)果

不同質(zhì)量濃度TEF 抑菌活性結(jié)果見表4。

表4 不同質(zhì)量濃度TEF 抑菌活性結(jié)果Table 4 The bacteriostatic activity results of TEF with different mass concentrations

由表4 可知，TEF 在一定質(zhì)量濃度下，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，而對照組無抑菌圈出現(xiàn)。TEF 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）分別為1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL，且抑菌效果隨著TEF 質(zhì)量濃度的增加不斷增強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗采用負(fù)壓協(xié)同超聲波輔助提取TEF，并經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝，得到最佳提取工藝條件為負(fù)壓0.08 MPa、超聲功率402 W、超聲時間30 min，在此條件下，TEF 得率為5.18%。TEF 抗氧化活性研究表明，隨著TEF 濃度的增加，其對DPPH 自由基和羥基自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為250 μg/mL 時，清除率分別為81.73%和83.28%，表明TEF 抗氧化能力較強(qiáng)，是一種理想的天然抗氧化劑。TEF 對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均具有一定的抑菌作用，最低抑菌濃度分別為1.0 mg/mL 和1.5 mg/mL，且隨著TEF 濃度的增加而不斷增強(qiáng)。本試驗可為TEF 的提取及應(yīng)用提供理論依據(jù)。