骨髓間充質干細胞在骨缺損疾病治療中的應用進展

羅家利 呂帥潔 童培建

由創傷、感染或腫瘤切除等因素引起的骨缺損一直是臨床骨科面臨的重大難題，目前自體骨移植仍是骨修復的常用治療方式。但自體骨移植存在多種問題，如手術操作繁瑣，自體骨數量局限，治療效果及預后不理想等，因此亟需尋求一種新的有效療法來治療骨缺損疾病[1-2]。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種具有多向分化潛能的細胞，在骨組織工程領域備受關注。近年來，有關BMSCs 治療骨缺損的研究取得了顯著成果，并已證明此療法能有效修復骨與軟骨缺損[3-4]。本文結合近年國內外BMSCs 的相關臨床研究進展進行綜述。

1 BMSCs 定義與生物學特性

BMSCs 是存在于骨髓基質中的一種具有自我更新和多向分化潛能的基質細胞[5]。大量研究證明，無論是在動物模型還是在人類臨床試驗中，BMSCs 作為多功能干細胞在骨缺損的維持、修復、再生中具有多種優勢[6]。BMSCs 在骨缺損治療中的主要特性為：（1）多向分化和自我更新能力：在一定條件誘導下，BMSCs 能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞促進骨修復[7]。（2）歸巢能力：BMSCs 能夠遷移到損傷部位，分泌有助于組織再生的趨化因子、細胞因子以及生長因子，參與損傷區域重建[8]。（3）免疫調節特性：BMSCs 參與免疫調節，與損傷部位脫落分子產生強大的旁分泌效應，阻斷并保護其他細胞免于凋亡[9]。

2 BMSCs 分離與鑒定

BMSCs 因其干細胞特性和高度可塑性等優點而逐步走向臨床，在體外擴增之前，從不同外周組織中分離與鑒定BMSCs 是獲得足夠材料進行臨床應用的關鍵先決條件。BMSCs 體外分離方法主要有骨髓細胞貼壁法、密度梯度離心法、膜過濾分離法等[10]。這些方法各有優劣，目前從骨髓中分離BMSCs 的常用方法為密度梯度離心法，此種方法的優點是不需要特殊標記介質，能有效降低對分離后細胞的影響。但與其他方法相比，密度梯度離心法不能分離具有相似沉降特性的不同類型細胞[11-12]。由于缺乏唯一特異性標志物，目前對BMSCs 的鑒定方法尚未統一。國際細胞治療學會（ISCT）在2006 年提出了BMSCs的最低定義標準[13]：（1）BMSCs 必須具有貼壁黏附性；（2）BMSCs 必須表達CD73、CD105 和CD90，但不表達造血和內皮細胞標志CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19、人類白細胞抗原-DR；（3）BMSCs 必須具有在體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和軟骨母細胞的能力。

3 單純BMSCs 移植應用

臨床用于重建大塊骨缺損的治療選擇主要包括骨移植和Ilizarov 牽引成骨技術，但均存在諸多限制。在骨組織工程領域，利用BMSCs 誘導骨再生修復骨缺損已受到廣泛關注[14-15]。依據骨化途徑，BMSCs的移植應用可分為膜內植入（直接成骨）和軟骨內植入。

3.1膜內植入 膜內植入為將未分化的BMSCs 單純植入破損骨膜內，使其分化為骨祖細胞形成成骨中心并分泌類骨質捕獲成骨細胞，誘導成骨細胞分化為骨細胞，最終修復缺損骨小梁基質和骨膜。Gjerde等[16]將BMSCs 在含有人血小板裂解物的培養液中進行擴增，并植入破損骨骨膜下，在骨缺損愈合后對移植部位進行活檢，結果顯示，BMSCs 膜內植入顯著誘導了新骨形成，且未觀察到不良反應。Zhao等[17]從兔外周血和骨髓中分離純化BMSCs 和內皮組細胞進行共同培養，然后將BMSCs 植入部分脫蛋白的生物骨支架，結果顯示，共培養的內皮祖細胞與BMSCs 在支架表面生長良好，與單獨培養的BMSCs組相比，共培養組在促進骨缺損修復的同時，還誘導了支架上膠原蛋白生產，加速血管和骨的形成。

3.2軟骨內植入 骨化涉及BMSCs 的初始凝聚和最終鈣化骨的形成，膜內植入直接完成了這一點，而軟骨內植入則增加了一個中間步驟，使BMSCs 向成軟骨細胞分化，分泌基質形成軟骨板和軟骨膜，以此來調節缺損骨骼的生長和最終形態。通過將預分化的BMSCs 移植到軟骨形成途徑誘導軟骨內成骨是近年來的研究重點[18-20]。研究表明，相較于膜內植入，軟骨內植入能夠顯著促進血管與骨的形成，且更為可控[21]。Harada等[15]將體外預分化的BMSCs 移植到軟骨內形成間充質干細胞來源的軟骨細胞，并植入大鼠巨大（15 mm）全層股骨缺損中，結果顯示，2 周時骨缺損處明顯有新骨形成，8 周時新形成的皮質骨已成骨愈合，8 周后大鼠股骨的平均生物力學強度達到了正常大鼠股骨的75%。Farrell等[22]將全髖關節置換術患者體內提取的BMSCs 分別使用成骨細胞和軟骨細胞培養基擴增，然后植入表達人胎盤堿性磷酸酶轉基因大鼠體內的人工支架培養，28 d 后提取支架進行組織形態計量學計算，結果顯示，成骨細胞培養組骨組織占支架構筑面積的（24±10）%，軟骨細胞培養組骨組織占支架構筑面積的（39±7）%，提示體外誘導BMSCs 軟骨分化進行體內骨修復效率更高。

4 BMSCs 復合支架材料應用

運用組織工程和細胞生物學的原理及方法，將人工支架材料復合BMSCs 對骨缺損組織的結構、功能進行修復和改善已取得了相關突破和進展[23]。人工支架具有良好的生物相容性、可吸收性、可降解性，運用支架將植入的BMSCs 固定在損傷部位預定局部環境有利于組織的再生和適當降解，從而克服了自體骨移植的缺點[24]。

4.1傳統支架材料選擇 人工支架與自體骨具有相似的理化性質，擁有良好的生物相容性并可誘導成骨分化，這些支架材料必須包含兩個基本成分：（1）骨礦物，即磷酸鈣和羥基磷灰石；（2）有機物，如主要的膠原纖維和成骨生長因子等。支架材料主要分為合成高分子材料和天然高分子材料兩大類，合成高分子材料如納米陶瓷、聚乙乳酸、聚乙醇酸等，天然高分子材料如膠原、明膠、殼聚糖等[25-27]。目前生物支架材料的研究熱點是將不同的生物材料進行相應組合，以制備高性能復合材料，克服單一支架材料缺陷。Ruan等[24]將絲素蛋白/殼聚糖/納米納米羥基磷灰石（SF/CS/nHA）3D 支架材料單獨或與BMSCs 復合應用于兔橈骨節段性缺損處，結果顯示SF/CS/nHA可促進BMSCs 黏附、生長和鈣結節形成，提示負載BMSCs 的SF/CS/nHA 支架具有較高的修復橈骨節段性缺損的效果。Zhu等[28]將由微米晶須和納米顆粒混合結構表面（hBCP）組成的硫酸鈣生物陶瓷植入犬長骨缺損模型，與傳統生物支架材料進行對比，結果顯示hBPC 組植入材料內有更多新骨形成并具有更高的骨折負荷，提示微米/納米混雜結構生物陶瓷增強了局部骨缺損的修復。

4.2新興生物支架技術 3D 生物打印支架是目前骨缺損修復領域的研究熱點。3D 生物打印技術用于精確分配負載細胞的生物材料，以構建復雜的生物支架。該技術仍處于早期階段，但3D 生物打印技術具有廣泛的潛在用途，包括修復骨缺損處皮膚、軟骨和骨骼[29]。在典型骨組織工程方案中，首先制造3D多孔支架，然后加載特定的活細胞和/或組織誘導生長因子以啟動和促進缺損骨的再生或替換，與傳統支架相比，3D 生物打印技術的主要優勢在于可以制造細胞分布可控的支架[19，30]。該項技術曾被運用于制造硫酸鈣支架，實驗已經證明低溫3D 打印硫酸鈣支架的可行性，目前更多學者將研究重點放在使用3D生物打印技術改善支架生物活性、骨誘導性和機械性能上，開發更具生物針對性和連貫性的完美支架[31]。Xu等[32]嘗試利用表達Osx 的病毒轉染大鼠BMSCs，上調成骨相關基因，然后與包裹重組人血管內皮生長因子（VEGF）的3D 打印多孔支架結合，使支架具有血管化和成骨誘導特性，促進骨缺損修復。

5 基于基因工程的BMSCs 應用

將特定基因通過腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、桿狀病毒在體外轉染至BMSCs，再輸入患者體內是目前基因治療骨缺損的主要研究方向。不同有益基因的基因修飾可以改善BMSCs 在損傷部位的成骨效力與修復能力[33]。轉基因BMSCs 的動物研究揭示了基因工程臨床應用的可能性與廣泛潛力。Kumar等[34]用腺相關病毒（AAV）載體將骨形態發生蛋白-2和VEGF 結合到BMSCs 中，并植入小鼠脛骨缺損模型中，結果顯示該實驗組小鼠骨修復效率、骨密度和生物力學特性均明顯強于對照組，提示組合基因修飾BMSCs 具有臨床潛力。將基因工程運用到生物支架目前仍處于動物試驗階段，研究發現，基因激活的納米支架在體外和體內都能夠誘導功能性基因的可控、持續釋放，進而促進BMSCs 成骨分化，加速修復臨界大小顱骨缺損[35]。Leng等[36]將骨誘導基因OimRNAs 與陽離子聚合物聚乙烯亞胺復合，負載于脫鈣骨基質支架（Oi-mRNA/DBM）并植入大鼠臨界顱骨缺損模型，結果顯示轉基因支架能夠有效促進BMSCs 在體內滲透以及成骨分化，加速骨缺損修復。

6 小結

骨缺損疾病是骨科臨床上常見的難題。大量臨床實驗表明，BMSCs 是治療骨缺損疾病的理想化種子。有關BMSCs 聯合生物支架、基因工程治療骨缺損的大量臨床前數據已經積累，未來BMSCs 的發展方向便是將實驗研究轉移到可行性臨床治療上。對于BMSCs 的研究也面臨著實際問題，例如，由于患者樣本數少，缺乏對照，以及大多數選擇這類新興療法的患者通常都是經歷過多次手術或失敗治療的疑難患者，因此將BMSCs 運用于骨缺損疾病治療尚需進行大樣本、高質量的臨床試驗進一步深入探究。盡管挑戰諸多，但將BMSCs 和相關領域的基礎研究轉化為可行的骨缺損臨床治療仍具有可觀前景。