NGF/TrkA信號通路在膀胱功能障礙疾病中表達的研究進展

龐磊，邊曉東，雙衛兵,

（1.山西省人民醫院 泌尿外科，山西 太原 030012；2.山西醫科大學第一臨床醫學院，山西 太原 030012；3.山西醫科大學第一附屬醫院 泌尿外科，山西 太原 030012）

1 NGF/TrkA 通路的組成

NGF 是一種可溶性肽，是神經營養蛋白家族的創始成員，NGF 的成熟形式是一種同源二聚體，其中每個亞基由118 個氨基酸組成［1］。NGF 二聚體與兩類不同的受體結合：高親和力原肌球蛋白受體激酶A（TrkA）和低親和力的神經營養因子p75 受體［2］。前者是具有內在酪氨酸激酶活性的經典生長因子受體，而后者屬于TNFa 相關的死亡域受體。根據它們的相應結構，有研究顯示TrkA 與磷脂酶C（PLC），絲裂原活化蛋白（MAP）激酶偶聯，和磷酰胺基肌醇-3（PI3）激酶途徑并介導NGF 和存活促進反應，而p75 促進細胞凋亡［3］。然而，有研究表明了一個更復雜的情況，NGF 與p75 的結合增強了NGF-TrkA 的親和力并刺激了TrkA 誘導的信號傳導，而后形成信號復合物，隨后內化并逆行從外圍運輸到細胞核［4］，此過程組成了NGF/TrkA 信號通路。

2 NGF 系統在正常膀胱中廣泛表達

Skaper 的研究表明，NGF 及其受體在膀胱中mRNA 和蛋白質水平的表達。利用實時熒光定量PCR 測定，在大鼠和人類的膀胱組織中檢測到NGF mRNA［5］。通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和免疫印跡，NGF 蛋白在大鼠的膀胱組織中以及人類淺表膀胱活檢中被發現［6］。最初，NGF/TrkA信號通路表達在大鼠膀胱平滑肌中，也可以在嚙齒動物的背根神經節（DRG）和盆腔神經節（MPG）中檢測到，但是，膀胱尿路上皮卻是NGF/TrkA 表達的突出部位［7］。在正常大鼠中，尿路上皮中有豐富的NGF/TrkA 表達，逼尿肌中的NGF/TrkA 表達信號則較弱，只可見在黏膜下區域出現散發染色［8］。在人體膀胱組織中，間質性膀胱炎患者的尿路上皮NGF/TrkA 信號通路表達增加，NGF 受體在膀胱中的表達主要局限于神經纖維，大多數NGF 反應細胞同時表達TrkA 和p75受體，NGF 激活的結果取決于這兩個受體之間的相互作用［9］。TrkA 表達的免疫組化證據出現在L4-5 及L6-S1 DRG 的傳入神經元中表達［10］。在對照大鼠膀胱中，TrkA 表達主要在尿路上皮和固有層中觀察到，偶爾有尿路上皮下神經纖維陽性，而在膀胱平滑肌細胞（BSMC）中沒有發現表達［11］。在雌性小鼠中，TrkA 免疫反應性也僅限于黏膜。p75mRNA 也表達于大鼠膀胱，其中受體免疫反應性局限于尿路上皮、神經纖維位于尿路上神經叢、血管系統神經纖維和逼尿肌中的神經纖維［12］。在生理條件下，尿路上皮是嚙齒動物和人類膀胱中NGF 及其受體表達豐富的部位。此外，膀胱平滑肌表達NGF，傳入和傳出神經纖維都顯示NGF 受體。

3 NGF/TrkA 信號通路形成機制及在膀胱發育中的作用

在膀胱當中，與炎癥相關的多種病理表現可調節體內NGF/TrkA 信號通路水平，與其他非神經元細胞類型相比，炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）或白細胞介素-1b 對大鼠膀胱平滑肌細胞的NGF 釋放只有輕微的影響［13］。對于b-腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素，可以抑制和刺激大鼠膀胱平滑肌細胞對NGF/TrkA 信號通路的釋放［14］。而且這個過程可見細胞內的鈣離子升高。關于控制NGF/TrkA 信號通路的表達機制，研究尿路上皮表達的調控可能非常重要，尿路上皮是膀胱中NGF 表達豐富的細胞類型［15］。另外，NGF/TrkA 參與膀胱神經支配的發生和發展。事實上，許多研究已經證實了NGF/TrkA 信號通路在膀胱支配DRG 神經元的體外細胞培養系統中的促生存和促分化的誘導作用［16］。在大鼠胚胎發育過程中，膀胱中的NGF/TrkA 水平持續增加，在出生前達到峰值。在一些物種中，排尿反射在早期發育中經歷了實質性的重塑［17］。從最初對脊柱排尿反射的依賴逐漸轉化成成年動物排尿的脊柱反射通路［18］。LIU［19］的研究表明，NGF 可能參與調節這種產后排尿通路的重塑，因為小鼠出生后NGF mRNA 和蛋白質水平在大鼠的2～3 周齡達到峰值，這與棘球脊髓反射的出現一致。

4 NGF/TrkA 信號通路在膀胱功能障礙中的作用

在成人中，NGF/TrkA 信號通路對膀胱和脊髓排尿通路沿線神經元的影響似乎遠比神經支配、神經密度增加和神經元萌芽要復雜得多。NGF/TrkA 信號通路不斷調節神經元功能表型，從而來響應生理刺激和有害刺激，這一過程稱為神經元重塑。對感覺神經元的體外研究表明，NGF/TrkA信號通路可以調節神經遞質釋放，誘導突觸重組，通過降低激活閾值增加神經元興奮性，并使傷害感受神經元對有害刺激（超敏反應）敏感［20］。雖然NGF 誘導的膀胱中感覺傳入物的超興奮性和致敏的分子機制目前還沒有得到很好的驗證，但它們可能包括疼痛相關神經遞質（如物質P 和CGRP）的TrkA 依賴性基因表達上調卻被多次證明，例如TRPV1 通道的磷酸化增加可能在NGF/TrkA 信號通路調用的感覺神經元致敏中起作用［21］。所有這些機制都可能參與眾多病理性疼痛感的增加，使NGF/TrkA 信號通路成為內臟和炎癥性疼痛的關鍵通路［22］。在膀胱中，NGF/TrkA 信號通路介導的沿著排尿途徑的細胞變化可以轉化為膀胱過度收縮，甚至導致膀胱區疼痛［23］。CHUANG 等［24］的數據表明，在膀胱中存在的NGF/TrkA 信號通路會導致膀胱功能的變化，包括膀胱反射亢進及膀胱區疼痛。LIANG 等［25］的實驗結果表明，這些影響類似于與膀胱過度活動和炎癥性疼痛相關的病理，如膀胱過度活動綜合征（OAB）和間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征。TYAGI等［26］學者提出，大多數有害過程都是由TrkA 介導的，外周的NGF/TrkA 信號通路亦可能引起中樞排尿通路的變化。這些小鼠由于尿路上皮細胞中明顯的神經纖維擴張而表現出膀胱容量增大。這種組織學表型與膀胱功能的明顯變化是與牽涉性軀體盆超敏反應增加有關的。此外，在NGF 轉基因小鼠的尿路上皮下觀察到過多的肥大細胞表達［27］。SCHNEGELSBERG 等［28］描述了NGF/TrkA信號通路對肥大細胞的營養作用，并可能參與炎癥性疼痛的介導。這些發現暗示了NGF 誘導的膀胱變化可能涉及神經元以外的細胞類型。MICHEL等學者表明，NGF 被建議作為人類原發性尿路上皮細胞的生長因子，通過TrkA 起作用［29］。另一方面，在沒有配體的情況下，p75 的過度表達會減弱膀胱上皮細胞的增殖，這種效應被NGF 抵消［30］。雖然NGF 可能控制尿路上皮增殖，但尚不清楚它是否也調節尿路上皮功能性表型。QIAO 等［31］的研究結果表明，NGF/TrkA 信號通路過表達上調尿路上皮和膀胱平滑肌細胞中的血管內皮生長因子（VEGF）和VEGF 受體，提示NGF/TrkA 信號通路參與介導膀胱血管生成和炎癥。

5 膀胱功能障礙中的NGF 表達

考慮到NGF 在控制膀胱感覺功能和通過外源性NGF 給藥誘導膀胱功能障礙方面的關鍵作用，發現NGF 對膀胱病變的貢獻是巨大的。實際上，在測試NGF 對膀胱的影響之前，人類和大鼠膀胱出口梗阻（BOO）中已經報道了NGF 水平的變化［32］。從那時起，NGF 的產生在動物模型和各種疾病，如間質性膀胱炎、慢性盆腔疼痛及OAB 患者中反復表達。KLINGER 等［33］研究人員提出，尿NGF 水平可以作為區分膀胱功能障礙病因的診斷生物標志物。此外，有實驗證據表明，對NGF系統的干預改善了多種類型的膀胱過度活動，使NGF 成為治療人類膀胱功能障礙的重要目標［34］。

6 NGF/TrkA 信號通路與膀胱過度活動征

膀胱過度活動癥主要以尿急為主，且伴有逼尿肌過度活動（DO），伴或不伴尿失禁、尿頻和夜尿癥，這說明膀胱過度活動癥的感覺性膀胱通路存在缺陷［35］。OAB 癥狀存在多種原因。包括BOO，最常見的原因是良性前列腺增生（BPH），糖尿病導致的膀胱疾病，神經源性DO（通常由于脊髓損傷）和特發性DO［36］。CHARRUA 等［37］指出，NGF/TrkA 信號通路很可能參與OAB 的發病機制。RANA 等［38］提出，NGF/TrkA 信號通路是BOO 相關排尿功能障礙的關鍵通路，它影響感覺傳入/交感神經傳出物的生長和表型，與肥厚膀胱中的膀胱平滑肌細胞生長相協調。有趣的是，NGF/TrkA 信號通路的表達量可能是由鈣通道拮抗劑來調節。在顯示不穩定排尿模式的大鼠中，膀胱NGF 表達的升高持續存在，包括較短的排尿收縮間隔和非排尿收縮［39］。YOSHIMURA 等［40］提出，NGF/TrkA 信號通路參與調節由脊髓損傷（SCI）誘導的脊髓排尿通路的重塑。在大鼠中，SCI 導致NGF mRNA 急性升高，但在SCI 初期，膀胱組織中的NGF 蛋白含量降低，而在數周之內mRNA 和蛋白均升高。在慢性SCI 中的L6-S1-膀胱傳入DRG 及MPG 中，TrkA 表達和磷酸化似乎增強［41］。小鼠研究暗示了NGF/TrkA 在SCI 誘導的排尿通路重塑性的因果關系：在SCI 減少不受抑制的膀胱收縮及最大排尿壓力和逼尿肌-括約肌協同失調后，鞘內連續遞送NGF 單克隆抗體2 周，不影響膀胱收縮間隔、基線膀胱內壓力、排尿壓力閾值及膀胱容量［42］。這與脊髓和DRG 中的NGF/TrkA 水平降低有關，而與膀胱中的NGF/TrkA 水平無關［43］。除SCI 外，外周膀胱去神經支配也會導致神經源性膀胱過度活動，根據一個經過充分驗證的概念，靶標去神經支配可能導致神經營養因子的過度產生［44］。因此，單側神經節切除術（膀胱去神經支配）或節后膀胱神經元與成年大鼠的中樞神經系統分離（膀胱和神經節分離）導致膀胱NGF 水平增加10 倍之多，這與供應膀胱和膀胱平滑肌細胞肥大的盆腔神經節中神經元肥大相關［45］。NGF 蛋白和mRNA 水平在受神經結扎后影響體細胞和內臟膀胱感覺通路的雌性大鼠的膀胱組織中也升高［46］。這種情況與漏點壓力的降低、排尿頻率增加以及排尿量的減少有關。更有研究表示，在神經源性DO 患者中，膀胱NGF/TrkA 信號通路蛋白水平通過3 個月的膀胱內A 型肉毒桿菌毒素治療得到改善，同時尿失禁發作次數減少以及尿動力學參數有所改善，包括最大逼尿肌壓力和最大膀胱容量等［47］。

7 NGF/TrkA 信號和間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征

NGF 可由各種炎癥細胞（如淋巴細胞和肥大細胞）合成，并可能作為將超敏反應和疼痛反應與各種炎癥狀態（包括氣道，過敏或神經源性炎癥）聯系起來的重要因素［48］。在人類膀胱組織中，間質性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征（IC/PBS）表現為尿急、尿頻、夜尿癥以及重度恥骨上以及盆腔疼痛［49］。這歸因于膀胱的感覺超敏反應，臨床上表現為少量尿液即產生嚴重的疼痛或排尿急迫感，從而導致尿急尿頻，但這種情況的原因尚未明確［50］。有研究顯示，大鼠的膀胱炎癥與NGF/TrkA信號通路產生增加有關，但是與炎癥刺激的類型無關［51］。所有形式的炎癥由于NGF 活性過高也伴隨著感覺和運動膀胱神經元的形態變化［52］。在大腸桿菌LPS 滴注小鼠中觀察到NGF 免疫染色和蛋白水平存在短暫的增加以及NGF mRNA 的表達穩步升高。而且發現，在膀胱內滴注LPS 后，NGF是mRNA 微陣列中最早的上調基因之一［53］。到目前為止，最廣泛使用的間質性膀胱炎模型是通過腹腔注射大劑量環磷酰胺（CYP）來實現的。這是因為CYP 代謝物丙烯醛濃縮之后在膀胱中形成，產生膀胱組織刺激、單核細胞浸潤、DO 以及膀胱重量增加等情況，并在CYP 注射后4 h 后產生痛覺過敏［54］。CYP 間質性膀胱炎大鼠的膀胱組織、DRG 組織及MPG 組織中，可見NGF/TrkA 信號通路表達增加［55］。SIMONETTI 等［56］的研究證實，隨著DRG 神經元中的NGF/TrkA 信號通路的增加，整個膀胱組織中的NGF 蛋白表達降低，而有學者發現CYP 注射大鼠的膀胱黏膜和逼尿肌中的NGF免疫反應性增加。炎癥刺激在NGF/TrkA 信號通路中的作用也因為發現血管活性腸肽（VIP）敲除小鼠的CYP 間質性膀胱炎的膀胱組織中NGF 的升高而提出，因為VIP 暗示在膀胱中具有抗炎特性［57］。LEE 等［58］及其團隊的實驗表明，細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）的全身抑制阻止了CYP大鼠膀胱中的排尿變化以及NGF 蛋白的升高。隨著NGF 在膀胱組織中的表達，CYP 間質性膀胱炎報道了神經中兩種NGF 受體的空間表達的上調和變化［59］。在CYP 注射之后，TrkA 似乎在DRG、MPG 及BSMC 中都有上調。與實驗性間質性膀胱炎模型類似，在IC/PBS 患者中也報告了NGF/TrkA信號通路系統的改變。膀胱功能障礙（包括膀胱過度活動癥、慢性膀胱炎或IC/PBS）的女性對膀胱NGF 的免疫反應性大于對照組癥狀［60］。GIANNANTONI 等［61］得出結論，IC/PBS 患者被發現表現出更強的膀胱NGF 免疫染色和升高的mRNA 水平，這可以通過用膀胱內肉毒桿菌A 毒素注射來減輕疼痛。

8 慢性盆腔疼痛綜合征中的NGF/TrkA 信號通路和內臟反射誘導的膀胱功能障礙

膀胱功能障礙通常是IC/PBS 以外的慢性盆腔疼痛綜合征的一部分。這些綜合征涉及過度炎癥或者是涉及多個盆腔器官的功能障礙［62］。FALL等［63］的研究表明，對一個盆腔器官的持續刺激和傳入刺激可能導致另一個盆腔器官的神經源性刺激和交叉致敏，具有交叉輸入的特點，例如膀胱。在實驗設置中，直腸滴注三硝基苯磺酸引起的結腸刺激使排尿量減少，排尿頻率增加，這與膀胱肥大細胞大量涌入和NGF mRNA 水平升高有關。又例如，前列腺內注射福爾馬林會導致膀胱反射亢進、水腫以及膀胱和L6/S1 脊髓中NGF 蛋白和mRNA 的增加。這兩項研究都表明，NGF/TrkA 信號通路可能是神經源性內臟-內臟反射途徑的介質之一，誘導其他盆腔器官刺激后膀胱交叉致敏。

9 結論

縱觀以上的基礎和臨床研究，發現膀胱中的NGF/TrkA 信號通路不僅僅是控制發育，生長和損傷期間器官神經支配的經典生長因子，而且在患病狀態下可以調節排尿反射和疼痛感，至少在嚙齒動物中，其活性似乎是排尿反射正常功能所必需的。在不久的將來，使用新的實驗方式，如尿路上皮特異性NGF 轉基因小鼠或更特異性的低分子量NGF 受體調節劑，來解決更多的科學問題，包括TrkA/p75 之間的相互作用，排尿通路中的外周與中樞NGF/TrkA 信號通路的效應，或NGF 與其他神經營養因子的相互作用，都可以更好地解決。