免疫磁珠結合顯色平板快速檢測嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌

王磊，張潔，張文馨，崔曉雅

（天津市食品安全檢測技術研究院，天津 300308）

克羅諾桿菌屬（Cronobacter spp.），原名為阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii），2008 年被重新命名劃分為克羅諾桿菌屬，目前共包括7 個種，是一種革蘭氏陰性無芽胞桿菌，有鞭毛，兼性厭氧，廣泛存在于自然環境中。阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）是該菌屬中最主要的一種條件致病菌，其具有一定的耐熱和耐干燥性，可以在水分含量較低的環境中長時間存活，極易在加工生產過程中對嬰兒配方奶粉造成污染，繼而造成新生兒和嬰幼兒的嚴重感染[1-3]。為應對此類風險，我國在現行食品安全國家標準中，對克羅諾桿菌屬的限量進行了嚴格的規定，同時對相應的檢驗方法也作出了要求。傳統的檢驗方法較為復雜，包括增菌、分離、純化、鑒定等步驟，檢驗周期過長的問題限制了其在實時快速監測領域中的應用。

免疫磁珠分離技術基于抗原抗體反應及磁力學原理，可以將目標微生物從成分復雜的樣品基質中分離出來并保持其生物活性，具有縮短檢測時間、提高檢出率等優勢。該項技術現已被應用于金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌等多種細菌的檢測中，與實時熒光聚合酶鏈反應、酶聯免疫吸附、量子點熒光標記等其它分析手段的聯合研究也取得了良好的進展[4-7]。目前用于檢測致病性大腸埃希氏菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌等致病菌的免疫磁珠已經實現商品化，但大多數為國外進口產品[8]，價格較高，不易于普及，因此國產高質量的致病菌免疫磁珠生產工藝亟待發展。對于該技術在檢測阪崎克羅諾桿菌方面的應用，重點則在于突破增菌等前處理環節耗時長和實際樣品污染水平低的問題[9-10]，因此制備高特異性免疫磁珠和選擇合適的后續技術與之相匹配，成為了需要解決的核心關鍵點。

本研究利用阪崎克羅諾桿菌顆粒抗原免疫新西蘭大耳兔，獲得特異性多克隆抗體，將抗體純化后，與經過活化的納米級羧基磁珠偶聯結合，制備免疫磁珠，并對其制備工藝進行優化。以此為基礎，對免疫磁珠的選擇性捕獲能力進行研究，改進傳統前處理方式，選用顯色培養基作為后續分離材料，開發出免疫磁珠-顯色平板檢測方法，對其實際應用效果進行評價。以期建立一種高特異性、高靈敏度的檢測方法，實現對嬰兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌的快速定量分析，同時為免疫磁珠技術結合其它檢測技術的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰兒配方奶粉：市售；新西蘭大耳兔：山東艾萊克生物科技有限公司；Affimag PSC 磁性微球（羧基修飾，0.1～0.5 μm）：天津市倍思樂色譜技術開發中心；阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）ATCC29544、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027、單核細胞增生增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）ATCC19115：美國模式菌種收集中心；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）CMCC（B）50115、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）CMCC（B）44103：中國醫學細菌保藏管理中心。

緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）、阪崎腸桿菌顯色培養基、營養瓊脂：北京陸橋技術股份有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、嗎啉乙磺酸一水合物[2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid monohydrate，MES]、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 [1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC]、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：北京索萊寶科技有限公司；無水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GNP-9270 型隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；MaxQ 6000 制冷型搖床、Multiskan GO全波長酶標儀：美國Thermo 公司；WGZ-2-XJ 型細菌濁度計：上海昕瑞儀器儀表有限公司；Dynabeads MX Mixer 磁珠混合儀：Life Technologies 公司；Centrifuge 5417R 臺式離心機：Eppendorf 公司；明澈-D 24 UV 型超純水機：美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 多克隆抗體的制備

將阪崎克羅諾桿菌顆粒性抗原與佐劑按照體積比1∶1 混合，免疫劑量為106CFU/只。采用耳緣靜脈注射方式，每隔21 d 對4 只健康雌性新西蘭大耳兔（3～5 kg 左右）進行免疫，連續4 次，最后1 次免疫完成后進行頸動脈采血，將所得血液立即注入無菌錐形瓶中，4 ℃過夜，次日4 ℃、5 000 r/min 離心30 min 獲得抗血清。將抗血清加入辛酸和硫酸銨進行粗純化[11]，采取Protein A/G 親和層析柱法[12]進行二次純化，制得純化后的抗體，-20 ℃保存備用。

1.3.2 免疫磁珠的制備與偶聯條件優化

取1 mg 羧基修飾磁性微球至離心管，用500 μL MES 吐溫溶液（0.01 mol/L，pH6.0，0.05%吐溫-20）洗滌3 次。之后分別加入100 μL 的5 mg/mL EDC 和NHS溶液，振蕩保持磁珠懸浮，37 ℃活化45 min，磁分離后去除上清液。最后加入500 μL MES 吐溫溶液重新懸浮并洗滌2 次，去除上清液。

將1 mg 已活化的磁珠與500 μg 多克隆抗體混合，用MES 溶液（0.01 mol/L、pH6.0）調節總體積至500 μL，37 ℃振蕩反應，期間保持磁珠懸浮，經不同反應時間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）后，磁分離并回收上清液，采用BCA 蛋白測試盒測定上清液中剩余抗體含量，根據公式（1）計算偶聯率，確定磁珠與抗體的最佳偶聯時間。按以上方法，改變溫度（4、15、25、37、42、45 ℃），反應至合適時間，確定最佳偶聯溫度；改變抗體添加量（50、100、150、200、250、300、350、400 μg），與磁珠在合適溫度和時間下反應，根據公式（2）計算偶聯量，確定抗體最佳添加量，所有試驗設置3 個平行。

式中：R 為偶聯率，%；Ca為偶聯后上清液抗體濃度，mg/mL；Cb為偶聯前添加抗體濃度，mg/mL。

式中：Mc為偶聯量，μg；M 為抗體添加量，μg；R 為偶聯率，%。

磁珠偶聯后用500 μL MES 溶液洗滌2 次，加入1 mL 0.04 mol/L 含1%BSA 的硼酸鹽吐溫溶液（pH 9.0，0.05%吐溫-20），重懸磁珠，37 ℃振蕩封閉45 min。最后將磁珠洗滌后，加入200 μL 磷酸鹽吐溫溶液（0.01 mol/L，pH7.4，0.05%吐溫-20），重懸磁珠，4 ℃保存[13-16]。

1.3.3 免疫磁珠敏感性的評價

利用比濁法調整阪崎克羅諾桿菌菌液濃度為1010、109、108、107、106、105、104、103CFU/mL，各取100 μL分別與0.4 mg 的免疫磁珠混合于1.5 mL 無菌離心管中，BPW 定容至1 mL；常溫振蕩反應45 min，磁分離3 min，棄上清液，加入0.5 mL 磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4）洗滌磁珠3 次，再加入1 mL 緩沖液振蕩重懸磁珠；將磁珠重懸液稀釋至合適梯度后，取100 μL 涂布于阪崎克羅諾桿菌顯色平板36 ℃、24 h 培養計數，每個免疫磁珠添加量設置3 個平行，并以不添加免疫磁珠的菌液為空白對照，根據公式（3）計算捕獲率。

式中：E 為捕獲率，%；N 為磁珠重懸液菌落總數，CFU/mL；N0為空白對照液菌落總數，CFU/mL。

1.3.4 免疫磁珠特異性的評價

將阪崎克羅諾桿菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌菌株于營養肉湯36 ℃培養過夜，比濁法調整菌濃度至106～107CFU/mL，按1.3.3 的方法操作，與免疫磁珠進行混合反應，磁珠重懸液涂布營養瓊脂平板36 ℃、48 h 培養，計算捕獲率。

1.3.5 免疫磁珠-顯色平板檢測方法的建立及對嬰兒配方奶粉的應用

取100 g 市售嬰兒配方奶粉（阪崎克羅諾桿菌陰性）加入到900 mL 緩沖蛋白胨水中，模擬樣品實際污染情況，接種1 mL 稀釋至相同數量級濃度的阪崎克羅諾桿菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌混合菌液，使樣品目標菌及背景菌濃度為102、103、104CFU/g；取0.4 mg 免疫磁珠與1 mL 模擬樣品液均勻混合，按1.3.3 操作，最終將免疫磁珠完全涂布顯色平板，培養并計算捕獲率。每個菌濃度設置3 個平行，以不添加免疫磁珠的樣品液為空白對照。

2 結果與分析

2.1 磁珠與抗體偶聯條件優化

2.1.1 偶聯時間對偶聯量的影響

圖1 為偶聯時間對活化磁珠與抗體偶聯量的影響。

圖1 偶聯時間對偶聯效果的影響Fig.1 Influence of coupling time on coupling effect

用BCA 法蛋白測試盒檢測上清液中剩余抗體的含量，因為吸光度與蛋白質濃度成正比[17]，所以用吸光度表征抗體含量，剩余抗體含量越低，則偶聯效果越好。由圖1 可知，偶聯時間在0.5～1.5 h 內，上清液剩余抗體量遞減迅速，當超過2.0 h 后，上清液抗體量趨向穩定，說明結合到磁珠表面的抗體量在2.0 h 左右達到飽和。因此，選擇2.0 h 作為活化磁珠與抗體的偶聯時間。

2.1.2 偶聯溫度對偶聯量的影響

圖2 為偶聯溫度對活化磁珠與抗體偶聯量的影響。

圖2 偶聯溫度對偶聯效果的影響Fig.2 Influence of coupling temperature on coupling effect

由圖2 可知，在偶聯溫度為4～15 ℃時，活化磁珠與抗體之間的偶聯反應受到抑制，吸光度變化不明顯，且觀察到磁珠不易分散，甚至產生顆粒狀沉淀的情況，不利于原料的充分利用。在偶聯溫度為15～37 ℃時，吸光度明顯降低，表明偶聯到磁珠上的抗體量開始增加。當偶聯溫度超過37 ℃，吸光度再次趨向穩定，表明偶聯溫度高于37 ℃時可有效促進抗體在磁珠表面的結合，達成最佳反應效果，從節能角度考慮，選擇37 ℃作為偶聯的最適溫度，同時37 ℃時抗體能保持較好活性，制得的免疫磁珠在溶液中分散性良好。

2.1.3 抗體添加量對偶聯率和偶聯量的影響

圖3 和圖4 為抗體添加量對偶聯率和偶聯量的影響。

圖3 抗體添加量與偶聯率的關系Fig.3 Relationship between the dosage of antibody and the coupling efficiency

圖4 抗體添加量與實際偶聯量的關系Fig.4 Relationship between the dosage of antibody and the actual coupling amount

由圖3 和圖4 可知，當抗體添加量在50～200 μg時，每毫克活化磁珠偶聯上的抗體量逐漸增加，當抗體添加量大于200 μg 時，磁珠和抗體的偶聯率不再上升，并開始下降，此時1 mg 磁珠實際結合的抗體量為182.77 μg，且隨著抗體量的增加而穩定在200 μg 左右，不再明顯增加或減少，說明1 mg 磁珠與200 μg 抗體偶聯已接近飽和狀態。對于單位質量的磁珠，其表面的活性基團有限，在抗體添加到一定程度后，磁珠表面所偶聯的數量已達到最大值，偶聯量不會繼續增加，再加入過多的抗體則造成浪費[18]，所以選取200 μg作為偶聯1 mg 磁珠的最佳抗體添加量。

2.2 免疫磁珠敏感性評價

圖5 為不同菌濃度下免疫磁珠對阪崎克羅諾桿菌的捕獲率。

圖5 菌濃度與捕獲率的關系Fig.5 Relationship between bacterial concentration and capture efficiency

由圖5 可知，當菌濃度對數值為1.58（菌濃度為38 CFU/mL）時，菌體捕獲率較低，僅為54.4%，但免疫磁珠仍能有效分離出目標菌，這可能是由于目標菌在磁珠清洗和吸取過程中有所損失。當菌濃度對數值為2.49～7.63（菌濃度為3.12×102～4.24×107CFU/mL）時，免疫磁珠對阪崎克羅諾桿菌的捕獲率為68.4%～82.4%，且捕獲效果穩定。當菌濃度對數值大于7.63（菌濃度為4.24×107CFU/mL）時，實際捕獲量達到飽和，捕獲率開始急劇下降，結果顯示在1 mL 純培養體系中，免疫磁珠有效捕獲目標菌的菌濃度范圍為102～107CFU/mL，表明免疫磁珠對阪崎克羅諾桿菌具有良好的靈敏度。

2.3 免疫磁珠特異性評價

圖6 為免疫磁珠和阪崎克羅諾桿菌及各種非目標菌的交叉反應情況。

圖6 免疫磁珠與各菌種的交叉反應情況Fig.6 Cross-reaction of immunomagnetic beads with various bacteria

在菌濃度為106CFU/mL 的條件下，對免疫磁珠的抗干擾性能進行測定。由圖6 可知，免疫磁珠對鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、單增李斯特氏菌交叉反應率均低于5%；同時和大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌存在一定的交叉反應，交叉反應率低于10%，此類和非目標菌較低的干擾反應，可進一步通過其它手段排除影響；而相同條件下，免疫磁珠對于目標菌的有效捕獲率高達78.8%，具有明顯的優勢性，表明其針對阪崎克羅諾桿菌的特異性良好。

2.4 免疫磁珠-顯色平板檢測方法的建立及應用分析

為更好的覆蓋到微量目標菌，設計保留了樣品接種量、稀釋液[19]等傳統方法框架，并且以制備的高敏感性和特異性免疫磁珠為主體，直接利用富集分離技術代替國標方法的增菌培養過程。考慮到捕獲過程中與其他背景菌可能產生的交叉反應，采用了選擇性較好且結果直觀的阪崎腸桿菌顯色培養基[20]作為后續分離目標菌菌落的載體，從而建立了免疫磁珠-顯色平板檢測方法，以達到有效區分和抑制其他菌株生長并提高檢出率的目的。

在日常檢測中，嬰兒配方奶粉中微生物及阪崎克羅諾桿菌的污染水平較低，所以人工污染樣品使其目標菌及背景菌濃度達到102、103、104CFU/g，模擬實際樣品的檢測情況。

表1 為免疫磁珠分別在1 mL 目標菌純培養體系和模擬樣品體系中對阪崎克羅諾桿菌的捕獲效果比較。

表1 不同樣品基質中免疫磁珠捕獲效果的比較Table 1 Comparison of the capture effect of immunomagnetic beads in different sample matrices

由表1 可知，當奶粉中添加的阪崎克羅諾桿菌濃度為104～105CFU/g 時，免疫磁珠的捕獲率為66.2%，與純培養條件下相比，出現了較大幅度的降低；阪崎克羅諾桿菌濃度為102～104CFU/g 時，樣品體系中的捕獲率下降幅度較小，維持在70%左右；免疫磁珠在不同基質中的捕獲效果存在一定差距，說明其特異性捕獲能力在一定程度上，受到了奶粉樣品基質和背景雜菌因素的干擾影響，但其捕獲率仍在有效范圍內。

3 結論

本研究在篩選免疫磁珠的最適反應溫度、反應時間和抗體添加量時發現，反應在30～45 ℃時偶聯2.0 h即可完成，表明制備工藝對控制溫度要求并不苛刻，其實際偶聯率大于90%，偶聯量大于180 μg/mg 磁珠，對抗體的利用程度較高，制備工藝簡便。在檢測方面，免疫磁珠具有良好的敏感性，對阪崎克羅諾桿菌的有效捕獲濃度范圍為102～107CFU/mL，檢測范圍較為寬泛，有利于在低污染量樣品中使用；此外，所制備的磁珠在交叉反應試驗中表現出較強的特異性，對目標菌捕獲率高達78.8%，而對其它常見細菌的反應率低于10%。當以免疫磁珠-顯色平板檢測方法處理模擬污染樣品時，在復雜的背景和基質條件下，可直接捕獲收集目標菌，在102～105CFU/g 的菌濃度范圍內，免疫磁珠捕獲率為65%以上，方法中樣品前處理用時僅需1～2 h，相比GB 4789.40—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗克羅諾桿菌屬（阪崎腸桿菌）檢驗》中的18 h+24 h 兩次增菌步驟，縮短了該項目的檢測周期。綜上，本研究建立的檢測方法對于快速實時監控嬰兒配方食品中阪崎克羅諾桿菌具有重要的應用價值。