“知母-牡丹皮”治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡作用機(jī)制探討*

胡賽賽，萬(wàn)磊，劉健，黃傳兵，李方澤，陳瑩瑩，程靜

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 安徽合肥 230031

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種較為復(fù)雜的自身免疫性疾病，可能會(huì)累及到身體的多個(gè)臟器和系統(tǒng)，常見的有腎臟、心臟、肺部、腦、皮膚和血液等[1]。目前較常見的治療手段主要是糖皮質(zhì)激素聯(lián)合免疫抑制劑，近些年來(lái)生物制劑的應(yīng)用也逐漸廣泛起來(lái)[2]。目前患者的生存率已有大幅度的升高[3]，但SLE患者臨床表現(xiàn)多樣，部分病人無(wú)法耐受糖皮質(zhì)激素的治療，且其不良反應(yīng)令人聞之色變，西醫(yī)治療目前可選擇的藥物還十分有限。SLE患者的臨床表現(xiàn)差異明顯，臨床表現(xiàn)各異也是其漏診率、誤診率高的一個(gè)原因，而這正與中醫(yī)學(xué)所遵循的“辨證論治”相呼應(yīng)。中醫(yī)治療可以根據(jù)病人相應(yīng)的癥狀提供個(gè)體化的治療方案，改善其癥狀，減輕西藥的不良反應(yīng)，協(xié)助減少西藥用量等，最終達(dá)到提高生活質(zhì)量的目的[4]。知母、牡丹皮在治療SLE中應(yīng)用廣泛，但目前知母-牡丹皮治療SLE尚缺乏依據(jù)合理解釋其作用機(jī)制[5]，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法分析“知母-牡丹皮”治療 SLE 的有效成分及目標(biāo)靶點(diǎn)，以期更好的探討知母-牡丹皮治療SLE的作用機(jī)制。

資料與方法

1 知母-牡丹皮有效成分及靶點(diǎn)的篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP，輸入知母、牡丹皮為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，制定篩選標(biāo)準(zhǔn)：口服生物利用度（OB）≥30%、化合物類藥性（DL）≥0.18，篩選出知母-牡丹皮的有效成分，并統(tǒng)計(jì)其相應(yīng)的靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為基因靶點(diǎn)，得到知母-牡丹皮有效成分及其相應(yīng)靶點(diǎn)。

2 SLE疾病靶點(diǎn)的篩選

以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank及DisGeNE數(shù)據(jù)庫(kù)檢索SLE的疾病靶點(diǎn)。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖以及構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

使用Draw Venn Diagram 工具，將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮相關(guān)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖。將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮有效成分及其相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

4 “SLE—知母-牡丹皮”的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

取SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮蛋白靶點(diǎn)的交集，將其導(dǎo)入String平臺(tái)，選擇 “Multiple proteins”，選擇物種為人類，構(gòu)建其PPI圖，再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.9.1，進(jìn)一步對(duì)信息進(jìn)行分析，篩選出關(guān)鍵基因。

5 交集基因的富集分析

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出來(lái)的交集基因進(jìn)行分析，使用ChiPlot繪制出富集分析的氣泡圖，以探討知母-牡丹皮對(duì)SLE在基因及信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的信息。

6 知母-牡丹皮主要有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證

通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)得到目標(biāo)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的PDB ID，通過(guò)其ID號(hào)在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載目標(biāo)靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，使用PyMol軟件去除蛋白結(jié)構(gòu)外的其他小分子，再將其導(dǎo)入AutoDock Tools處理后設(shè)置為受體蛋白。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載有效成分的小分子結(jié)構(gòu)，使用AutoDock Tools處理后設(shè)置為配體小分子。再進(jìn)一步進(jìn)行分子對(duì)接，將結(jié)合能最低的構(gòu)象導(dǎo)出作為最佳結(jié)合構(gòu)象，保存后用PyMol軟件對(duì)其進(jìn)行可視化處理。

結(jié) 果

1 知母-牡丹皮有效成分及靶點(diǎn)的篩選

在 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別搜索知母、牡丹皮，設(shè)置OB≥30%和 DL≥0.18作為篩選條件進(jìn)行篩選，檢索出知母-牡丹皮中化合物共有16個(gè)，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)出其相應(yīng)靶點(diǎn)，其中知母168個(gè)、牡丹皮200個(gè)。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化命名后刪除其中的重復(fù)項(xiàng)，最終共獲得靶點(diǎn)193個(gè)。

2 SLE疾病靶點(diǎn)的篩選

以“Systemic Lupus Erythematosus”為檢索詞在GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)查詢疾病靶點(diǎn)，分別得到4906、112、30、226、33個(gè)基因。對(duì) GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的結(jié)果以Gifts大于等于平均值（≥29）進(jìn)行篩選得到基因3147個(gè)，將得到的所有基因進(jìn)行匯總，經(jīng)去重后共得到SLE相關(guān)疾病基因3224個(gè)。

3 作“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖以及構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮相關(guān)基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram 工具，得到“SLE—知母-牡丹皮”Venn圖，得到交集靶點(diǎn)共127個(gè)（圖1）。將SLE疾病靶點(diǎn)與知母-牡丹皮有效成分及其相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape3.9.1，結(jié)果顯示知母-牡丹皮中的16種活性化合物與127個(gè)疾病基因相互作用，共同構(gòu)建“中藥—有效成分—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。分析計(jì)算得到degree值排名前五的活性化合物（表1），表明知母-牡丹皮中對(duì)SLE起主要治療作用的有效化合物主要為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、淫羊藿苷元（Anhydroicaritin）、豆甾醇（Stigmasterol）和薯蕷皂苷元（diosgenin）等。

表1 “知母-牡丹皮”主要活性化合物

圖1 “知母-牡丹皮”藥對(duì)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡Venn圖

圖2 “中藥-有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

4 “SLE—知母-牡丹皮”的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

取SLE靶點(diǎn)與知母-牡丹皮靶點(diǎn)的交集，127個(gè)潛在靶點(diǎn)，將其導(dǎo)入String平臺(tái)，選擇 “Multiple proteins”，選擇物種為人類，構(gòu)建其PPI初步圖，再將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，使用Tools中的Analyze Network對(duì)信息進(jìn)行分析作圖，根據(jù)其Degree值進(jìn)行排序，并篩選出關(guān)鍵基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3），圖中degree值越大，則節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，靶點(diǎn)之間聯(lián)系越密切。排名前五的基因分別為AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53；這5個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白間互作影響力最強(qiáng)，能在復(fù)雜的疾病調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中直接或間接影響其他大部分靶點(diǎn)通路，可能是研究藥物治療SLE的關(guān)鍵。

圖3 知母-牡丹皮治療SLE潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

5 “SLE—知母-牡丹皮”交集基因的富集分析結(jié)果

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出來(lái)的交集基因進(jìn)行KEGG、GO富集分析，結(jié)果顯示KEGG共獲得194條富集結(jié)果，GO共獲得1877條富集結(jié)果，其中GO生物過(guò)程（biological process，BP）1646條；GO分子功能（molecular function，MF）150條；GO細(xì)胞組分（cellular components，CC）81條。選取具有代表性的集群的富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析，使用ChiPlot繪制出KEGG分析圖和GO分析圖（圖4、圖5），其中橫坐標(biāo)為GeneRatio，縱坐標(biāo)為富集到的結(jié)果名稱。這進(jìn)一步解釋了知母-牡丹皮治療SLE的潛在機(jī)制，幫助我們進(jìn)一步了解知母-牡丹皮治療疾病時(shí)參與的調(diào)節(jié)方式。

圖4 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點(diǎn)”的KEGG富集分析

圖5 知母-牡丹皮和SLE“交集靶點(diǎn)”的GO富集分析

6 知母-牡丹皮主要活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)一步對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行分析，選擇篩選后得到的有效成分和目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，對(duì)知母-牡丹皮中有效成分治療SLE的能力進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)表1得到的結(jié)果，選擇來(lái)自知母-牡丹皮的槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元這5個(gè)活性成分作為對(duì)接配體。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選出的關(guān)鍵基因，選取排名前5的核心靶點(diǎn)：AKT1、TNF、IL-6、VEGFA、TP53作為對(duì)接受體。通過(guò)結(jié)合能（Affinity）來(lái)評(píng)估有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)合的緊密程度，結(jié)合能越低表明配體與受體之間的結(jié)合越緊密。表2列舉出了排名前15的對(duì)接結(jié)果。使用Pymol軟件對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步處理（圖6），其中淺藍(lán)色為受體蛋白，深藍(lán)色為配體小分子，紅色為配體與受體結(jié)合的氨基酸殘基，黃色虛線為配體與受體之間形成的氫鍵。分子對(duì)接結(jié)果顯示有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)之間可以較好的結(jié)合。

表2 主要有效成分與目標(biāo)靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

圖6 部分分子對(duì)接結(jié)構(gòu)圖

討 論

在本文所示的研究中，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出了16個(gè)知母-牡丹皮藥對(duì)的活性成分和127個(gè)與SLE相關(guān)的基因靶點(diǎn)。結(jié)果表明，知母-牡丹皮藥對(duì)在多組分和多目標(biāo)組合治療SLE中發(fā)揮一定的作用，對(duì)治療SLE具有潛在優(yōu)勢(shì)。有醫(yī)家認(rèn)為SLE在急性活動(dòng)期的主要證型多為熱毒熾盛證，其治法多以清熱為主[6]。知母和牡丹皮同屬清熱藥，知母有清熱潤(rùn)燥之效，牡丹皮有清熱涼血之效。本研究選取degree值排名前5的活性成分和排名前5的核心基因進(jìn)行分子對(duì)接，有效成分分別為槲皮素、山柰酚、淫羊藿苷元、豆甾醇和薯蕷皂苷元，主要起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用；核心基因?yàn)锳KT1、TNF、IL-6、VEGFA和TP53，主要在調(diào)節(jié)免疫、炎癥、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖等方面起作用。

槲皮素廣泛存在于多種植物中，實(shí)驗(yàn)研究表明槲皮素具有降血糖、抗過(guò)敏、抗炎、抗腫瘤等作用[7]。有研究表明槲皮素具有腎臟抗炎活性，主要通過(guò)抑制腎臟中的巨噬細(xì)胞極化抑制腎小管間質(zhì)損傷并且能夠減少機(jī)體中的炎癥因子[8]。槲皮素可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身免疫，減少機(jī)體中的炎癥因子，改善患者的腎臟功能，對(duì)狼瘡腎炎有一定的指導(dǎo)意義[9]。山奈酚及其衍生物可以減少人體內(nèi)的脂質(zhì)氧化，防止器官和細(xì)胞結(jié)構(gòu)惡化，具有抗菌、抗癌、保護(hù)神經(jīng)和保護(hù)肝臟等作用[10]。淫羊藿苷元是一種主要來(lái)自中藥淫羊藿的化合物，研究表明淫羊藿苷元可以通過(guò)調(diào)節(jié)功能，進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，從而恢復(fù)異常信號(hào)通路[11]。淫羊藿苷元可以抑制調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，從而抑制SLE患者免疫細(xì)胞的過(guò)度活化。且實(shí)驗(yàn)證實(shí)其治療小鼠腎臟損傷有一定療效[12]。豆甾醇是一種植物甾醇，具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，但其機(jī)制尚未明確。有研究表明，豆甾醇可以顯著抑制促炎介質(zhì)的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而改善機(jī)體的炎癥狀態(tài)[13]。薯蕷皂苷元已被證實(shí)具有抗氧化，抗炎和抗癌等的作用。薯蕷皂苷元可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的活化，抑制CD4+T細(xì)胞增殖，阻礙Th1/Th17細(xì)胞分化[14]。AKT1在蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到重要作用，AKT1的表達(dá)增加，會(huì)使促炎細(xì)胞因子表達(dá)增加，進(jìn)而Treg相關(guān)基因表達(dá)增加，提示存在與炎癥活動(dòng)相反的調(diào)節(jié)反饋[15]。TNF與自身免疫性疾病的易感性相關(guān)，有研究表明SLE的疾病活動(dòng)評(píng)分與TNF-α水平呈現(xiàn)正相關(guān)[16]。IL-6由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生，有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等作用[17]，有研究表明IL-6水平在SLE患者中顯著高于健康人，在SLE患者中，活動(dòng)期高于非活動(dòng)期。靶向調(diào)節(jié)IL-6的表達(dá)，有望改善SLE患者的臨床癥狀[18]。VEGFA是一種多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)新生毛細(xì)血管的生成，并且其是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能對(duì)治療狼瘡腎炎具有指導(dǎo)意義[19]。TP53是一種腫瘤抑制基因，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的作用，有研究表明TP53與SLE發(fā)病之間存在顯著關(guān)聯(lián)[20]。通過(guò)以上作用機(jī)制的分析，為進(jìn)一步預(yù)測(cè)知母-牡丹皮對(duì)SLE的治療機(jī)制，我們對(duì)GO和KEGG進(jìn)行了富集分析。結(jié)果表明，知母-牡丹皮在治療SLE中參與了生物過(guò)程中的細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)、無(wú)機(jī)物、脂多糖、激素、氮化合物的反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等；分子功能中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白激酶活性等；細(xì)胞組分中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑復(fù)合物、膜筏、囊泡腔等。KEGG顯示知母-牡丹皮治療SLE涉及的通路主要有鈣信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、cAMP信號(hào)、松弛素信號(hào)通路及Apelin信號(hào)通路等。這些通路在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血流、信號(hào)傳導(dǎo)等方面有重要意義。

本文綜合了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，初步從分子水平上展示了知母-牡丹皮的多組分、多靶點(diǎn)、多通道治療SLE的現(xiàn)代應(yīng)用價(jià)值，從而為知母-牡丹皮臨床治療SLE提供指導(dǎo)意義。