蒸汽爆破預處理聯合殼聚糖酶制備殼三糖

郭超然，趙紅軍，蘇海鵬，黃海燕，孫建安，毛相朝

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

在自然資源和環境方面，世界正面臨前所未有的挑戰[1]。近年來，綠色高效的生產方式取得了很大的進展，特別是在可持續利用生物質生產有價值產品的領域[2]，而其中的生物技術具有環境友好性、高催化效率、底物專一性好和催化條件溫和等優勢，是一種非常有前景的方法[3]。

殼寡糖已廣泛應用于制藥、食品、農業、化妝品等領域[4-5]，如在人體健康領域，其具有抗腫瘤、降低膽固醇、增強免疫力等功能，而在農業領域，可用作生物農藥發揮抗蟲害作用[6]。研究表明，殼寡糖的生物功能與聚合度（degree of polymerization，DP）密切相關[7]。例如，殼三糖能明顯改善HepG2 細胞胰島素抵抗作用，而殼二糖和殼四糖無明顯改善效果[8]。但是目前缺乏特定的單一聚合度殼寡糖的制備方法，殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）可以酶解殼聚糖生成殼寡糖，大多數殼聚糖酶已被證明是通過內切方式產生不同聚合度的殼寡糖混合物[9]。因此，利用殼聚糖酶從殼聚糖特異性制備特定聚合度的殼寡糖引起了研究人員的關注。

殼聚糖具有廣泛且高度有序的氫鍵網絡，使其在水中的溶解度較差，酶解效率較低[10]。因此，通常需要預處理手段降低殼聚糖結晶度以提高殼聚糖酶對殼聚糖的可及性，從而促進殼聚糖的酶解[11]。目前廣泛使用的是利用稀酸溶液溶解殼聚糖的方法，但這造成了環境的污染、產物生物活性降低、純化難度大、成本高等問題，在應用上存在一定的局限性。因此，需要探索綠色的粉狀殼聚糖預處理手段，以減輕環境壓力和提高生產有效性。在預處理手段中，蒸汽爆破因其環境友好性以及其快速破壞結晶生物質的潛力引起了人們的關注[12]。在這一物理化學過程中，生物質暴露于高壓（0.5～2.5 MPa）飽和蒸汽中，隨后瞬間釋放壓力和降低溫度，破壞材料結晶結構，克服生物質降解的關鍵障礙，從而促進進一步水解，成為更高價值的產物[13]。蒸汽爆破已成為一種有創新性、環保、經濟和高效的生物質處理技術，如采用蒸汽爆破技術可提高木質纖維素生物質的酶消化率、促進木聚糖提取和木質素釋放等[14-16]，但未見有蒸汽爆破應用于殼聚糖上的報道。

此外，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）因其生物安全性（generally recognized as safe，GRAS）以及良好的生化和生理特性而被認為是理想異源蛋白表達宿主菌株[17]。由于相對較高的生長速度、清晰的遺傳背景以及在工業發酵中的穩定性，枯草芽孢桿菌成為適用于大規模工業生產的首選菌株。因此，在枯草芽孢桿菌中高效表達殼聚糖酶對其工業化應用具有重要意義。已有研究在大腸桿菌中成功表達了來自Butyrivibrio sp.MC2013 的殼聚糖酶Csn-But[18]。為了實現殼三糖的高效制備，本研究在枯草芽孢桿菌中對殼聚糖酶Csn-But 進行高效異源表達，采用蒸汽爆破預處理聯合酶催化提高酶解效率，并通過控制底物濃度來實現產物聚合度的調控。以期為難以降解的不溶性生物材料的環境友好型生物催化轉化開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

KOD 高保真酶（5 U/μL）：日本TOYOBO 公司；DNA 無縫連接試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 凝膠純化試劑盒、質粒提取試劑盒：美國QIAGEN 公司；不同分子量（Mw）殼聚糖：上海麥克林生化有限公司；不同聚合度（DP2～DP6）殼寡糖標準品：青島博智匯力生物科技有限公司；薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）板：德國Merck 公司。

大腸桿菌DH5α 感受態細胞：北京擎科生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌WB800 感受態細胞為中國海洋大學食品科學與工程學院食品生物技術實驗室自制，分別用于載體的構建和殼聚糖酶的異源表達。

殼聚糖酶Csn-But（GenBank：MK482734）的DNA序列由北京華大基因科技有限公司進行密碼子優化并合成。

1.2 儀器與設備

高壓滅菌鍋（JI80TW）：致微（廈門）儀器有限公司；超凈工作臺（BCM-1000）：蘇州凈化設備有限公司；便攜式均質機（HB-958b）：中山市上品電器有限公司；蒸汽爆破裝置（QB-200B ICSE）：河南溫柔新材料科技有限公司；恒溫搖床（QYC2112）：上海福馬設備有限公司；電泳儀（DYY-6C）：北京六一儀器公司；冷凍離心機（5804R）：德國艾本德股份公司；高效液相色譜儀（LC-20AT）、液相色譜-質譜聯用儀（1290 Infinity II UHPLC/6460 QqQ MS）：美國安捷倫公司；酶標儀（MULTISKANF FC）、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜儀（Nicolet iS10）：美國賽默飛世爾科技公司；掃描電鏡（TESCAN VEGA3）：日本日立公司。

1.3 殼聚糖酶Csn-But 的異源表達

以密碼子優化的殼聚糖酶DNA 序列作為模板進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，設計上游引物（5'-GTAACACATGCCTCAGCTGCAATGCGTAAAGAAAAAAACAAA-3'）和下游引物（5'-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTAGCGATAGCTTTCA-3'）。PCR 擴增反應體系：25 μL 2×Buffer，10 μL H2O，10 μL 脫氧核糖核酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，DNTP），上下游引物各1.5 μL，1 μL KOD 高保真酶，1 μL 目的片段（1 ng/μL）。PCR 反應程序：預變性（94 ℃10 min）、40 個擴增循環（98 ℃10 s，58 ℃30 s，68 ℃80 s）、最終延伸（68 ℃10 min）。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定后對目的片段進行回收，目的片段與載體pP43NMK（+）通過DNA 無縫連接酶連接后，通過42 ℃熱激法轉化至大腸桿菌DH5α 感受態細胞中，通過瓊脂糖凝膠核酸電泳和DNA 測序進行陽性克隆驗證。選擇測序正確的重組質粒通過電轉化法轉入枯草芽孢桿菌WB800 感受態細胞，在LB 培養基（卡那霉素抗性）中于220 r/min，30 ℃發酵30 h。在8 500×g 轉速條件下，4 ℃離心20 min 后，保留上清液，即為粗酶液。

1.4 殼聚糖酶活性測定

通過3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法檢測還原糖的含量來測定殼聚糖酶活性[19]。200 μL 反應體系包含pH5 的2%膠體殼聚糖和20 μL粗酶液，在55 ℃孵育15 min 后，加入300 μL DNS 試劑，沸水浴10 min 顯色。12 000×g 離心2 min 后，在540 nm處測定上清液吸光值，利用D-氨基葡萄糖的標準曲線計算還原糖含量。1 單位（U）的殼聚糖酶活性定義為在上述標準條件下每分鐘產生1 μmol 還原糖所需的酶量。所有試驗均進行3 次。

1.5 蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖

試驗參考文獻[20]的方法，取等量（100 g）的粉狀殼聚糖樣品在QB-200B ICSE 蒸汽爆破裝置中用不同蒸汽壓力（0、1.6、1.8、2.0、2.2 MPa 和2.4 MPa）進行蒸汽爆破處理4 min，然后迅速減壓。蒸汽爆破處理后的樣品60 ℃干燥至恒重。

1.6 表征蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖

掃描電鏡：樣品噴金后，在掃描電子顯微鏡下觀察。在20.0 kV 電壓下，分別在500×和5 000×兩個放大倍率下進行捕獲。

傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（attenuated total reflection Flouriert ransformed infrared spectroscopy，ATR-FTIR）：模式范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描100 次。

1.7 酶解蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖

采用便攜式均質機在pH5 檸檬酸緩沖液中對不同蒸汽壓力預處理的樣品進行均質，以保持均勻性。水解反應體系包含6.66 U/mL Csn-But、2%殼聚糖、20 mmol/L pH5 檸檬酸緩沖液，在55 ℃下分別水浴24 h 和48 h（反應過程中持續攪拌）后，沸水浴10 min終止反應，DNS 法測定還原糖含量，并根據還原糖含量評估最佳蒸汽壓力條件。Csn-But 水解最佳處理效果的殼聚糖，并在不同時間點（0、30 min 和1、2、4、8、12、18、24、48、72 h）取樣檢測還原糖含量，得到最佳預處理條件下的水解曲線。所有試驗均進行3 次。

1.8 特定聚合度殼寡糖的可控制備

1.8.1 殼聚糖酶Csn-But 水解殼寡糖產物分析

殼聚糖酶Csn-But 以殼寡糖[（GlcN）2～（GlcN）6]為底物在最適反應條件下反應不同時間（0.5、1.0、2.0、4.0 h）后，立即沸水浴10 min 終止反應。在異丙醇∶氨水=2∶1（體積比）作為展開劑的薄層色譜板上分離。用0.1%茚三酮溶液溶解在乙醇中噴涂，然后在110 ℃下加熱5 min 顯色。

1.8.2 底物濃度對產物聚合度的影響

將Csn-But（6.66 U/mL）在55 ℃下水解不同濃度（2%、4%和6%）的經過2.4 MPa 壓力蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖48 h，過程中持續攪拌。反應經沸水浴10 min 后終止，12 000×g 離心2 min 后，通過0.22 μm聚醚砜濾膜過濾得到殼寡糖樣品，在以下條件下采用高效液相色譜-電噴霧電離-質譜進行分析：正離子模式，流動相為乙腈∶水=2∶1（體積比），掃描速度為5 200 u/s。在全掃描質譜分析中，記錄m/z 5～1 000 范圍內數據。

1.9 數據處理

采用Origin 軟件數據進行分析。結果用平均值±標準差表示，每個樣品重復測定3 次。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶Csn-But 在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達

目的基因Csn-But 通過同源無縫連接載體pP43NMK 后，成功轉入大腸桿菌DH5α 中并進行擴增，將提取的質粒通過電轉化法成功轉入到枯草芽孢桿菌WB800 中進行表達。為了評價Csn-But 的表達水平，測定了重組枯草芽孢桿菌胞外和胞內殼聚糖酶活性。胞內殼聚糖酶活性和胞外相比，可忽略不計。在胞外酶活測定中，枯草芽孢桿菌表達的Csn-But 活性為89.78 U/mL，高于大腸桿菌中表達Csn-But 的活性（19.08 U/mL），表明枯草芽孢桿菌是合適的殼聚糖酶Csn-But 高效表達工程菌株[21]。

2.2 殼聚糖經過蒸汽爆破處理后的結構變化分析

利用掃描電鏡觀察蒸汽爆破預處理后粉狀殼聚糖的形態變化，殼聚糖掃描電鏡圖像見圖1。

圖1 殼聚糖掃描電鏡圖像Fig.1 SEM images of powdery chitosan

由圖1 可知，蒸汽爆破處理引起了明顯的形態學變化。如圖1a1和圖1a2所示，未處理的粉狀殼聚糖表面致密有序，結構相對光滑和平整，這限制了殼聚糖酶的可及性[22]，使酶無法直接高效酶解粉狀殼聚糖。樣品在經過蒸汽爆破處理后呈現出粗糙和無序的形態，并且蒸汽爆破后樣品的粗糙度隨著蒸汽爆破壓力的增加而增強。由圖1b1和圖1b2可知，經1.6 MPa 處理的樣品表面出現輕微卷曲裂紋和纖維網絡松動的特征。如圖1d1和圖1d2所示，當壓力增加到2.0 MPa 時，處理后的樣品出現纖維組織的緊密裂紋。由圖1f2可知，經2.4 MPa 蒸汽爆破處理后，殼聚糖表面顯示多刺的纖維狀細枝排列且表面明顯被撕裂。綜上所述，蒸汽爆破預處理對殼聚糖的結構帶來脈沖沖擊，導致分離和暴露的纖維含有多個空腔和撕裂，這與纖維素經蒸汽爆破處理后變化相似[23]。

ATR-FTIR 對不同壓力蒸汽爆破處理后樣品的表征，結果見圖2。

圖2 未處理和蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的傅里葉變換衰減全反射紅外光譜Fig.2 ATR-FTIR spectra of powdery chitosan untreated and treated with steam explosion

由圖2 可知，殼聚糖的所有特征峰（O—H、C—H和C—O 拉伸振動）均被觀察到，其中3 277 cm-1處的吸收峰為氫鍵OH 拉伸或NH 振動[24-25]，說明蒸汽爆破預處理后殼聚糖的化學鍵未被破壞。其中殼聚糖的光譜在2 871 cm-1處出現C—H 拉伸振動，在1 651cm-1處出現的波段對應于酰胺I 的C O。在1 599 cm-1和1 378 cm-1附近觀測到的特征振動帶一般屬于酰胺II的N—H 彎曲振動和酰胺III 的C—N 拉伸振動[26]。不同壓力下蒸汽爆破處理的樣品在3 400～3 200 cm-1范圍內，由于氫鍵O—H 拉伸和N—H 振動導致條帶強度減弱，酰胺II 的特征峰強度降低，說明氨基間氫鍵斷裂。隨著處理強度從0 增加到2.4 MPa，處理后的粉狀殼聚糖樣品中對稱NH3+彎曲區域1 418 cm-1附近的帶強度減小，這可能是NH3+分子間氫鍵的損失。這些結果表明，蒸汽爆破處理后殼聚糖的化學鍵沒有被破壞，但有效地破壞了氫鍵網絡。

2.3 Csn-But 對蒸汽爆破處理的粉狀殼聚糖酶解

為了進一步評估蒸汽爆破預處理的效果，用殼聚糖酶Csn-But 對預處理樣品進行酶解，其結果見圖3。

圖3 不同蒸汽爆破壓力條件下粉狀殼聚糖的酶解Fig.3 Enzymatic hydrolysis of powdery chitosan under different steam explosion pressures

由圖3 可知，蒸汽爆破預處理可促進粉狀殼聚糖的轉化，當壓力從1.6 MPa 提高到2.4 MPa 時，殼聚糖酶Csn-But 的酶解性能顯著提高。相比于對照組（0 MPa），2.4 MPa 壓力蒸汽爆破處理組的粉狀殼聚糖酶解48 h的還原糖含量提高了5.4 倍，證明蒸汽爆破預處理粉狀殼聚糖有助于粉狀殼聚糖的直接轉化，從而實現了殼寡糖綠色環保生產，突破傳統酸處理法造成的水資源消耗和產物酸味嚴重的瓶頸。

殼聚糖酶Csn-But 水解蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的進程曲線見圖4。

圖4 殼聚糖酶Csn-But 水解蒸汽爆破處理粉狀殼聚糖的進程曲線Fig.4 Time course profile of chitosanase Csn-But hydrolyzing powdery chitosan treated with steam explosion

由圖4 可知，在初始階段（0～12 h），還原糖含量迅速增加，48 h 后達到相對平衡，最高含量為2.0 mg/mL。

2.4 殼三糖的可控制備

2.4.1 殼聚糖酶Csn-But 水解模式分析

通過TLC 分析Csn-But 以各種聚合度寡糖為底物的水解產物，結果見圖5。

圖5 Csn-But 與聚合度2～6 殼寡糖反應Fig.5 Csn-But reacting with（GlcN）2-6

由圖5 可知，分別以殼二糖[（GlcN）2]、殼三糖[（GlcN）3]和殼四糖[（GlcN）4]為底物與殼聚糖酶反應2 h，沒有其他產物生成，說明該酶不能水解殼二糖、殼三糖和殼四糖。而殼五糖[（GlcN）5]被水解生成殼二糖和殼三糖，殼六糖[（GlcN）6]被有效水解為DP2～DP4 的殼寡糖，水解試驗結果證實Csn-But 為內切型切割模式的殼聚糖酶。隨機內切的切割模式有助于獲得高聚合度殼寡糖，可因底物濃度等反應因素所抑制或調節而發生改變[27]。

2.4.2 產物聚合度的調控

底物濃度是影響產物組成的重要因素。通過殼聚糖酶Csn-But 水解不同濃度（2%、4%、6%）蒸汽爆破預處理的粉狀殼聚糖可控生產特定聚合度殼寡糖。水解產物的組成見圖6。

圖6 不同殼聚糖濃度2%、4%、6%的水解產物Fig.6 Hydrolysates obtained from different chitosan contents of 2%，4% and 6%

由圖6a 可知，Csn-But 水解低濃度（2%）蒸汽爆破預處理的粉狀殼聚糖產生殼二糖（m/z 363.1）、殼三糖（m/z 524.2），殼四糖（m/z 685.1）和四聚體（m/z 727.1）與來自2%底物的水解產物相比，水解高濃度底物形成的產物組成有明顯變化。由圖6 可知，隨著底物濃度的增加，雖然產物混合物的聚合度沒有變化，但殼二糖和殼四糖的比例逐漸降低，殼三糖逐漸成為主要的產物。由圖6c 可知，在6%底物濃度下，殼三糖成為產物的主要成分。單一聚合度殼三糖的生產也將大大降低殼寡糖精制后期產品分離純化的時間和操作成本。以往的研究也表明，通過調控酶解過程，可控制生產特定聚合度的殼寡糖，如在不同底物濃度下，當酶添加量較低時，可以得到殼二糖作為優勢產物[27]。

3 討論與結論

殼聚糖酶Csn-But 在生物安全性（GRAS）菌株枯草芽孢桿菌中實現高效表達。此外，Csn-But 酶解2.4 MPa 蒸汽爆破預處理粉狀殼聚糖殼寡糖含量提高了5.4 倍。酶切模式分析表明殼聚糖酶Csn-But 為內切型殼聚糖酶，并且有望通過控制蒸汽爆預處理底物的濃度來實現單一聚合度殼三糖的生產。與傳統方法相比，這種綠色預處理技術可以減少原本酸處理導致的環境污染和產品分離難題。蒸汽爆破預處理粉狀殼聚糖的轉化率較低，需要進一步優化和控制蒸汽爆破過程，提高酶的轉化率。