紅莧菜總黃酮超聲波輔助提取工藝優化及其抗氧化、抑菌活性

楊金鳳，陳偉玲，呂錦萍

（賀州學院食品與生物工程學院，廣西 賀州 542899）

紅莧菜（Amaranthus tricolor L.），學名莧菜，別名雁來紅、紅菜、老少年，為莧科一年生草本植物[1]。具有清肝明目、降血脂、心臟保護和消腫解毒的功效，常以其葉片、根入藥，治療赤白痢疾、絳蟲、黃疽等[2]。目前關于該植物的研究涉及天然紅色素的提取，浸泡酒制作工藝的優化、化學成分組成以及提取物具有中樞神經系統抑制和抗焦慮活性等方面[3-4]，有關總黃酮類物質及其活性的研究鮮見報道。總黃酮類化合物，是以糖苷或游離態形式存在于自然界的一類特殊化合物，是植物界較常見且分布廣的天然活性成分，具有抗癌抑菌、消炎鎮痛、抗氧化、抗輻射、保護心血管、降脂等生理功效[5-6]。

在莧屬植物中總黃酮可從根、莖、葉等部位中進行提取，其方法主要包括熱水提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法等[7]。研究表明，超聲波輔助提取過程會產生空化、振動、粉碎、攪拌等綜合效應，可以提高細胞壁破碎速度增加溶劑滲透作用，達到提取細胞內容物的目的，能有效提高天然產物成分的提取率[9]。因此，本試驗擬采用超聲輔助乙醇提取法對紅莧菜總黃酮的提取工藝參數進行優化，并研究其抗氧化及抑菌活性，以期為今后紅莧菜的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅莧菜：市售；三氯化鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：茂名市雄大化工有限公司；蘆丁標準品（分析純）、青霉素（分析純）：青島克斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）、抗壞血酸（分析純）：天津鴻鑫化學藥品有限責任公司。

JE1103CE 電子天平：梅特勒-托利多國際有限公司；R-1010 旋轉蒸發器：耀特設備科技有限公司；V-5600（PC）型紫外可見分光光度計：元析儀器國際有限公司；KKRQ-409B 電導率儀：北京儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制

分別吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 蘆丁標準溶液儲備液于25 mL 比色管中，向其加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10%三氯化鋁溶液靜置6 min，最后加入4.0 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻后靜置15 min[10]，空白對照使用75%乙醇溶液，將以上8 個不同濃度的蘆丁溶液于510 nm波長處測定對應吸光值；以蘆丁質量濃度為x 軸，吸光度為y 軸，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.008 7x+0.097 5，R2=0.996 5。

1.2.2 紅莧菜中總黃酮的提取

取2.0 g 紅莧菜樣品粉末，加入50 mL 乙醇溶液，60 ℃超聲輔助提取1.5 h，吸取1.0 mL 提取液，按照1.2.1 的方法，在波長為510 nm 條件下測定樣品的吸光值，依據標準曲線計算總黃酮含量。

1.2.3 單因素試驗

1）固定提取時間2.0 h、料液比1∶30（g/mL），改變提取溫度條件（40、50、60、70、80 ℃），進行超聲輔助提取，并測定紅莧菜總黃酮提取量，考察提取溫度對總黃酮提取量的影響。

2）保持提取溫度70 ℃不變，在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）條件下超聲輔助提取2.0 h，測定總黃酮提取量，考察料液比對總黃酮提取量的影響。

3）固定提取溫度為70 ℃，料液比為1∶40（g/mL），考察提取時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 時對總黃酮提取量的影響。

1.2.4 正交試驗

根據各單因素試驗的結果，以提取溫度、料液比、提取時間為考察因素，以總黃酮提取量為指標，利用正交試驗優化得到最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 抗氧化活性測定

DPPH 自由基清除能力測定，參照張曉婷等[11]的方法，按下列公式計算DPPH 自由基清除率X（%）。

式中：Ai為樣品溶液的吸光值；Aj為95%乙醇溶液的吸光值；A0為95%乙醇和DPPH 工作液的吸光值。

還原能力測定參考馬洪鑫等[12]的方法稍作修改，1 mL 樣品中加入濃度0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再加入質量分數1%鐵氰化鉀2.5 mL，充分混勻，50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，3 000 r/min 離心10 min，最后加入2.5 mL 蒸餾水、0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，以未加樣品液的反應溶液作為參比溶液，測定700 nm 處吸光值。

1.2.6 抑菌活性測定

取最佳工藝獲得的紅莧菜總黃酮，以30%乙醇配制相應質量濃度菌懸液為處理組，以無菌培養基作為空白對照組，以沒有加紅莧菜總黃酮處理的菌懸液為對照組，以30%乙醇溶液為陰性對照，青霉素為陽性對照。最低抑菌濃度測定采用二倍稀釋法[13]，按下列公式計算抑制率Y（%）。

式中：C2為處理組的吸光值；C1為對照組的吸光值；C0為空白對照組的吸光值。

1.2.7 體外抑菌作用機制

將一定量培養到對數期的金黃色葡萄球菌，接種至含有液體培養基的錐形瓶中，分別加入稀釋后的紅莧菜總黃酮提取液。搖床培養，每小時取菌液4 mL，4 500 r/min 條件下離心10 min 收集上清液，用紫外可見分光光度計于260 nm 和280 nm 處測量吸光值[14]。參考文獻[15]的方法使用電導率儀測量溶液的電導率。

1.3 數據處理

試驗數據統計分析采用SPSS 25.0、Origin 9.0 等軟件進行數據處理及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

紅莧菜總黃酮提取的單因素試驗結果見圖1。

圖1 紅莧菜總黃酮提取單因素試驗結果Fig.1 Single factor test results for extraction of flavonoids from Amaranthus tricolor L.

由圖1 可知，提取溫度在40～80 ℃時，總黃酮提取量隨提取溫度的升高先增大后減小，總體增幅較小，50 ℃時提取效果最好，總黃酮提取量達到1.303 mg/g，此后隨著提取溫度的繼續升高，總黃酮提取量緩慢下降。由此說明，提取溫度過高或過低都會影響提取效果。適當地升高提取溫度，有利于加快分子的擴散運動，進而加快料液兩相間的混合及總黃酮物質的溶出，當提取溫度高于50 ℃，總黃酮提取量開始下降，這可能是由于溶劑在提取過程中隨溫度的升高而揮發，以及在高溫狀態下總黃酮物質發生分解[16]，因此確定提取溫度為50 ℃最佳。

料液比為1∶40（g/mL）時，總黃酮提取量達最高值1.192 mg/g，之后繼續增加溶劑量，總黃酮提取量反而呈下降趨勢。其原因推測為溶劑量較少時紅莧菜中的總黃酮與乙醇接觸面積較小，溶出的總黃酮類物質總黃酮濃度較低；隨著溶劑量的增加，乙醇與紅莧菜中的總黃酮接觸面積增大，總黃酮溶解度增大，總黃酮提取量也隨之增高；但乙醇溶液的量過多，脂溶性雜質等含量也相對增加，從而影響總黃酮提取量[17]。因此，最佳料液比為1∶40（g/mL）。

紅莧菜中總黃酮提取量隨著提取時間的延長先增大后減小，當提取2.0 h 時，總黃酮提取量最高，為1.290 mg/g，提取時間繼續延長而總黃酮提取量逐漸降低。說明長時間加熱提取會破壞總黃酮類活性成分，降低其穩定性，加速溶劑乙醇的揮發，影響提取效果[18]，因此，確定紅莧菜的最佳提取時間為2.0 h。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果，以總黃酮提取量為評價指標，選擇提取時間、料液比、提取溫度3 個因素，進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗分析方案及結果Table 2 Scheme and results of orthogonal test

由表2 可知，影響紅莧菜總黃酮提取量的因素主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間，根據正交試驗的結果，可確定最佳的提取條件為A2B2C3，即提取時間為2.0 h，料液比為1∶40（g/mL），提取溫度為70 ℃，進一步根據最優方案進行3 次平行試驗，得到紅莧菜總黃酮提取量平均值為1.498 mg/g，優化后的提取方案重復性好，總黃酮提取量高于正交試驗結果，表明本試驗得出的最佳工藝結果具有可靠性。

2.3 抗氧化能力

紅莧菜總黃酮和抗壞血酸對DPPH 自由基清除效果見圖2。

圖2 紅莧菜總黃酮和抗壞血酸對DPPH 自由基清除效果Fig.2 DPPH free radical scavenging activities of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid

由圖2 可知，在考察的質量濃度范圍內，紅莧菜總黃酮提取物對DPPH 自由基具有較好的清除能力（IC50值為38.5 μg/mL），但是弱于抗壞血酸，這可能是提取液中含有的色素及脂類的干擾，降低了其抗氧化活性。

紅莧菜總黃酮和抗壞血酸的還原能力見圖3。

圖3 紅莧菜總黃酮和抗壞血酸的還原能力Fig.3 Reducing power of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.and ascorbic acid

由圖3 可知，不同質量濃度總黃酮提取液對Fe3+均有較強的還原能力，且總黃酮提取物的還原能力呈濃度依賴性增加。當樣品質量濃度為80.00 μg/mL 時，與陽性對照溶液的還原能力相近。這可能是總黃酮類物質與反應體系中的金屬離子發生強烈的螯合反應，從而更好地將三價鐵離子還原為亞鐵離子，進而展現出良好的抗氧化活性[19-20]。

2.4 抑菌能力

紅莧菜總黃酮提取物對微生物的抑制作用見表3。

表3 紅莧菜總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effect of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on Staphylococcus aureus

由表3 可知，隨著紅莧菜總黃酮體積分數的增加，對金黃色葡萄球菌的抑菌效果不斷增強。當體積分數為50.0%時，抑菌圈直徑為7.0 mm，抑菌效果比較明顯，當體積分數達到100.0%時，抑菌效果最強。可見，高體積分數的黃酮類化合物對細菌的抑菌效果較好。基于上述結果，進一步考察提取物的最小抑菌濃度，結果見表4。

表4 不同濃度紅莧菜總黃酮對金黃色葡萄球菌生長的抑制作用Table 4 Inhibitory effects of different concentrations of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on the growth of Staphylococcus aureus

由表4 可知，紅莧菜總黃酮夠明顯抑制金黃色葡萄球菌的增殖，隨著濃度的增大生長抑制率逐漸增強，當以濃度為2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 的紅莧菜總黃酮提取液處理時，其抑菌率分別為15.0%、39.5%、89.8%和95.6%，當其濃度為40.00 mg/mL 時，抑制率達到了100.0%，即紅莧菜總黃酮對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為40.00 mg/mL。

2.5 抑菌機制

細胞膜保持了細胞內外滲透壓的平衡，當菌體受到外界侵害時，細胞膜的通透性和完整性受到損傷，使菌細胞內容物（蛋白質和核酸）大量泄漏，導致電導率增加[21]，因此細胞內核酸、蛋白質和電導率的變化是表征細胞膜破裂的3 個重要指標[14]。紅莧菜總黃酮對細胞膜通透性和電導率的影響見圖4。

圖4 紅莧菜總黃酮對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性和電導率的影響Fig.4 Effects of total flavonoids from Amaranthus tricolor L.on cell membrane permeability and conductivity of Staphylococcus aureus

由圖4 可知，紅莧菜總黃酮提取物處理后的金黃色葡萄球菌在260 nm 和280 nm 處的吸光值與未添加提取物的對照組相比明顯增加，并隨著提取液濃度的增大和處理時間的延長而增多，表明提取物引起了菌體細胞內蛋白和核酸泄露。同樣，未添加紅莧菜總黃酮提取物的對照組，菌懸液中電導率增長緩慢，當提取物作用于金黃色葡萄球菌180 min 后其電導率與對照組相比增加了74.3%，這表明紅莧菜總黃酮提取物是通過破壞細菌的細胞膜從而抑制其生長。

3 結論

本試驗采用正交試驗法優化了紅莧菜總黃酮提取工藝。結果顯示最優提取工藝為提取時間2.0 h、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度70 ℃，在該工藝條件下，紅莧菜中的總黃酮提取量高達1.498 mg/g。此外，紅莧菜總黃酮提取物顯現出了較強的DPPH 自由基清除能力和還原能力，且抗氧化活性隨著提取液質量濃度的增加而升高。由最低抑菌濃度試驗結果可知，紅莧菜總黃酮提取物對金黃色葡萄球菌具有抑制效果。通過抑菌機理試驗可知，紅莧菜總黃酮提取物通過破壞細胞膜通透性或完整性，導致菌懸液中電導率增大，大分子物質濃度上升明顯，進而抑制細菌生長。綜上，紅莧菜總黃酮提取物表現出了較強的體外抗氧化能力和抑菌活性，后期將對其在抗氧化和抑菌活性的構效關系和相關分子機理進行深入研究。