黃芪多糖介導Nrf2-HO-1/NQO1信號通路促進大鼠難愈創面的愈合

徐燕婷 李哲明 范麗娜

[摘要]?目的?研究黃芪多糖對創面難愈合大鼠創面的促愈合作用及對核因子E2相關因子2（nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2，Nrf2）-血紅素氧合酶1（heme?oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化還原酶1（NADPH?quinone?oxidoreductase?1，NQO1）信號通路表達的影響。方法?18只SD大鼠用于構建慢性難愈合創面模型，造模成功后隨機分為模型組、黃芪多糖組、京萬紅軟膏組，另6只大鼠納入空白對照組，藥物涂抹創面21d，期間分析大鼠創面愈合情況。蘇木精-伊紅染色觀察各組大鼠創面組織病理變化情況，全自動生化儀檢測血清中超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；酶聯免疫吸附測定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）檢測血清中腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6水平；蛋白質免疫印跡（Western?blot）檢測大鼠創面組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達水平。結果?與空白對照組比較，模型組大鼠的創面組織病理改變明顯，血清SOD、GSH-Px活性下降，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平上升（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平升高（P<0.05）。與模型組相比，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠治療第7、14、21d的創面愈合率均顯著提高，創面組織病理改變均明顯減輕，血清SOD與GSH-Px活性均提高，而MDA、TNF-α、IL-1β及IL-6水平均下降（P<0.01），Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平均升高（P<0.05）。結論?黃芪多糖可通過抑制氧化應激及炎癥反應促進大鼠難愈創面的愈合，并進一步激活組織Nrf2-HO-1/NQO1信號通路表達。

[關鍵詞]?黃芪多糖；氧化應激；炎癥；Nrf2-HO-1/NQO1信號通路

[中圖分類號]?R96??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.009

Astragalus?polysaccharide?mediates?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway?to?promote?the?healing?of?refractory?wounds?in?rats

XU?Yanting1，?LI?Zheming2，?FAN?Lina3

1.Department?of?Pharmacy，?Hangzhou?Fuyang?Traditional?Chinese?Medicine?Orthopedic?Hospital，?Hangzhou?311400，?Zhejiang，?China;?2.Pharmacy?School?of?Hangzhou?Medical?College，?Hangzhou?310050，?Zhejiang，?China;?3.Department?of?Dermatology，?Yuhang?Maternal?and?Child?Health?Hospital?of?Hangzhou，?Hangzhou?311100，?Zhejiang，?China

[Abstract]?Objective?To?investigate?the?healing?promoting?effect?of?astragalus?polysaccharide?on?wound?in?rats?with?chronic?wound?healing?and?its?impact?on?nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2?（Nrf2）-heme?oxygenase-1?（HO-1）/?NADPH?quinone?oxidoreductase?1?（NQO1）?pathway.?Methods?18?SD?rats?were?used?to?eatablish?chronic?refractory?wound?model，?then?rats?were?randomly?divided?into?model?group，?astragalus?polysaccharide?group，?and?Jingwanhong?ointment?group，?another?6?rats?were?divided?into?blank?control?group，?drug?applied?for?21?days?and?analyzed?wound?healing?rates?during?period.?Haematoxylin-eosin?staining?was?used?to?observe?the?pathological?changes?of?the?wound?tissue，?automatic?biochemical?analyzer?was?used?to?detect?serum?superoxide?dismutase?（SOD），?glutathione?peroxidase?（GSH-Px）?and?malondialdehyde?（MDA）?levels，?enzyme?linked?immunosorbent?assay?（ELISA）?was?used?to?detect?serum?tumor?necrosis?factor-α?（TNF-α），?interleukin?（IL）-1β，?and?IL-6?levels，?and?Western?blot?was?used?to?detect?Nrf2，?HO-1，?NQO1?protein?expression?in?wound?tissue.?Results?Compared?to?blank?control?group，?the?pathological?changes?in?wound?tissue?of?model?group?rats?were?obvious，?serum?SOD?and?GSH-Px?activities?were?decreased，?the?MDA，?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6?levels?were?increased?（P<0.01），?protein?expression?of?Nrf2，?HO-1，?NQO1?were?increased?（P<0.05）.?Compared?to?the?model?group，?the?healing?rates?of?astragalus?polysaccharide?group?and?Jingwanhong?ointment?group?were?significantly?increased?on?7，?14，?21?days，?the?pathological?changes?of?wound?tissue?were?remarkably?alleviated，?serum?SOD?and?GSH-Px?activities?were?increased，?while?the?levels?of?MDA，?TNF-α，?IL-1β?and?IL-6?decreased?（P<0.01），?protein?expression?of?Nrf2，?NQO1，?HO-1?were?increased?（P<0.05）.?Conclusion?Astragalus?polysaccharide?promoted?the?healing?of?refractory?wounds?in?rats?by?inhibiting?oxidative?stress?and?inflammation，?and?further?activated?the?expression?of?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway?in?tissue.

[Key?words]?Astragalus?polysaccharide;?Oxidative?stress;?Inflammation;?Nrf2-HO-1/NQO1?signaling?pathway

慢性難愈合創傷可由多種急、慢性創傷等經久不愈所致，并具有合并復雜基礎疾病的特點，是臨床治療過程中急需關注的棘手難題[1-2]。目前，慢性創面的治療方式有藥物治療、手術清創聯合引流及各類細胞生長因子制劑治療等[3-4]。慢性創面治療所面臨的長期復雜療程和昂貴費用會對患者的生理、心理和家庭經濟造成嚴重影響，因此尋求簡單、有效的治療藥物對患者具有積極意義。

中醫利用中藥方劑治療皮膚創傷由來已久，中藥效用成分能通過改善創面微環境，達到祛腐生肌、促進創面愈合的效果，具有方便、有效的優點[5]。中藥黃芪（Astragalus?membranaceus）始載于《神農本草經》，其功效以排膿治癰為主，可用于治療瘡瘍久潰[6]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，可通過降低炎癥因子水平，起到改善組織損傷的作用[7-9]。核因子E2相關因子2（nuclear?factor erythroid?2?related?factor?2，Nrf2）-血紅素氧合酶1（heme?oxygenase-1，HO-1）/NADPH醌氧化還原酶1（NADPH?quinone?oxidoreductase?1，NQO1）信號通路可通過抗氧化應激、抑制炎癥反應發揮創面的促愈合作用[10]。本研究通過建立慢性難愈合創傷大鼠模型，探究黃芪多糖對難愈創面的改善作用及對Nrf2-HO-1/NQO1信號通路的影響，現報道如下。

1??材料及方法

1.1??實驗動物

SPF級SD大鼠24只，體質量（200±20）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物生產許可證號SCXK（滬）2018-0008]，飼養于杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心[動物使用許可證號SYXK（浙）2020-0024]，飼養環境室溫（22±2）°C，相對濕度50%～75%。實驗經杭州鷹旸生物醫藥研發中心實驗動物倫理委員會審批通過（倫理審批號：EYOUNG-20210304-02）。

1.2??實驗試劑

黃芪多糖（生產單位：上海源葉生物科技公司，生產批號：H15J52S137204，規格：25g、純度60%），京萬紅軟膏（批準文號：國藥準字Z12020440，生產單位：天津達仁堂京萬紅藥業，規格：50g/支），蘇木精–伊紅染液（生產單位：武漢塞維爾生物科技公司，生產批號：202012），BCA蛋白定量試劑盒（生產單位：北京索萊寶科技公司，生產批號：20201226），Nrf2、HO-1、NQO1（生產單位：美國Affinity抗體公司，生產批號：86e7450、24l5591、12C5034），大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor?necrosis?factor-α，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6的酶聯免疫吸附測定（enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA）試劑盒（生產單位：江蘇酶免公司，生產批號：202101、202103、202101）。

1.3??實驗儀器

Nikon?Eclipse?E100型正置光學顯微鏡（日本尼康公司），610020-9Q型化學發光儀（上海勤翔公司），CMaxPlus酶標儀（美國MD公司），C16000型全自動生化檢測儀（美國雅培公司），Image-ProPlus（IPP）6.0圖像分析軟件。

1.4??慢性難愈創傷大鼠造模和實驗分組

24只大鼠適應性喂養一周，隨機分為空白對照組、模型組、黃芪多糖組和京萬紅軟膏組，每組6只。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，在無菌環境下剃毛，裸露脊柱兩側腰椎部位皮膚，標記1.5cm直徑的造模區域。除空白對照組大鼠外，其余組大鼠根據標記部位制備直達筋膜的開放性傷口，并注射醋酸氫化可的松（6mg/100g）建立慢性難愈合創面模型[11]。

1.5??藥物制備及給藥

在完成造模給藥前，觀察造模大鼠創面傷口，對已有愈合跡象的傷口進行輕度撕裂，防止實驗開始前傷口已出現愈合。根據分組對大鼠傷口涂抹藥物：黃芪多糖組在創面部位涂抹0.5g黃芪多糖藥物（藥物成分：黃芪多糖∶凡士林∶十二烷基硫酸鈉∶水=2∶60∶2∶65）；京萬紅軟膏組在創面部位給予京萬紅軟膏涂抹（0.6g）；模型組大鼠在創面部位涂抹等量凡士林（成分：生理鹽水∶凡士林∶十二烷基硫酸鈉∶水=2∶60∶2∶65）；空白對照組則在剃毛部位給予等量生理鹽水涂抹。每天給藥1次，連續3周。

1.6??大鼠創面愈合情況分析

給藥期間于7、14、21d，用IPP?6.0圖像分析軟件分析大鼠的創傷面積，計算創面愈合率。

1.7??血清氧化應激指標檢測

給藥結束24h后，二氧化碳安樂死大鼠，采集血樣分離得到血清。全自動生物化學檢測儀檢測超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.8??血清炎性細胞因子檢測

取大鼠的血清，根據ELISA試劑盒說明進行操作，測定TNF-α、IL-1β與IL-6含量。

1.9??蘇木精-伊紅染色

切取大鼠創面組織皮膚置入4%多聚甲醛溶液中固定，在脫水、包埋、切片后用蘇木精–伊紅染色，脫水并用中性樹脂封固后，顯微鏡觀察組織病理改變和各類炎性細胞浸潤情況。

1.10??Western?blot檢測蛋白表達

100mg大鼠創面組織樣品，勻碎提取組織蛋白，BCA法測定總蛋白濃度。經聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離目標蛋白，轉膜，清洗。封閉后，加入含Nrf2、NQO1、HO-1抗體的稀釋液，4℃孵育過夜。吸棄一抗，清洗，加二抗，室溫下搖床振蕩反應1～2?h，清洗。以β-actin蛋白為內參，用化學發光儀顯影，chemi?capture軟件分析圖像，測定各組大鼠創面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平，實驗重復3次。

1.11??統計學方法

采用SPSS?16.0軟件對數據進行分析，計量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD分析。方差不齊者采用Kruskal-?Wallis?H檢驗。所有數據以均數±標準差（）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2??結果

2.1??黃芪多糖對創面難愈合大鼠創面愈合的影響

各組大鼠的創面隨時間逐漸愈合，愈合率逐漸升高。在給藥的7、14、21d，黃芪多糖組與京萬紅軟膏組大鼠傷口愈合率均顯著高于模型組（P<0.01），見圖1。

2.2??黃芪多糖對創面難愈合大鼠氧化應激反應的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠血清中的SOD、GSH-Px活性顯著下降（P<0.01），MDA含量顯著上升（P<0.01）。與模型組相比，黃芪多糖和京萬紅軟膏組大鼠的SOD、GSH-Px活性顯著上升（P<0.01），MDA含量顯著降低（P<0.01），見圖2。

2.3??黃芪多糖對創面難愈合大鼠創面組織病理變化的影響

空白對照組大鼠創面組織結構完整，形態正常。模型組大鼠創面組織出現紅腫炎癥，各類炎性細胞聚集明顯（圖3箭頭），形成的新生肉芽組織較薄。與模型組相比，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠創面組織的紅腫程度明顯減輕，少量炎性細胞聚集（圖3箭頭），新生肉芽組織形成較良好，見圖3。

2.4??黃芪多糖對創面難愈合大鼠炎癥反應的影響

與空白對照組相比，模型組大鼠血清的TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，黃芪多糖組與京萬紅軟膏組大鼠血清中的TNF-α、IL-1β與IL-6含量顯著降低（P<0.01），見圖4。

2.5??黃芪多糖對創面難愈合大鼠創面組織中Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠創面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，黃芪多糖組和京萬紅軟膏組大鼠創面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），見圖5。

3??討論

皮膚創傷愈合是體內及組織中許多因子發生相應調節、修復損傷組織的過程[12]。損傷后創面愈合可分為止血后炎癥、增殖及組織重塑三個階段。在愈合微環境改變的過程中，損傷刺激持續存在、氧化應激及炎癥反應增加均能影響創面的正常愈合，導致創面難愈[10]。炎癥反應是創面損傷最重要的反應，過度炎癥反應可激發細胞進入氧化應激狀態，干擾創面修復[13]。

大量研究表明，中藥外用制劑可通過調控細胞因子促進創面愈合[1]；黃芪多糖可通過下調重癥燒傷患者全身炎性細胞因子IL-6和TNF-α水平促進創面愈合[7]。SOD、GSH-Px是存儲于細胞內的內源性抗氧化酶，兩者發揮清除自由基、保護組織的作用；而MDA為脂質氧化產物，在創面組織中水平增高[14-15]。本研究結果顯示，黃芪多糖可顯著降低MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平，提高創面難愈大鼠血清的SOD、GSH-Px活性，提示黃芪多糖具有抑制慢性創面難愈大鼠體內氧化應激及炎癥反應的作用，同時大鼠使用黃芪多糖后的第7、14、21d創面愈合率均顯著升高，損傷組織內炎性細胞浸潤程度降低，新生肉芽組織增生增加，提示黃芪多糖通過抑制氧化應激和炎癥反應促進大鼠難愈創面的愈合。

Nrf2的表達能促進細胞抗氧化酶的分泌及活性，且研究發現Nrf2相關通路的激活可減輕急性損傷引起的氧化應激和炎癥反應[13，16-18]。研究顯示Nrf2-HO-1/NQO1信號通路激活可增強糖尿病小鼠潰瘍皮膚的抗氧化功能并減弱炎癥反應，提示其對傷口愈合具有積極作用[19-20]。本研究結果顯示，模型大鼠難愈創面組織的Nrf2-HO-1/NQO1信號通路表達上調，而黃芪多糖則能進一步促進大鼠創面組織中的Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表達水平，推測黃芪多糖通過促進Nrf2-HO-1/NQO1信號通路相關因子的表達，抑制創面氧化應激反應，促進大鼠難愈創面的愈合。

綜上所述，本研究結果顯示外用黃芪多糖對創面難愈合大鼠的創面愈合起促進作用，其作用可能是通過促進Nrf2-HO-1/NQO1信號通路表達，上調氧活性、下調炎癥因子水平實現。

[參考文獻][1] 楊露，?張永萍，?彭麗華.?中藥及其外用制劑調控細胞因子促創面愈合的研究進展[J].?中國中藥雜志，?2021，?46（20）：?5173–5184.