牛排菇多肽的酶解工藝優化

周雅情，王瑩，王昱灃

（南京農業大學食品科學技術學院，江蘇 南京 210095）

牛排菇（Fistulln hepatica），又名褐蘑菇、洋松茸、波多黎各菌、牛舌菌、豬肝菌，屬于擔子菌綱、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，是雙孢蘑菇的近緣種[1]。其菌肉厚實緊密，口味獨特，暢銷歐美諸多國家，后被我國長江中下游地區引進且成功馴化栽培。牛排菇含有豐富的蛋白質，其脂肪和膽固醇含量較低[2]。牛排菇可增加礦物質含量[3]，降低肌肉蛋白質的損失、抑制胸腺萎縮和減少類風濕性關節炎的發生[4]。此外，研究者發現牛排菇不僅能預防腫瘤[5]，還能通過生成白細胞介素來調節腸道免疫力[6]。牛排菇的營養功能和潛在的多種藥用價值賦予其廣闊的市場開發前景。

食用菌源多肽的研究近年來得到重視，相關多肽的提取研究和功能性價值被不斷報道，如利用靈芝水解物可分離出抗氧化肽[7]，從羊肚菌中可發現一種具有腫瘤預防功能的新型多肽等[8]。食用菌源多肽不僅分子量小容易被人體吸收，且其食用安全，用于疾病預防和治療時，對人體沒有副作用，可以替代很多藥物用于人體治療[9]。但牛排菇多肽方面的研究目前鮮有報道，僅見劉瑩[10]利用耗時較長的水提醇沉法獲得該多肽。關于多肽的提取主要有酶解法、發酵法、化學合成法[11]。發酵法是利用微生物在適宜條件下發酵產生的蛋白酶將原料代謝分解成多肽等小分子，此方法成本低但是過程不易于控制，生成的產物具有不確定性[12]。化學合成法則對技術要求高，工藝繁瑣，多不被采用。酶解法在食品和生物醫藥業中應用性很高，因為酶解的過程中不會加入有機溶劑，也不會產生對人體有毒害的物質，整個反應體系便于調控[13]。因此本研究擬以珍稀食用菌——牛排菇為原料，采用酶解法進行多肽提取，通過對反應時間、底物濃度、pH 值、溫度、加酶量進行考察，利用響應面試驗優化多肽提取工藝，以期為后續該多肽的活性研究及相關功能產品的開發提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛排菇：市售；氫氧化鈉、甲醛（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司；鹽酸（分析純）：南京化學試劑有限公司；酸性蛋白酶（10 000 U/g）、堿性蛋白酶（20 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）、木瓜蛋白酶（80 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；胰酶（4 000 U/g）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水槽（DK-8D 型）：上海森信實驗儀器有限公司；電子天平（CP124C）、pH 計（STARTER 3100）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE）：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；離心機（TDZ5-WS）：長沙湘智離心機儀器有限公司；高速多功能粉碎機（RHP-400）：浙江永康市榮浩工貿有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛排菇多肽提取工藝

將牛排菇清洗干凈后在50 ℃下烘干，粉碎，過100 目篩。稱量1.00 g 蘑菇粉，根據不同底物濃度加入水后混勻，放置在指定溫度的水浴鍋中預熱10 min，用1 mol/L NaOH 和HCl 溶液調節至適宜pH 值，然后根據一定的加酶量加入對應的蛋白酶，再次混勻后放置水浴鍋中水浴一定時間。水浴結束后在100 ℃下滅酶10 min，冷卻后在4 000 r/min 下離心20 min，取上清液得粗多肽[14]。

1.3.2 蛋白酶篩選

將酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶分別在各自的最適pH 值和最適溫度下對牛排菇進行酶解，各自最適條件見表1[15]。根據1.3.1步驟，加酶量設為3 000 U/g，每隔1 h 測定不同蛋白酶對酶解過程中水解度的影響，持續6 h，篩選出最佳蛋白酶[16-17]。

表1 不同蛋白酶最適的pH 值和溫度Table 1 Optimal pH value and temperature of different proteases

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 反應時間對酶解效果的影響

固定底物濃度為4%，溫度為45 ℃，pH 值為7，加酶量3 000 U/g，分別設置反應時間為1、2、3、4、5、6 h，以水解度為指標，考察不同反應時間對水解度的影響。

1.3.3.2 底物濃度對酶解效果的影響

固定pH 值為8，溫度為45 ℃，反應時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設置底物濃度為3%、4%、5%、6%、7%，以水解度為指標，考察不同底物濃度對水解度的影響。

1.3.3.3 pH 值對酶解效果的影響

當反應條件設為底物濃度為4%，溫度為45 ℃，反應時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設置pH 值為6、7、8、9、10，以水解度為指標，考察不同pH 值對水解度的影響。

1.3.3.4 溫度對酶解效果的影響

當反應條件設為底物濃度為4%，pH 值為7，反應時間4 h，加酶量3 000 U/g，分別設置溫度為40、45、50、55、60 ℃，以水解度為指標，考察不同溫度對水解度的影響。

1.3.3.5 加酶量對酶解效果的影響

當反應條件設為底物濃度為4%，pH 值為7，溫度為45 ℃，反應時間4 h，分別設置加酶量為2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g，以水解度為指標，考察不同加酶量對水解度的影響。

1.3.4 響應面試驗

根據單因素試驗結果，選擇對水解度影響較大的反應時間、底物濃度、pH 值、加酶量4 個因素為自變量，以水解度為響應值，進行Box-Behnken 試驗設計，因素水平如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗設計因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 總氮量測定

根據GB 5009.5—2016 《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定牛排菇中總氮量。

1.3.6 氨基態氮含量測定

取5 mL 酶解液，加入60 mL 去CO2水（蒸餾水超聲20 min），混勻，用0.1 mol/L NaOH 調節pH 值至8.2，加入20 mL 中性甲醛溶液（取50 mL 甲醛加入3 mL 0.5%酚酞指示劑，用0.1 mol/L NaOH 滴加至顏色變為微粉紅色，現配現用），用0.1 mol/L NaOH 調pH 值至9.2，記錄加入甲醛后所消耗的氫氧化鈉體積?？瞻讓φ沼?5 mL 水重復上述試驗，記錄加入甲醛后消耗的體積[18]。氨基態氮含量計算公式如下[19]。

式中：M 為氨基態氮含量，mg/mL；C 為氫氧化鈉濃度，mol/L；V1為空白對照加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積，mL；V2為樣液加入甲醛后消耗氫氧化鈉的體積，mL；V3為所取樣液體積mL；14 為氮元素的相對分子質量，g/mol。

1.3.7 水解度測定

水解度計算公式如下。

式中：h 為水解度，%；A 為氨基態氮含量，mg/mL；B 為總氮含量，mg/mL。

1.4 數據處理

每組試驗重復3 次，試驗結果利用SAS V8 中單因素方差分析Duncan 法進行顯著性分析，并用Origin 8.5 軟件作圖。通過Design-Expert 8.0.6 設計響應面試驗，并對試驗數據進行方差分析及二次多項式回歸擬合，當P＜0.05 時，結果具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶篩選

胰酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶5 種酶的水解度結果如圖1 所示。

圖1 不同種類酶對酶解程度的影響Fig.1 Effects of different kinds of enzymes on the degree of enzymatic hydrolysis

由圖1 可知，在同一時間下，幾種酶對牛排菇酶解的程度依次為胰酶＞木瓜蛋白酶＞堿性蛋白酶＞胃蛋白酶＞酸性蛋白酶。因為不同酶的酶切位點不同，酶解效果不一樣，結果顯示胰酶水解度明顯高于其他4 種酶，所以選擇胰酶對牛排菇進行酶解。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 反應時間對水解度的影響

不同反應時間對酶解效果的影響如圖2 所示。

圖2 不同反應時間對酶解效果的影響Fig.2 Effects of different reaction times on enzymatic hydrolysis

由圖2 可知，隨著反應時間延長，水解度增加，到達5 h 后雖有所下降，但是并不顯著（P＞0.05）。因為酶解時間過短，酶與底物的接觸時間不足，影響酶解效果，當酶解時間過長，則酶解過度，使多肽分解成小分子氨基酸。又因為4 h 與5 h 的水解度并沒有顯著差異（P＞0.05），從節能節時角度考慮，4 h 可作為酶解時間的中心點。

2.2.2 底物濃度對水解度的影響

不同底物濃度對酶解效果的影響如圖3 所示。

圖3 不同底物濃度對酶解效果的影響Fig.3 Effects of substrate concentrations on enzymatic hydrolysis

由圖3 可知，隨著底物濃度增加，水解度先增加后降低，在底物濃度為4%時水解度達到最大。當底物濃度太大時，酶與底物不能充分接觸，導致反應不完全，而當底物濃度太小時，酶的濃度被稀釋，影響了酶解反應的進行[20-21]。因此選擇3%、4%和5%作為底物濃度的3 個水平進行后續試驗。

2.2.3 pH 值對水解度的影響

不同pH 值對酶解效果的影響如圖4 所示。

圖4 不同pH 值對酶解效果的影響Fig.4 Effects of different pH values on enzymatic hydrolysis

由圖4 可知，水解度隨著pH 值的增大先升高后降低。每種酶都有最適pH 值范圍，過高或過低都會直接影響酶活，當pH 值大于7 時，酶的生物活性下降，其酶解能力也隨之下降[22]。所以選擇6、7、8 作為pH 值的3 個水平進行后續試驗。

2.2.4 溫度對水解度的影響

不同溫度對酶解效果的影響如圖5 所示。

圖5 不同溫度對酶解效果的影響Fig.5 Effects of different reaction temperatures on enzymatic hydrolysis

由圖5 可知，隨著反應溫度的升高，其水解度先升高后降低，在45 ℃達到最高點。因為溫度適當上升，可以增加酶活力，提高酶促反應速率，但是溫度過高會破壞酶的結構，使得酶活性降低[23]。因此選擇45 ℃作為后續試驗的最適溫度，不再對反應溫度進一步優化。

2.2.5 加酶量對水解度的影響

不同加酶量對酶解效果的影響如圖6 所示。

圖6 加酶量對酶解效果的影響Fig.6 Effects of different enzyme additions on enzymatic hydrolysis

由圖6 可知，隨著加酶量的增加，底物水解度不斷升高，超過8 000 U/g 后增加不顯著（P＞0.05），這是因為隨著加酶量增加，酶與底物結合位點不斷增加，水解程度不斷加大，但是當加酶量達到一定程度，結合位點趨向飽和，繼續提高加酶量也不會提升水解效果[24]。又因為加酶量在8 000 U/g 與10 000 U/g 時不顯著（P＞0.05），所以選擇加酶量6 000、8 000、10 000 U/g 3 個水平進行后續試驗。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗結果

Box-Behnken 設計試驗方案和結果見表3，方差分析見表4。

表3 響應面試驗方案與結果Table 3 Response surface experimental design and results

表4 響應面試驗設計方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface experimental design

采用Design-Expert.8.0.6 軟件得到響應值與各影響因素之間的二元多項式回歸方程：水解度=57.41+1.44A-2.11B+2.55C+1.31D+0.13AB+0.11AC-1.21AD-0.088BC-0.13BD+0.66CD+0.91A2-0.053B2+0.092C2-0.97D2。

續表3 響應面試驗方案與結果Continue table 3 Response surface experimental design and results

通過表4 結果可知，該模型P＜0.000 1＜0.01 說明該響應面擬合模型極顯著，可以較好地反映試驗因素對響應值的影響，失擬項P=0.363 7，不顯著（P＞0.05），說明回歸模型擬合程度良好，非試驗因素對試驗結果影響較小。決定系數R2值越接近1，說明模型的預測值與實際值越接近，該模型R2=0.982 3，矯正后模型決定系數R2Adj=0.964 5，說明該回歸方程擬合度較好，可以用此模型分析和預測各因素對水解度的影響。由F值得到各因素對水解度影響的主次順序為C>B>A>D，所以對牛排菇多肽的水解度影響最大的是加酶量，然后是底物濃度、反應時間，最后是pH 值。由回歸方程和方差分析可知，模型中各因素對水解度的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）；對于交互項因素而言，AD 交互作用極顯著（P＜0.01）、CD 因素的交互作用顯著（P＜0.05）。對于二次項因素而言，A2、D2因素的交互作用均極顯著（P＜0.01）。

2.3.2 工藝優化與驗證試驗

為了進一步確定提取的最佳工藝條件，利用Design-Expert 8.0.6 分析，最終分析得到牛排菇多肽的最佳提取工藝條件為反應時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量9 998.11 U/g、多肽水解度的預測值為59.97%?？紤]實際情況，調整提取工藝為反應時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。為檢驗試驗結果與真實情況的一致性和可靠性，進行3 次驗證試驗，在最佳工藝條件下，水解度實測值為59.17%，與預測值相差0.8%，該響應面法優化所得的最佳工藝條件有較好的實際應用價值。

3 結論

本研究以牛排菇為原料，利用胰酶進行酶解獲得其多肽，在單因素試驗的基礎上，對酶解工藝進行響應面優化，得到最優條件：反應時間5 h、底物濃度5%、酶解pH8、加酶（胰酶）量10 000 U/g。在最優工藝條件下牛排菇多肽的水解度與理論值接近，該響應面模型準確可靠，具有實際應用價值。本文對牛排菇多肽的深入研究提供了試驗基礎，后續將進而探究牛排菇多肽的特性和生物活性。