石榴汁對葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠潰瘍性結腸炎的作用

吳淑娟，王新軍，張武勝，孟衛紅，夏禹承，張潤光，張有林,*

（1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710119；2.陜西潼關縣紅寶石軟籽石榴農民專業合作社，陜西 渭南 714300）

結腸炎是一種由細菌、真菌感染或遺傳、免疫及環境等多種因素引發的炎癥性腸病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病[1]。其中，UC主要表現為腹痛、腹瀉、便血等癥狀，伴隨強烈的氧化應激和細胞炎癥因子的聚集，且病程長、易反復，長期的慢性炎癥狀態易引發結腸癌及其他相關疾病[2]，多數研究認為其發病機制與各因素共同作用引起的中性粒細胞增生、腸黏膜屏障損傷、促炎因子過度表達及腸道菌群異常免疫反應[3-5]有關。目前主要通過生物制劑、免疫調節劑等藥物治療[6]，但藥物治療往往表現出長期依賴、暫時愈合及不可預測的副作用，因此利用天然產物的營養療法逐漸受到人們的關注和青睞[7-9]。

石榴（Punica granatumL.）被譽為“天下奇果”，因其富含碳水化合物、氨基酸、多酚、黃酮類化合物等營養物質，在傳統醫學中具有很高的藥食兩用價值。據報道，石榴具有抗氧化、抗炎、抗菌、預防心血管、糖尿病及神經性系統疾病[10-12]等多種功能。Yang Jieping等[13]報道石榴提取物可通過調節結腸炎相關基因及盲腸微生物組成減輕白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）基因敲除小鼠的結腸炎癥狀；George等[14]發現石榴皮提取物中高濃度的多酚可以減輕鉻引起的腸道內環境紊亂；Parisio等[15]分別利用石榴的全煎劑、多糖、鞣花單寧處理結腸炎SD大鼠，發現三者均能顯著減少由2,4-二硝基苯磺酸引發的結腸變化。石榴汁、石榴皮、石榴渣三者的多酚組成相似，但石榴汁具有更高的抗氧化活性[16]。Seeram等[17]發現由于協同效應石榴汁表現出優于單純安石榴苷或鞣花酸的生物活性。石榴富含營養物質，對人體具有多種有益作用。然而，目前關于石榴汁緩解結腸炎的作用機理以及防御功能的研究較少。本實驗通過研究石榴汁對葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導小鼠結腸炎的防御作用，旨在為利用石榴汁營養療法治療炎癥性腸病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康S P F（無特定病原體）級雌性昆明小鼠，6～8 周齡，體質量20～25 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）2018-001。

突尼斯軟籽石榴購于陜西省渭南市潼關軟籽石榴試驗站。

IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、谷草轉氨酶（aspartate amino transferase，AST）、谷丙轉氨酶（alaninetransaminase，ALT）、肌酐（creatinine，CR）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、NO試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均為分析純，購于西安晶博化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Velocity 18R型高速冷凍離心機 英國Dynamica公司；DW-HL438型超低溫冰箱 合肥美菱股份有限公司；1530型多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；BY-TR型光學顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司；8890-5977B型氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石榴汁的制備

以突尼斯軟籽石榴為原料，通過清洗、去皮、護色液（0.01%（體積分數，下同）VC、0.3%檸檬酸）護色、榨汁、酶解（果膠酶添加量0.09%，酶解溫度40 ℃，酶解時間120 min）、滅酶（90 ℃滅酶10 min）、過濾離心得到石榴汁，4 ℃貯存備用。

1.3.2 小鼠實驗

取12 只雌性昆明小鼠，于溫度20～22 ℃、相對濕度60%、24 h明暗交替的環境下自由飲食進水，適應性喂養7 d后隨機分為2 組，分別為對照組（Normal組）和模型組（DSS組），每組6 只。DSS組每日自由飲用3 g/100 mL的新鮮DSS溶液，連續9 d，對照組飲用無菌水。觀察小鼠的精神狀況并檢測小鼠血清炎癥因子表達。

取30 只雌性昆明小鼠，適應性喂養7 d后隨機分為5 組，分別為對照組（Normal組）、模型組（DSS組）、美沙拉嗪陽性對照組（5-ASA組）、石榴汁低劑量組（LPJ組）、石榴汁高劑量組（HPJ組），每組6 只。除對照組外，其余各組均給予3 g/100 mL DSS溶液，連續9 d自由飲用，每日更換新鮮DSS溶液，造模成功后5-ASA組按照人與動物等效體表面積劑量關系灌胃美沙拉嗪腸溶片（5-ASA，130 mg/（kgmb·d）），LPJ組和HPJ組分別自由飲用30%（體積分數，下同）和100%的石榴汁10 mL/d，對照組和DSS組飲用無菌水。對造模后的小鼠干預14 d后解剖并測定相應指標，實驗周期共23 d。

1.3.3 疾病活動指數測定

每3 d記錄一次小鼠體質量，并觀察小鼠活動狀況、精神狀態、糞便性狀，測定小鼠糞便隱血，按下式計算疾病活動指數（disease activity index，DAI）。DAI評判值及相應評判標準見表1。

表1 小鼠DAI評判值及相應評判標準Table 1 DAI values and its standard in mice

1.3.4 血清生化指標及炎癥因子水平測定

最后一次飼喂結束后，小鼠禁食不禁水12 h，采用150～300 mg/kg戊巴比妥酸鈉注射進行安樂死，腹腔主動脈取血，靜置30 min，3 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min收集血清。取上清液按試劑盒說明書測定小鼠血清ALT、AST、CR、BUN水平，酶聯免疫吸附劑測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平。

1.3.5 結腸氧化應激因子及MPO、NO水平測定

解剖小鼠結腸組織，用預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，按照結腸與PBS質量體積比1∶9冰浴勻漿待用。按照試劑盒方法分別測定結腸氧化應激因子MDA、SOD、GSH-Px和MPO、NO水平。

1.3.6 組織病理學觀察

取新鮮結腸組織用質量分數4%多聚甲醛溶液固定24 h，乙醇梯度脫水后石蠟包埋切片，脫蠟后分別用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）和阿利新藍染液染色并封片，干燥后在顯微鏡下觀察結腸組織形態。

1.3.7 糞便短鏈脂肪酸含量測定

糞便短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）含量的測定參照Wang Guoliang等[18]的方法。SCFAs是含1～6 個碳的飽和脂肪酸，對腸道健康起重要的作用。取0.1 g小鼠糞便樣品與1 mL磷酸溶液（0.1%）渦旋混勻，4 ℃、15 000×g條件下離心10 min，移取上清液并與乙酸乙酯按照體積比1∶1提取，乙酸乙酯萃取相過0.45 μm濾膜，用DB-WAX毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）進行GC-MS分析。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 23.0軟件進行方差分析和Tukey多重比較檢驗，數據以平均值±標準差（n＝6）表示，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 小鼠潰瘍性結腸炎模型構建

根據炎癥因子的表達能準確判斷機體的炎癥狀態，由表2可以看出，模型組小鼠自由飲用DSS溶液9 d后，均出現溏便、血便癥狀，DAI極顯著升高（P＜0.01），各促炎因子的表達水平均約是對照組的2 倍，表明飲用DSS成功誘導了小鼠結腸炎，造模成功。

表2 小鼠炎癥因子表達水平Table 2 Expression levels of inflammatory factors in mice

2.2 石榴汁對結腸炎小鼠體質量和DAI值的影響

由圖1可以看出，對照組小鼠在實驗期間體質量呈現平穩上升趨勢，其余各組在飲用DSS溶液9 d內體質量持續下降，給予美沙拉嗪和石榴汁后小鼠體質量減輕癥狀有所緩解，但LPJ、HPJ組小鼠體質量與DSS組相比無明顯差異，可能是石榴汁抑制了胰脂肪酶的活性，降低了腸道對食物能量的攝取[19]。與DSS組相比，各干預組小鼠的DAI極顯著下降（P＜0.01），表明石榴汁在一定程度上緩解了DSS引起的小鼠結腸炎癥狀。

圖1 石榴汁對結腸炎小鼠體質量（A）及DAI（B）的影響Fig.1 Effect of pomegranate juice on body mass (A) and DAI (B) in mice with colitis

2.3 石榴汁對結腸炎小鼠結腸長度的影響

小鼠結腸長度的變化可以作為評判結腸炎癥的一項重要指標[20]。由圖2可以看出，DSS組小鼠結腸長度較其他各組極顯著縮短（P＜0.01），5-ASA、LPJ、HPJ組小鼠結腸長度接近對照組，其中HPJ組結腸更長，且腸內容物呈現健康的黑色狀態，表明飲用石榴汁可以緩解由DSS引起的小鼠結腸長度縮短。

圖2 石榴汁對結腸炎小鼠結腸長度的影響Fig.2 Effect of pomegranate juice on colon length in mice with colitis

2.4 石榴汁對結腸炎小鼠肝腎功能的影響

潰瘍性結腸炎以及用于治療潰瘍性結腸炎的藥物能引起肝腎受損[21]，ALT、AST均可由肝細胞分泌，當肝細胞出現炎癥及損傷時，它們能以極高的敏感度進入血清，因此其水平可以用于指示機體損傷；CR和BUN水平與腎功能及其受損程度密切相關，其升高可指示腎功能障礙。由圖3可以看出，與對照組相比，DSS組的ALT、AST活力和CR、BUN濃度均極顯著升高（P＜0.01），表明DSS會引起肝腎損傷并發癥；與DSS組相比，5-ASA、LPJ、HPJ組上述指標水平均得到較好的改善，LPJ、HPJ組與對照組總體無顯著差異（P＞0.05），說明飲用石榴汁對肝腎功能有一定的保護作用。

圖3 石榴汁對結腸炎小鼠肝腎功能的影響Fig.3 Effect of pomegranate juice on liver and kidney functions in mice with colitis

2.5 石榴汁對結腸炎小鼠血清炎癥因子表達的影響

促炎因子水平的升高及抗炎因子水平的降低是結腸炎的典型特征[22]，可反映結腸炎的發展進程及嚴重程度。由圖4可以看出，與對照組相比，經DSS處理后小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ質量濃度均極顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10質量濃度極顯著下降（P＜0.01）；給予陽性藥物（5-ASA組）和石榴汁（LPJ、HPJ組）干預后，炎癥因子的表達水平得到改善，LPJ和HPJ組與5-ASA組表現出相同的變化趨勢，表明石榴汁可以通過降低促炎因子的表達及提高抗炎因子的水平，緩解由DSS引起的結腸炎癥。

圖4 石榴汁對結腸炎小鼠血清炎癥因子水平的影響Fig.4 Effect of pomegranate juice on serum inflammatory factors level in mice with colitis

2.6 石榴汁對結腸炎小鼠結腸氧化應激水平的影響

炎癥因子的過度表達會加劇機體的氧化應激[23]，而抗氧化物酶類可以消除由炎癥引起的過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），減輕ROS對機體的氧化脅迫。由圖5可以看出，與對照組相比，DSS組小鼠結腸組織的GSH-Px和SOD活力極顯著降低（P＜0.01），MDA的釋放量極顯著增加（P＜0.01），表明DSS處理的小鼠結腸組織細胞出現破壞和凋亡，機體穩態失調。5-ASA組和石榴汁組小鼠機體的GSH-Px和SOD活力均極顯著升高（P＜0.01），MDA的釋放量均極顯著降低（P＜0.01），LPJ和HPJ組表現出較好的調節作用，表明飲用石榴汁能緩解由DSS引起的結腸氧化應激。

圖5 石榴汁對結腸炎小鼠氧化應激水平的影響Fig.5 Effect of pomegranate juice on oxidative stress levels in mice with colitis

2.7 石榴汁對結腸炎小鼠結腸MPO活力及NO濃度的影響

MPO主要存在于嗜中性粒細胞中，是組織中性粒細胞浸潤的生物標志物，它的異常表達會加重結腸組織黏膜的損傷[24]。NO與炎癥性腸病發病機制相關，可以作為結腸炎的重要生物標志物[25]。由圖6可以看出，與對照組相比，DSS組的結腸MPO活力和NO濃度均極顯著升高（P＜0.01），表明DSS能引起結腸組織損傷及炎癥性細胞浸潤；與DSS組相比，5-ASA組和LPJ、HPJ組結腸MPO活力和NO濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），LPJ、HPJ組與對照組無顯著差異，表明飲用石榴汁能緩解DSS引起的結腸組織損傷和炎癥性細胞浸潤。

圖6 石榴汁對結腸炎小鼠MPO活力（A）及NO濃度（B）的影響Fig.6 Effect of pomegranate juice on MPO activity (A) and NO content (B) in mice with colitis

2.8 石榴汁對結腸炎小鼠結腸HE染色及杯狀細胞數量的影響

由圖7可以看出，對照組結腸上皮細胞及黏膜隱窩結構完整、排列整齊，無炎性細胞浸潤。DSS組結腸組織出現腺體萎縮，黏膜損傷，多處表現出上皮細胞脫落及炎性細胞浸潤，且存在大量淋巴細胞聚集，腸絨毛變短。與DSS組相比，5-ASA組和LPJ、HPJ組隱窩結構趨于正常，上皮結構趨于完整，腺體數量明顯增多，絨毛變長。杯狀細胞可以分泌黏液，能夠潤滑和保護腸上皮，黏液中的黏蛋白可以被阿拉新藍染液染成藍色，用于判斷結腸黏液層的完整性[26]。由圖8可以看出，相比對照組，DSS組杯狀細胞明顯減少，且體積不一，表明DSS處理損壞了小鼠的腸黏膜層結構。經石榴汁干預后，LPJ、HPJ組杯狀細胞數量明顯增多，排列緊密有序，表明石榴汁能有效緩解結腸炎引起的杯狀細胞減少，減輕腸黏膜損傷。

圖8 石榴汁對結腸炎小鼠結腸杯狀細胞數量的影響Fig.8 Effect of pomegranate juice on the number of colonic goblet cells in mice with colitis

2.9 石榴汁對結腸炎小鼠糞便SCFAs含量的影響

SCFAs由腸道內相關有益菌屬產生，對維持腸道穩態及正常功能有積極意義。由圖9可以看出，與對照組比較，DSS組小鼠的糞便中除乙酸外的其余5 種SCFAs及總SCFAs含量均極顯著降低（P＜0.01），表明DSS成功誘導造成了小鼠腸道環境紊亂；LPJ組小鼠糞便SCFAs與DSS組相比均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），除乙酸和異丁酸外，其余4 種SCFAs含量均高于對照組，表明石榴汁干預不僅可以緩解DSS誘導結腸炎引發的SCFAs含量下降，還能使其含量高于正常對照組，通過維持腸道內穩態平衡緩解由DSS誘導的結腸炎。

圖9 石榴汁對結腸炎小鼠糞便SCFAs組成及含量的影響Fig.9 Effect of pomegranate juice on the compositions and contents of SCFAs in the feces of mice with colitis

3 討論

結腸炎的發生發展與腸道微生態激發的氧化應激及免疫應答密切相關[27]，發病期間，活化的嗜中性粒細胞產生大量ROS和活性氮，使MDA、NO濃度升高，導致脂質過氧化，同時降低抗氧化酶的活性，進一步加劇機體氧化應激反應[28]。有研究表明，空腸和結腸上皮細胞中足夠的GSH-Px、SOD能通過消除有害的過氧化物以防止組織損傷和降解[29]。本研究結果顯示，經美沙拉嗪或石榴汁干預后，小鼠結腸的GSH-Px、SOD活力均顯著提高，MDA、NO釋放量均顯著降低，這在一定程度上減輕了自由基和NO對腸黏膜的破壞作用，緩解了DSS誘導的結腸組織損傷。機體內輔助性T細胞（helper T cell，TH1）免疫反應是細胞介導的促炎反應，與炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等的分泌有關，而TH2主要與抗炎因子（如IL-10）的分泌有關，結腸炎發生時TH1/TH2紊亂的免疫應答會使結腸產生不受控制的組織損傷[30]。本研究結果顯示，經DSS誘導后小鼠的促炎因子分泌顯著增加，抗炎因子分泌顯著減少，使用美沙拉嗪或石榴汁干預的小鼠與DSS組相比促炎因子分泌顯著降低，抗炎因子分泌顯著增加，TH1/TH2免疫應答趨于平衡，石榴汁組表現出良好的治療效果，但LPJ組和HPJ組無明顯差異，同時結腸組織病理切片也觀察到相同的趨勢，這與Zhao Ruiqi等[31]的研究結果一致，即飲用石榴汁可以通過平衡機體內TH1/TH2免疫應答，緩解炎癥因子介導的結腸組織損傷，修復結腸黏膜屏障，但并不遵循劑量-效應關系。

有研究表明，結腸炎的發生發展與腸道微生物菌群密切相關，如糞桿菌的存在與結腸炎的發病率呈負相關[32]，乳酸桿菌和擬桿菌的生長有助于腸道黏膜屏障的修復[33]。SCFAs由腸道微生物菌群產生，對于腸道炎癥性疾病具有重要影響，其中丁酸由梭狀芽孢桿菌屬產生[34]，其作為腸上皮細胞能量底物的同時還能通過抑制炎癥細胞因子級聯反應發揮抗炎作用[35]。本研究結果顯示，除乙酸外，石榴汁干預組小鼠的其他SCFAs含量均顯著增加，其中低劑量的石榴汁比高劑量表現出更好的效果，Zhao Ruiqi等[31]在研究石榴皮提取物對大鼠腸道微生物菌群的作用時也發現低劑量干預效果更好的現象，這可能是小鼠在飲用過多石榴汁的同時也增加了糖的攝入，影響了代謝產物組成及含量[36]。但高劑量石榴汁干預的小鼠在日常活動及血清生化指標等方面并沒有顯示出毒性跡象，且對小鼠各項生化指標及SCFAs組成及含量顯示出有益效果。飲用石榴汁可以通過調節SCFAs的組成及含量維持腸道內穩態，緩解DSS誘導的結腸炎癥狀。

石榴富含多酚、黃酮類化合物、花青素等抗氧化活性物質，其中多酚類物質被報道具有較好的抗炎作用。尹珊珊等[37]利用從石榴皮中提取的安石榴苷干預潰瘍性結腸炎小鼠，發現其能激活SIRT1/PGC-1α/NRF1通路介導的抗炎、抗氧化和抗蛋白凋亡保護路徑，改善結腸黏膜的病理損傷。鞣花酸也被證明對結腸炎癥具有改善作用[38]，其作用機制可能與調節腸道菌群、改善腸道環境有關[39]，但研究過程并未排除石榴中其他成分如糖、纖維等物質的影響。此外，石榴多糖在結腸炎引起的慢性內臟疼痛方面也有類似石榴多酚的療效，多糖雖效力不如多酚，卻能與多酚表現出協同增強作用[15]。由此可見，石榴汁中的多酚、多糖及其他營養物質對DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎均具有一定貢獻，其作用機制與降低生物機體內氧化應激、平衡免疫應答、改善腸道環境有關。

4 結論

本研究以DSS誘導的結腸炎小鼠為模型，探究石榴汁及其飲用量對結腸炎的改善作用。造模后小鼠的DAI、炎癥因子表達量均顯著升高，表明小鼠結腸炎模型建造成功；對造模小鼠給予石榴汁干預，小鼠結腸炎癥狀減輕，炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表達量降低，氧化應激水平降低，經切片觀察，結腸組織上皮及隱窩結構完整、杯狀細胞數量增多，SCFAs含量增加。綜上，小鼠飲用石榴汁對由DSS誘導的小鼠結腸炎有顯著的緩解和改善作用。