追風傘中總黃酮的纖維素酶提取工藝優(yōu)化

胡畔

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550000）

追風傘(Lysimachia paridiformis)是報春花科珍珠菜屬植物，又名狹葉落地梅。在我國主要分布于四川、云南、貴州、廣東、廣西、湖南等地，全草可入藥，功效有祛風、活血化瘀、定驚、生肌，用于骨折、跌打損傷、小兒驚風、風濕麻木、腳轉(zhuǎn)筋等[1]。黃酮類化合物是廣泛存在于各種植物的一類次生代謝產(chǎn)物，是藥用植物的主要活性成分之一。黃酮類化合物能夠抗菌、消炎、防病毒、抗腫瘤、保肝、止咳祛痰、抗氧化抗氧化和抗微生物、抑制炎癥反應的作用[2-6]。但是以纖維素為主的細胞壁把植物中的總黃酮類化合物包圍，傳統(tǒng)的提取方法沒辦法使包圍黃酮類化合物的細胞壁破裂，黃酮類化合物向溶劑主體的擴散受阻，致使提取效果受限嚴重，造成嚴重的資源浪費[7]。

本實驗參考了目前的研究經(jīng)驗，并做出了相關的分析與總結，從而使用乙醇法用纖維素酶輔助提取追風傘中的總黃酮，并且在單因素的實驗結果的基礎上采用正交試驗進行提取條件的優(yōu)化，使得追風傘中總黃酮得到更高效的利用。目前對追風傘的藥理作用、化學成分的報道和研究較少。但是對其同屬植物的黃酮苷類和三萜皂苷成分的報道和研究較多，而且黃酮苷類具有很好的抗腫瘤作用[8]。經(jīng)過單因素實驗對乙醇體積分數(shù)的考察、對料液比的考察、對回流時間的考察以及對回流溫度的考察，通過正交試驗得出追風傘中總黃酮的最佳提取工藝[9]。劉全德等[10]采取纖維素酶對野馬追總黃酮的提取進行輔助，分別控制液料比、酶濃度、酶解溫度、酶解時間，并與水煎煮法、乙醇提取法做對比，可借鑒性高。超臨界流體萃取法、半仿生提取、酶輔助提取法目前是黃酮類化合物的主要提取方法[11]。超臨界流體萃取技術和傳統(tǒng)的中藥提取分離技術相比，適用范圍更廣，對原料成分沒有破壞，對環(huán)境沒有污染，具備操作更方便和提取效率更高等一系列優(yōu)點[12]。但是其成本高，原料不易獲取。半仿生提取在一定程度上可以使有效成分更好地溶出，能夠縮短生產(chǎn)周期、降低成本，而且對于制劑和使用更有利，但對于單一成分可能不是最佳選擇[13]。微波提取法的優(yōu)點是產(chǎn)率高、能耗低、操作時間短、溶劑用量少等；大量試驗結果表明微波提取法可以使黃酮類化合物的提取率大幅度提高，但微波提取法的應用廣度很大程度被微波泄漏問題限制，目前微波提取法正處在實驗室研究階段，在熱敏性物質(zhì)領域還是空白，是否能夠用于工業(yè)化生產(chǎn)還需要更進一步研究[14]。酶解法在天然產(chǎn)物的提取中屬于新興技術，植物細胞壁可以利用酶制劑進行降解，使細胞內(nèi)有效成分最大限度溶出，與此同時酶制劑可以把植物組織較溫和地分解，進一步保證了所提取物質(zhì)的結構和性質(zhì)的穩(wěn)定。追風傘植物的細胞壁主要由半纖維素、纖維素構成，因此實驗用酶制劑選用纖維素酶[15]。相對其他有著成本高，對儀器操作要求高等缺點的方法而言，酶解法由于材料易得、成本較低、易操作、無污染、作用明顯等特征，可用性更高，因此選擇酶解法作為試驗方法。

1 實驗內(nèi)容

1.1 實驗儀器與試劑

主要儀器（型號）：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（SENCOR201L）、水浴鍋（B-220）、紫外分光光度計（7230G）、循環(huán)水式真空泵（SHZ-D）、分析天平（AUY220）、干燥箱（DHG-9070A）。主要試劑：追風傘（安徽省亳州市三義堂藥業(yè)有限公司提供）、蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所提供）、纖維素酶（湖南米純生物科技有限責任公司提供）、乙醇（AR）、NaNO2（AR）、Al(NO3)3（AR）、NaOH（AR）。

1.2 實驗步驟

1.2.1 標準曲線的繪制[16]

稱取蘆丁標準品5.462 mg，加適量50%的乙醇溶液進行溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加50%的乙醇定容，配制成濃度為0.1092 mg/mL 的蘆丁標準溶液。用移液管準確吸取蘆丁標準溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL 分別轉(zhuǎn)移到6 支25 mL 容量瓶中，各加5% NaNO2溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min；加4% NaOH溶液10.00 mL，再加入50%乙醇定容至刻度，搖勻，放置10 min。在510 nm 波長處以試劑空白為參比測定吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為y = 12.229x + 0.0081，其線性相關系數(shù)為R2= 0.9995。

1.2.2 總黃酮的提取與含量測定

稱取一定量預處理好的追風傘粉末置于錐形瓶中，然后稱取一定質(zhì)量的纖維素酶加入，再量取一定體積的50%乙醇加入，在一定溫度下提取一段時間后，將提取液過濾，定容，得總黃酮的粗提取液。按“1.2.1”項下方法測定其吸光度，并繪制標準曲線，然后根據(jù)標準曲線方程計算濃度，求得提取率。

其中C 是總黃酮提取液中總黃酮濃度（g/mL），V 是總黃酮提取液體積（mL），M 是稱取追風傘的質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素實驗

(1)纖維素酶用量對追風傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分數(shù)50%，料液比1：20（g/mL），纖維素酶用量分別為0.5 mg、1 mg、1.5 mg、2 mg、3 mg，在40℃條件下反應1.5 h 之后置于70 ℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測定其吸光度并計算總黃酮提取率。

(2)酶解時間對追風傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分數(shù)50%，料液比1 ∶20（g/mL），纖維素酶用量1 mg，在40℃條件下分別酶解1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測定其吸光度并計算總黃酮提取率。

(3)酶解溫度對追風傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分數(shù)50%，料液比1 ∶20（g/mL），纖維素酶用量1 mg，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃條件下酶解2.0 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測定其吸光度并計算總黃酮提取率。

(4)料液比對追風傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制乙醇體積分數(shù)50%，纖維素酶用量1 mg，料液比分別為1 ∶20（g/mL）、1 ∶30（g/mL）、1 ∶35（g/mL）、1 ∶40（g/mL）、1 ∶45（g/mL），在40℃條件下反應1.5 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min 之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測定其吸光度并計算總黃酮提取率。

(5)乙醇體積分數(shù)對追風傘中總黃酮提取率的影響。稱取0.50 g 的追風傘粉末5 份分別置于50 mL 錐形瓶中，控制纖維素酶用量1 mg，控制料液比1 ∶20（g/mL），乙醇體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，在40℃條件下反應1.5 h 之后置于70℃水浴中滅酶活，5 min之后過濾，濾液用50%乙醇定容至50 mL，得總黃酮提取液，測定其吸光度并計算總黃酮提取率。

1.2.4 正交試驗

在單因素實驗基礎上，針對纖維素酶對提取率的影響，選取酶解溫度、酶解時間、酶用量三個因素進行正交試驗。因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 纖維素酶用量對追風傘中總黃酮提取率的影響

纖維素酶可使追風傘細胞壁破裂分解，可以提高追風傘中總黃酮的提取率。加入不同質(zhì)量的纖維素酶時追風傘粉末中總黃酮的提取率結果隨加入纖維素酶質(zhì)量的增加總體呈上升趨勢，酶用量少于3.0 mg 時不能使細胞壁完全破解，酶用量為3.0 mg 時總黃酮提取率最高。

2.1.2 酶解時間對追風傘中總黃酮提取率的影響

實驗結果表明總黃酮提取率隨著酶解時間的增長而呈降低態(tài)勢。所以并不是酶解時間越長總黃酮的提取率越高，隨著酶解時間的增長，提取出的總黃酮物質(zhì)可能會分解。當酶解為1 h 時提取率最高，超過1 h 后，隨著酶解時間的增長，總黃酮類物質(zhì)分解量逐漸增加。

2.1.3 酶解溫度對追風傘中總黃酮提取率的影響

實驗結果顯示在45℃～65℃之間，總黃酮提取率隨溫度升高總體呈下降趨勢，在45℃時總黃酮提取率最高，在50℃～60℃之間變化較小，隨著溫度持續(xù)升高總黃酮提取率有明顯下降，表明在45℃時纖維素酶活性最大，當溫度繼續(xù)升高，纖維素酶逐漸失活。

2.1.4 料液比對追風傘中總黃酮提取率的影響

實驗結果能夠看出總黃酮的提取率隨著料液比中溶劑的增加逐漸降低。隨著溶劑的增加，提取出的總黃酮類物質(zhì)可能會更多地溶解在溶劑中，導致總黃酮提取率降低。在料液比為1 ∶20（g/mL）時總黃酮的提取率最高。

2.1.5 乙醇體積分數(shù)對追風傘中總黃酮提取率的影響

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)能夠看出總黃酮提取率先隨著乙醇的體積分數(shù)升高而升高，之后下降?？傸S酮提取率在乙醇的體積分數(shù)處于40%～60%區(qū)間時呈上升趨勢，在60%～80%區(qū)間呈下降趨勢，在60%的時候總黃酮提取率最高，說明該黃酮類化合物與體積分數(shù)60%的乙醇的極性相似。

2.2 正交試驗結果與分析

根據(jù)正交試驗結果，選擇反應條件酶解溫度50℃，酶解時間1.0 h，纖維素酶用量1.5 mg，此時測得吸光度為0.454，提取率為3.65%，正交實驗安排及結果見表2。

表2 正交試驗安排及結果

2.3 驗證實驗

從以上單因素實驗和正交試驗結果可知得到最佳提取條件工藝為在0.50 g 追風傘粉末中加入1.5 mg 纖維素酶、酶解時間為1.0 h、酶解溫度為50℃、液料比1 ∶20（g/mL）、乙醇體積分數(shù)60%。在最佳提取條件下進行驗證實驗，重復進行三次實驗，實驗結果見表3。

由表3 可知該條件下總黃酮提取率可達3.65%，與在其他條件下的結果相比相對較高，因此該條件為最優(yōu)實驗條件。

3 實驗結論

在這項研究中采取纖維素酶輔助提取追風傘中的總黃酮類物質(zhì)，在單因素的實驗結果的基礎上進行正交試驗，實驗得出3 個因素對總黃酮提取率的主次影響順序為酶解溫度＞酶用量＞酶解時間。得到最佳條件下總黃酮提取率可達3.65%，該提取條件為在追風傘粉末中加入纖維素酶1.5 mg、酶解時間為1.0 h、酶解溫度為50℃、乙醇體積分數(shù)60%，料液比1 ∶20（g/mL）。