星狀神經節阻滯對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響

楊 鑫，王曉蕾，楊孟麗，張紅偉，樊 騰，馬聞苛，楊明月，高寧寧，殷 婕，郭自偉，張雪瑩，王玉淼，李 麗，岳修勤

(1.新鄉醫學院第一附屬醫院麻醉科,河南 衛輝 453100;2.首都醫科大學附屬北京友誼醫院麻醉科,北京 100050)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是導致人類死亡的主要疾病之一。及時再灌注治療是AMI患者的關鍵治療策略[1-2],但在血液供應重新恢復的過程中會不可避免地發生心肌缺血再灌注損傷。在急性心肌梗死的缺血再灌注過程中,氧化應激在很大程度上促進了心臟損傷[3-5],因此,可以以活性氧損傷為靶點來減輕心臟急性缺血再灌注損傷。交感神經刺激通過激活β腎上腺素受體而增加心率(heart rate,HR)和心肌收縮功能,迷走神經刺激通過激活M受體而降低HR和心肌收縮功能。心肌缺血再灌注損傷造成心臟自主神經失衡,從而進一步加劇心肌缺血再灌注損傷。研究表明,星狀神經節阻滯具有減少缺血再灌注損傷、促進心肌功能恢復的積極作用[6-7]。本研究通過觀察心肌缺血再灌注模型大鼠星狀神經節阻滯前后HR、平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)水平以及心肌酶、氧化產物、抗氧化酶水平的變化,探討星狀神經節阻滯在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡健康Sprague Dawley雄性大鼠30只,體質量250～300 g,購自山東省實驗動物中心。采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、缺血再灌注組、星狀神經節阻滯組,每組10只,于室溫20～25 ℃ 環境中給予充足的食物和水,適應性喂養1周。本研究通過新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批(編號:2019057)。

1.2 主要試劑與儀器

水合氯醛購自青島宇龍海藻公司,大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所;多功能生物信號采集系統、ALC-V8呼吸機購自上海奧爾科特生物有限公司,EP管購自美國KIRGEN公司,酶標儀購自美國Thermo Scientific公司,恒溫培養箱購自德國Heraeu公司,14、18號血管鉗購自上海眾和天工醫療器械有限公司,小鑷子購自上海金粒醫療器械有限公司,小動物撐開器購自海德創業(北京)生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備及干預

3組大鼠手術前均禁食12 h,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠參照王平安等[8]的方法制備心肌缺血再灌注損傷模型:大鼠術前腹腔注射100 g·L-1水合氯醛(300 mg·kg-1)進行麻醉,固定四肢,通過針狀電極測量心電圖;頸部備皮,消毒、鋪巾,氣管插管連接動物呼吸機進行輔助通氣;胸部備皮,消毒、鋪巾,開放胸腔,剝離心包膜暴露心臟,于左心耳與肺動脈圓錐下方2～3 mm處進針,使用6-0絲線結扎冠狀動脈左前降支30 min,松開結扎線再灌注120 min;缺血期局部心肌顏色變白、心電圖ST段抬高、T波高聳表明結扎成功;松開結扎線后心前區顏色恢復紅潤、心電圖ST段回落提示再灌注成功。對照組大鼠用絲線穿過冠狀動脈左前降支但不結扎,其余手術步驟同缺血再灌注組。星狀神經節阻滯組大鼠再灌注即刻行星狀神經節阻滯,其余步驟同缺血再灌注組;為保證星狀神經節阻滯效果,采用直視下星狀神經節阻滯:大鼠心肌再灌注前,沿食管旁向足端尋找椎動脈、鎖骨下動脈起始處,見梭形或星狀、1～2 mm大小的淡黃色神經團即為星狀神經節,使用2.5 g·L-1羅哌卡因0.2 mL注射于星狀神經節外周,再灌注結束后觀察到大鼠左側面部霍納綜合征即為星狀神經節阻滯成功。缺血再灌注組10只大鼠中因胸內大出血死亡1只,星狀神經節阻滯組10只大鼠中因損傷肺部死亡1只,2組大鼠的存活率和造模成功率均為90%。整個實驗過程均嚴格按照動物倫理要求操作。

1.3.2 3組大鼠HR、MAP檢測

大鼠麻醉后,在其四肢安裝心電圖導聯,連接多功能生物信號采集系統,右頸動脈置管,監測并記錄術前(T0)、缺血30 min(T1)以及再灌注30 min(T2)、60 min(T3)、120 min(T4)時的HR和MAP。

1.3.3 3組大鼠血清心肌損傷標志物檢測

再灌注結束后,通過大鼠右頸動脈留取動脈血5 mL,置于肝素抗凝采血管中,靜置5 min,3 000 r·min-1離心10 min,用微量槍取上清液分裝到EP管,采用ELISA法檢測血清中 cTnI、CK-MB及LDH水平,按照試劑盒說明書操作;使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值,建立標準曲線,計算cTnI、LDH、CK-MB水平。

1.3.4 3組大鼠心肌氧化應激標志物檢測

采血后處死大鼠,留取3組大鼠缺血區心肌組織,將取自左心室前壁的100 mg心肌組織置于離心管中,加入10倍體積的冰冷磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7.4),冰上勻漿2 min,3 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,采用ELISA法檢測心肌組織中MDA及SOD的表達,按照試劑盒說明書進行操作;使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度值,建立標準曲線,計算MDA含量及SOD活性。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 3組大鼠不同時間點HR和MAP比較

T0時3組大鼠的MAP比較差異無統計學意義(F=2.863,P>0.05)。T1、T2、T3、T4時3組大鼠的MAP比較差異均有統計學意義(F=94.628、76.462、86.647、121.432,P<0.05);T1、T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠的MAP均顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);T2、T3、T4時星狀神經節阻滯組大鼠的MAP均顯著高于缺血再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05)。T0時3組大鼠的HR比較差異無統計學意義(F=2.949,P>0.05)。T1、T2、T3、T4時3組大鼠的HR比較差異均有統計學意義(F=126.462、168.564、98.678、128.751,P<0.05);T1、T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠的HR均顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);T2、T3、T4時星狀神經節阻滯組大鼠的HR均顯著低于缺血再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05)。T1時星狀神經節阻滯組與缺血再灌注組大鼠的MAP、HR比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表1。

表1 3組大鼠不同時間點HR、MAP比較Tab.1 Comparison of HR and MAP of rats among the three groups at different time points

2.2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較

3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較差異均有統計學意義(F= 58.654、85.461、221.202,P<0.05)。缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。星狀神經節阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB 水平均顯著低于缺血再灌注組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。

表2 3組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平比較Tab.2 Comparison of serum cTnI,LDH and CK-MB levels of rats among the three groups

2.3 3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較

3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較差異均有統計學意義(F=54.622、53.507,P<0.05)。 缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠心肌組織中MDA含量顯著高于對照組,SOD活性顯著低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。星狀神經節阻滯組大鼠心肌組織中MDA含量顯著低于缺血再灌注組,SOD活性顯著高于缺血再灌注組,差異均有統計學意義(P<0.05)。結果見表3。

表3 3組大鼠心肌組織中MDA含量及SOD活性比較Tab.3 Comparison of MDA content and SOD activity in myocardial tissue of rats among the three groups

3 討論

冠狀動脈閉塞時,閉塞處遠端心肌供血減少可導致組織損傷。雖然早期、成功建立再灌注是改善急性心肌缺血后臨床結果的最有效治療策略,但在缺血一段時間后,缺血心肌血流的恢復和再灌注卻會導致更多損傷的發生,這種不可逆損傷被稱為心肌缺血再灌注損傷,其所導致的心肌梗死面積占心肌梗死最終面積的50%[9]。研究認為,心肌損傷主要與活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生增加有關[10]。在正常心肌組織中,體內氧化還原過程處于平衡狀態,當氧化應激時,ROS生成增多,過量的ROS可以導致脂質過氧化將蛋白質氧化為非活性狀態并導致DNA鏈斷裂,從而破壞細胞,最終導致心肌損傷。目前,臨床上星狀神經節阻滯技術在輔助治療心臟電風暴、減輕心肌損傷等方面有大量報道[11-14]。星狀神經節阻滯對心肌缺血損傷或其他氧化應激有明顯的抗氧化作用,其抑制氧化應激可能是一種安全有效的臨床實踐,并可為避免不良心血管反應提供一種簡便易行的方法。本研究通過觀察心肌缺血再灌注模型大鼠星狀神經節阻滯前后HR、MAP以及血清心肌酶、氧化產物、抗氧化酶水平的變化,探討星狀神經節阻滯在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用,旨在為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。

心肌氧耗的多少主要由HR、心肌收縮力、心室壁張力所決定,臨床上常用HR與收縮壓乘積估算心肌耗氧量的相對水平。心動過速可縮短冠狀動脈血流灌注的時間,低血壓可降低心肌組織灌注的壓力,心動過速和低血壓共同作用會對心肌組織的正常血液供應造成極大威脅。冠狀動脈搭橋術中常以HR與收縮壓乘積的標準反映心肌氧耗,在HR收縮壓乘積保持不變時,HR增快對心肌耗氧量的影響更大。心臟血管擴張可有效增加心臟的供血、供氧量,從而緩解心絞痛和心肌缺血狀態,而達到心肌保護作用。有研究顯示,星狀神經節阻滯通過阻斷區域交感活動,引發冠狀動脈循環的改變,并改善血流動力學[15]。訾聰娜等[16]研究顯示,星狀神經節阻滯可減輕手術期間MAP、HR波動,維持患者的血流動力學相對穩定,從而有利于減輕應激反應。YILDIRIM等[17]研究表明,在冠狀動脈搭橋術中,術前給予星狀神經節阻滯,可防止橈動脈移植物的血管痙攣,并降低術中心房顫動發生率、正性肌力藥物需求和ST段抬高的發生率,發揮心肌保護作用。GULCU-BULUT等[18]在大鼠心肌缺血前用星狀神經節阻滯預處理,結果顯示,在結扎和再灌注過程中,星狀神經節阻滯均降低了心律失常的發生率,并顯著減少了大鼠的心肌梗死面積,證明星狀神經節阻滯可能是一種利用機體自身途徑減少缺血再灌注損傷的合適方法。本研究結果顯示,T0時3組大鼠的MAP、HR比較差異無統計學意義;T1時,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組與對照組相比MAP顯著降低、HR顯著上升,提示心肌缺血損傷可造成血流動力學波動;T2、T3、T4時,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠的MAP仍顯著低于對照組,HR仍顯著高于對照組;但星狀神經節阻滯組大鼠的MAP顯著高于缺血再灌注組,HR顯著低于缺血再灌注組;提示,星狀神經節阻滯可改善冠狀動脈血液灌注、降低心肌氧耗。

缺血再灌注可通過細胞內鈣超載、細胞線粒體能量代謝障礙以及氧自由基損傷等機制,造成心肌細胞損傷或壞死,繼而引發細胞膜通透性改變,導致心肌細胞胞質物質(心肌酶和心肌蛋白)釋放入血。心肌酶是臨床檢測心肌細胞損害程度的重要指標。CK-MB廣泛存在于心肌細胞中,是臨床診斷心肌損傷的有效指標。LDH廣泛存在于人體各個組織中,多見于心肌細胞中,冠狀動脈性心臟病患者發生急性心肌梗死后,隨著冠狀動脈病變支數的增加,LDH水平逐漸增高,臨床多將LDH應用于心肌梗死的診斷。cTnI是反映心肌細胞急性損傷的指標,具有較高特異性,在短時間內的心肌缺血刺激下,心臟可大量釋放cTnI,通過對cTnI水平的檢測可有效判斷心肌受損面積,且可作為微小心肌損傷的早期標志物。cTnI和CK-MB是心肌損傷時最敏感的特異性指標,其數值大小與心肌損傷程度呈正相關。本研究通過結扎與再開放大鼠冠狀動脈左前降支造成早期心肌損傷,檢測心肌相關標志物LDH、CK-MB以及cTnI,其中cTnI的升高早于光鏡下病理損傷出現的時間。本研究通過測定大鼠血清心肌酶發現,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB水平均顯著高于對照組,提示缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組大鼠均發生了缺血再灌注損傷;而星狀神經節阻滯組大鼠血清中cTnI、LDH、CK-MB 水平均顯著低于缺血再灌注組,表明星狀神經節阻滯可以減少心肌損傷,從而減少心肌相關標志物的釋放。在正常心肌組織中,體內氧化還原過程處于平衡狀態,當氧化應激時,ROS生成增多,過量的ROS可以導致脂質過氧化,將蛋白質氧化為非活性狀態并導致DNA鏈斷裂,從而破壞細胞,最終導致心肌損傷。脂類受活性氧的攻擊氧化分解為MDA,進而繼續傷害心肌,進一步擴大心肌缺血損傷,MDA水平能夠反映出心肌受損的嚴重程度。SOD是反映機體抗氧化水平的重要物質之一,具有對抗自由基和抵御氧化損傷的作用,對細胞、組織具備保護能力。本研究結果顯示,缺血再灌注組和星狀神經節阻滯組MDA水平高于對照組,SOD水平低于對照組,表明缺血再灌注導致大鼠的氧化應激水平增高;星狀神經節阻滯組MDA水平低于缺血再灌注組,SOD水平高于缺血再灌注組,表明再灌注前進行星狀神經節阻滯減少了大鼠的氧化應激水平。

4 結論

星狀神經節阻滯能夠改善缺血再灌注大鼠的心肌灌注,通過改善氧化應激而減輕心肌缺血再灌注損傷。因此,星狀神經節阻滯可作為減輕缺血再灌注損傷的治療措施。