乳酸菌與酵母菌的復配篩選及在傳統泡菜中應用

陳 偲，張 明，付竹賢，王淑敏，羅 璠1,,

（1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省教育部重點實驗室，四川成都 610041；2.西南民族大學青藏高原研究院，四川成都 610041；3.西南民族大學畜牧獸醫學院，四川成都 610041）

乳酸菌和酵母菌是發酵產品中發揮重要作用的微生物類群，它們通過相互作用，共同發酵促成發酵食品成熟，提高揮發性風味物質，改善感官評價[1]，增加發酵食物不飽和脂肪酸、促進消化、增加食欲等[2]。這種天然混合發酵體系在傳統食品發酵中廣泛存在，例如酸面團[1]、泡菜[2]、傳統發酵豆醬[3]、傳統發酵酸奶[4]、葡萄酒[5]等。在食品工業生產中也多有應用，利用乳酸菌和酵母菌發酵飼料[6]、蘋果汁[7]、雜糧面包[8]、富麩饅頭[9]等。但乳酸菌和酵母菌相互作用研究表明，在共培養體系中既存在協同（互促）作用，也存在拮抗（互抑）作用[10]。如Xu 等[11]在水開菲爾中發現霍爾迪乳酸桿菌（Lactobacillus hordei）和釀酒酵母（Sacchromyces cerevisiae）通過代謝產物的交換促進各自的生長。Branco 等[12]通過質譜分析發現釀酒酵母細胞凋亡可產生抗微生物肽（antimicrobial peptides，AMPs），并對葡萄酒中的乳酸菌等產生抑制作用[13]。Carbonetto 等[14]通過面團的共培養發酵發現乳酸菌的存在阻礙了酵母菌的生長，在碳代謝過程中表現出潛在的競爭關系。

在乳酸菌與酵母菌混合發酵體系中，當菌株間作用為相互促進時，可提高發酵效率并獲得更為豐富的代謝產物，菌株之間的良性互動也有益于提升發酵食品的品質[15]。但乳酸菌與酵母菌之間的互作關系，也可能表現為營養競爭、相互抑制的拮抗作用，影響最終發酵效果[16]。因此在乳酸菌與酵母菌混合發酵應用前，應深入分析復配菌組間的互作關系，使發酵應用效果最佳化。

泡菜口感脆爽，風味獨特，是主要的蔬菜發酵產品。泡菜發酵過程中，乳酸菌起主導作用并含有酵母菌輔助發酵，其熟制加工方式為冷加工，對營養物質有較好保留，同時富含益生菌，使其具有開胃、健脾、促消化、降低膽固醇、抗動脈硬化、抗肥胖作用等功效[17-18]，目前國內發酵泡菜中微生物研究多集中于菌群分布及自然發酵泡菜與人工接種發酵泡菜發酵效果比較[19-20]，篩選復配優勢菌株組合再進行泡菜人工接種發酵的研究鮮有報道。基于此，本研究擬分析不同組合乳酸菌和酵母菌復配的相互關系，篩選菌株組合，將其應用在泡菜發酵實驗中，為篩選發酵性能較強的菌株組合及人工接種發酵泡菜的工業化生產，提供一定的理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 信息見表1，采用傳統分離純化方法從自然發酵泡菜及酸乳樣品中，分離得到13 株乳酸菌和酵母菌，通過形態學特征、生理生化實驗、16S rDNA 和26S rDNA 序列分析，對菌株種屬進行鑒定，前期實驗表明，同類型所選菌株生長速度與產酸性能較接近[21]；新鮮大白菜（Brassica rapa pekinensis）、泡菜鹽 均為市售；MRS 培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）、改良查爾莫斯培養基（Modified Chalmers Agar，MC），孟加拉紅培養基 青島海博生物技術有限公司；水葡萄糖 分析純，天津奧普升有限公司；鹽酸 分析純，成都市科隆化學品有限公司；亞甲藍、硫酸銅、冰乙酸、氫氧化鈉、乙酸鋅、酚酞、亞鐵氰化鉀、正辛醇、硫酸鋅、氨水、活性炭、酒石酸鉀鈉均為分析純，成都金山化學試劑有限公司。

表1 實驗菌種信息Table 1 Experimental strains information

ST16R 高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司；GH6000 電熱恒溫培養箱 天津泰斯特設備有限公司；SHKE6000-8CE 恒溫振蕩搖床 美國Thermo Scientific 有限公司；紫外可見分光光度計UV1900上海佑科儀器；ELX-800 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；R40-IIB2 超凈工作臺 中國青島海爾有限公司；GI54DW 高壓蒸汽滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；雷磁pHS-25 酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司；WY-01 電熱爐 浙江偉遠工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 無菌代謝產物制備 參照劉敏敏等[22]方法并改進。將活化好的乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%的接種量接種于MRS 液體培養基中，30 ℃靜置培養24 h；將活化好的酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養基中，30 ℃靜置培養24 h。發酵液在6000 r/min 離心15 min，取上清，用1 mol/L 的NaOH 溶液調節pH 至6.0，0.22 μm 濾膜過濾除菌，得無菌代謝產物，4 ℃保存備用。

1.2.2 菌種初篩 將制備好的酵母菌代謝產物按體積分數30%加入到MRS 液體培養基中，以同樣比例在MRS 液體培養基中添加pH6.0 的YPD 液體培養基為對照組，以1%接種量接種乳酸菌（1×108CFU/mL），30 ℃靜置培養24 h，振蕩混勻在600 nm處測定吸光度。

將制備好的乳酸菌代謝產物按體積分數30%加入到YPD 液體培養基中，以同樣比例在YPD 液體培養基中添加pH6.0 的MRS 液體培養基作為對照組，以1%接種量接種酵母菌（4×106CFU/mL），30 ℃靜置培養24 h，振蕩混勻后在 600 nm 處測定吸光度。選取乳酸菌和酵母菌菌體濃度較對照差異顯著組吸光度顯著大于對照組，P＜0.05）作為復篩的出發菌組。

1.2.3 菌種復篩 以篩選出來的促進生長的菌組作為研究對象。將乳酸菌（1×108CFU/mL）和酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種在MRS 液體培養基中30 ℃靜置共培養12 h 后，將共培養菌液用無菌生理鹽水按10 倍進行梯度稀釋，取適當稀釋度的發酵液進行平板涂布法計數，使用改良MC 培養基平板測定乳酸菌活菌數，使用孟加拉紅培養基平板測定酵母活菌數，于30 ℃靜置培養48 h，每個稀釋度做3 個重復，取菌落數在30～300 的平板計數，取平均值。

1.2.4 培養方式的確定 將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%的接種量接種于YPD 液體培養基中，于30 ℃下分別進行靜置與振蕩兩種培養方式培養24 h，發酵液以6000 r/min 離心15 min，取上清，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用。MRS 液體培養基中添加體積分數為30%的兩種不同培養方式的酵母菌無菌代謝產物為實驗組；添加等量的YPD 液體培養基作為對照組。將植物乳桿菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種在上述液體培養基，4、8、12、16、20、24 h 測定菌液在600 nm 處的吸光度。

1.2.5 接種順序的確定 將乳酸菌（1×108CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養基中，30 ℃靜置培養12 h，然后接種1%的酵母菌（4×106CFU/mL），共培養至24 h；以乳酸菌單菌于第0 h 和酵母菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養基為對照。每隔4 h 使用pH 計測定pH，使用改良MC 培養基平板測定乳酸菌活菌數，使用孟加拉紅培養基平板測定酵母活菌數。

將酵母菌（4×106CFU/mL）以1%接種量接種于MRS 液體培養基中，30 ℃靜置培養12 h，然后接種1%的乳酸菌（1×108CFU/mL），共培養至24 h，以酵母菌單菌于第0 h 和乳酸菌單菌于第12 h 以同接種量接種至MRS 液體培養基為對照。每隔4 h 測定活菌數和pH。

1.2.6 接種比例的確定 乳酸菌與酵母菌活菌數以10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、100:1 的比例接種于MRS 液體培養基中，其中酵母菌菌體濃度固定為（4×106CFU/mL），乳酸菌菌體濃度隨比例調節，先接種酵母菌后接種乳酸菌；以相同菌體濃度的乳酸菌和酵母菌單菌接種于MRS 培養基為對照組，30 ℃靜置培養，在12、18、24 h 測定活菌數。

1.2.7 發酵效果比對實驗

1.2.7.1 菌懸液制備 將互促菌組植物乳桿菌J05和釀酒酵母Y21 以及互抑組合乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1，分別接入MRS 與YPD 培養基進行活化，活化兩代之后，4500 r/min 離心15 min，棄去上清，無菌生理鹽水重懸沉淀，調節菌體濃度為前期篩選出的最佳比例乳酸菌:酵母菌=30:1（此時乳酸菌菌體濃度為1.2×108CFU/ml；酵母菌菌體濃度為4×106CFU/mL）。

1.2.7.2 泡菜制作工藝與實驗處理 泡菜工藝流程參考熊濤等[23]的方法并加以改進，制作流程如下：

泡菜原料挑選→整理篩選→泡菜壇預處理→沖洗控水→切塊裝壇→接種發酵劑→鹽水封口→發酵→成品。

取45 個320 mL 的玻璃密封罐，洗凈，烘箱烘干。分別稱取50 g 白菜樣品放入玻璃密封罐中。用冷沸水配制質量分數為 4%的泡菜鹽水，以2%的接種量（以白菜質量計）添加菌液發酵。按照1:2 的料液比，分別量取100 mL 泡菜鹽水完全淹沒樣品，保鮮膜加蓋密封，室溫條件下自然發酵。從腌制之日起，每隔 2 d 取樣測定相關指標。

本實驗設5 個處理：單菌植物乳桿菌J05 組，單菌釀酒酵母Y21 組，互促組植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，互抑組乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 以及空白對照組（自然發酵）。

1.2.7.3 泡菜理化指標測定 泡菜發酵液pH 采用pH 計直接測定。總酸測定參照GB/T 12456-2021《食品中總酸的測定》直接滴定法；還原糖含量測定參照GB 5009.7-2016《食品國家安全標準食品中還原糖的測定》直接滴定法；亞硝酸鹽含量測定參照GB 5009.33-2016《食品國家安全標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》紫外分光光度法。

1.3 數據處理

所有實驗均設置3 個重復，實驗數據使用SPSS.20 軟件進行統計學分析，采用ANOVA 對各組間差異進行單因素方差分析，采用t檢驗對兩組之間的差異進行分析，P＜0.05 表示有顯著性差異，平均值±標準差表示結果，使用Origin 2021 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 互促乳酸菌和酵母菌的初篩

由表2、表3 可得，通過比較乳酸菌、酵母菌在添加代謝產物培養基和單一培養基的生長情況，從所有菌株組合中篩選出具有偏利關系的組合23 對，占比28.75%；相互促進的組合4 對（P＜0.05），即植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21，植物乳桿菌J05 和畢赤酵母Y163，屎腸球菌HR 和畢赤酵母Y163 以及屎腸球菌B2 和畢赤酵母Y163，占比5.00%；僅對一方有抑制作用的組合24 對，占比30.00%；相互抑制的組合8 對（P＜0.05），包括乳酸乳球菌RQ 和畢赤酵母Y1 等，占比10.00%。由此可見，乳酸菌和酵母菌復配，菌株間會表現出不同的菌間關系，而能夠互相促進的組合占比較低。在劉敏敏等[22]的實驗中有相似結果，其從分離自酸馬奶的8 株乳酸菌和7 株酵母菌中僅篩選出3 對具有相互促進作用的乳酸菌和酵母菌組合。許多研究表明乳酸菌能產生多種代謝產物如有機酸、抗真菌肽等對酵母菌的生長產生不同影響[24-25]。酵母菌的代謝產物（游離氨基酸和維生素）大多對乳酸菌產生促進作用，部分酵母菌的代謝產物甚至會激活乳酸菌的LuxS/AI-2 QS 系統[26]，從而調節群體密度，影響菌群生長。但也有報道證明一些酵母菌會分泌抑菌物質抑制乳酸菌的生長[27]。

表2 乳酸菌代謝產物對酵母菌生長影響Table 2 Effects of lactic acid bacteria metabolites on yeast growth

表3 酵母菌代謝產物對乳酸菌生長影響Table 3 Effects of yeast metabolites on the growth of lactic acid bacteria

2.2 互促乳酸菌和酵母菌的復篩

表4 結果表明，對初篩中選出的4 對乳酸菌和酵母菌組合進行菌組共培養復篩，只有植物乳桿菌J05 和釀酒酵母Y21 顯示出明顯穩定的相互促進關系（P＜0.05），因此選該菌株組合作為后續篩選實驗的研究對象。

表4 乳酸菌和酵母菌復篩活菌數Table 4 The viable number of lactic acid bacteria and yeast

2.3 培養方式的確定

結果如圖1 所示，釀酒酵母Y21 靜置培養和振蕩培養的無菌代謝產物都可以促進植物乳桿菌J05 的生長，且對該菌的促進作用表現在4～16 h 之間，而靜置培養的無菌代謝產物對植物乳桿菌J05 的促進作用更加明顯。酵母菌屬于兼性厭氧菌，靜置培養過程中酵母菌與空氣接觸較少，可將糖分分解成乙醇和CO2等代謝產物，振蕩培養過程中酵母菌主要進行耗氧代謝，此時糖分降解較徹底，酵母菌在不同氧含量情況下代謝產物不同，對乳酸菌的影響也可能不同。郭倩茹[28]使用振蕩培養酵母無細胞上清液與乳酸菌共培養，篩選出了互利的乳酸菌和酵母菌；趙小麗[29]使用厭氧發酵的酵母培養物來測定對植物乳桿菌的促進效果，并建立了酵母菌厭氧發酵體系。

圖1 釀酒酵母不同代謝產物對植物乳桿菌的生長的影響Fig.1 Effects of different metabolites of S. cerevisiae on the growth of L. plantarum

2.4 接種順序對菌株生長情況的影響

從圖2A 的結果分析，先接種植物乳桿菌J05 培養12 h，后接種釀酒酵母Y21，結果顯示與單菌J05 組相比，共培養J05 的生長無明顯差異，與單菌Y21 組相比，共培養Y21 在16 h 時生長受到抑制，20 h 后恢復正常。結合圖2C 中pH 結果，釀酒酵母Y21 在接種前期可能受到酸抑制，適應環境后，利用植物乳桿菌J05 的部分代謝產物加速生長。從圖2B與圖2D 的結果分析，先接種釀酒酵母Y21 培養12 h，后接種植物乳桿菌J05，結果顯示與單菌Y21組相比，共培養Y21 的生長狀態改善，且在16 和20 h時活菌數顯著高于對照組（P＜0.05），表明加入植物乳桿菌J05 后促進了釀酒酵母Y21 的生長；接入植物乳桿菌J05 后，共培養J05 活菌數較單菌對照組提高，在20 h 時差異顯著（P＜0.05），表明此時釀酒酵母Y21 的代謝產物可以促進植物乳桿菌J05 的生長。在共培養菌株的接種順序研究中，周鈺涵等[30]研究發現，釀酒酵母與球擬酵母接種順序不同，對發酵體系中還原糖含量及CO2總失重有不同程度影響；吳軒德[31]在對釀酒酵母與巴氏醋桿菌相互作用的研究中表明，在酵母菌發酵24 h 后接種醋酸菌對酵母酒精發酵影響最大。因此本實驗中不同接種順序下菌株表現出不同的生長情況，推測與共培養體系中不同時段的代謝產物的差異相關。

圖2 不同接種順序下植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數及pHFig.2 Number of viable strains and pH of L. plantarum and S.cerevisiae in different inoculation sequences

2.5 接種比例對菌株生長情況的影響

結果如圖3 所示，菌株復配比例對菌株生長有一定影響，在12 h 時，與單菌對照組相比，各復配組的活菌數出現明顯差異（P＜0.05），而在18 h 和24 h時沒有明顯差別，該結果與閆彬等[32]的研究結果較為接近，而與Xu 等[11]的結果有一定差異，可能是各菌株分泌有利代謝物質的時間有差異所致[33]。在12 h 時，不同菌株比例對復配組中植物乳桿菌J05 的生長均有促進作用，對釀酒酵母Y21 的生長影響有差異，說明復配對植物乳桿菌J05 生長促進效果明顯，而對釀酒酵母Y21 的影響有限。其中30:1和40:1 的比例是菌株復配的較佳比例，在這兩個比例下，復配組的活菌數均顯著高于單菌組。

圖3 不同接種比例植物乳桿菌和釀酒酵母的活菌數Fig.3 Number of viable strains of L.plantarum and S.cerevisiae under different inoculation ratios

2.6 泡菜發酵過程中pH 和總酸的變化

pH 作為泡菜發酵過程中一項重要指標，對微生物生長和代謝產物形成具有重要影響[34]。由表5 可知，除酵母組外，所有組在0～2 d 之間pH 均急速下降，第10 d 至發酵過程完結，各組pH 趨于穩定，互促組pH 最低（P＜0.05），而互抑組和對照組的pH 最高。由圖4 可知，在發酵過程中，各組總酸含量均逐漸增加到10 d 后趨于穩定，其中互促組總酸含量維持在較高水平，穩定期與其他組相比總酸含量最高（P＜0.05）。所有組別在發酵過程中總酸含量均低于國內貿易行業標準SB/T 10439-2007（≤2 g/100 g），結果與pH 變化情況基本一致。對照組與互抑組總酸增加緩慢，在2～10 d 內，總酸含量均低于互促組和單菌組。各實驗組接種菌量相同的情況下，互促組產酸量大，說明發酵能力最強，互抑組從第8 d 開始，酸產量不再增加，總酸產量比空白對照組低，說明發酵能力最差。

表5 泡菜發酵過程中pH 變化Table 5 Change of pH during pickle fermentation

研究表明，在泡菜發酵過程中，其pH 達到3.5～3.8 可認為發酵結束，泡菜此時為成熟狀態，理論上風味最佳，可進行食用[35]。本實驗中，互促組pH 在第6 d 下降到3.66，且一直維持在最低水平，結合總酸含量變化情況分析，隨著發酵過程的進行，各組發酵泡菜中總酸含量不斷增加，在總酸的積累量上，互促組都要高于其他組別，這是因為互促組乳酸菌與酵母菌為互利共生菌組，生長繁殖速度更快，產酸更多。而其他組別中的乳酸菌與酵母菌未能形成互促關系，相比于互促組，發酵繁殖周期較長，成為優勢菌種所需時間更久，產酸量和產酸速率都要低于互促組，所以到達發酵結束時間也就越久。凌榮秀等[36]研究表明泡菜酸性環境可抑制有害菌的生長和代謝，有利于乳酸菌的發酵，陳影等[37]研究表明，泡菜發酵體系中乳酸菌量增加有助于降低pH 與提升總酸含量，縮短泡菜發酵時間。

2.7 泡菜發酵過程中還原糖含量變化

由圖5 所示，發酵泡菜的還原糖含量均呈現先增加后降低的變化趨勢，除對照組外，添加菌組都在第2 d 到達峰值。泡菜發酵初期，微生物活動較弱，泡菜葉中淀粉、多糖類物質被降解成還原糖，當還原糖溶解速度大于微生物利用的速度，導致泡菜液中的還原糖含量上升，隨著發酵過程的進行，大量的微生物生長繁殖消耗碳源，導致還原糖含量逐漸降低[38]，符合微生物對碳源分解利用的規律[39]。其中釀酒酵母單菌Y21 組的還原糖含量最高，有利于其后期的發酵利用。而互促組的還原糖含量在整個發酵過程中均維持在較低水平，表明該組別中微生物對還原糖利用率較高，因此發酵充分，該結果與產酸結果相一致。互促組的還原糖含量在第2 d 時處于各組別中最低值，可能由于酵母產的還原糖被乳酸菌快速利用，兩菌在代謝上存在相互作用，有利于發酵的進行。而互抑組在整個發酵過程中還原糖含量較高，而產酸量較低，說明發酵能力較差。

圖5 泡菜發酵過程中還原糖含量的變化Fig.5 Changes of reducing sugar content in the fermentation of pickle

2.8 泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化

亞硝酸鹽含量作為判斷泡菜產品是否可以安全食用的一項重要指標，得到消費者關注[40]，在《食品中污染物限量國家標準》中有明確規定，其殘留量在醬菜中不得超過20 mg/kg[41]。由圖6 可知，各組中“亞硝峰”都出現在第2 d，其中對照組峰值最高為8.03 mg/kg，互促組峰值含量為5.38 mg/kg，均未超過20 mg/kg；發酵第10 d，所有組別中亞硝酸鹽含量都下降到3 mg/kg 以下，遠低于標準限量值。

圖6 泡菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig.6 Changes of nitrite content in the fermentation of pickle

本實驗各處理組亞硝酸鹽含量均在發酵第2 d達到高峰，隨后逐漸下降。泡菜發發酵過程中產酸可抑制硝酸鹽還原菌的生長，逐漸降低亞硝酸鹽含量；且在酸性條件下，亞硝酸根離子可與氫離子結合形成亞硝酸，發生自身歧化反應生成二氧化氮和一氧化氮，從而降低亞硝酸鹽含量[42]。在所有實驗組中，自然發酵的對照組亞硝酸鹽含量最高，說明添加發酵微生物有利于抑制泡菜亞硝酸鹽的生成，互促組與釀酒酵母Y21 組中亞硝酸鹽含量較低，結合pH 和總酸發酵結果分析，說明發酵充分，能有效抑制硝酸鹽還原菌生長，有利于降低亞硝酸鹽含量。較多研究表明，人工接種復合乳酸菌進行泡菜發酵，可起到抑制亞硝酸鹽含量的作用。任亭等[34]研究復合菌種對青菜頭泡菜品質的影響，結果顯示，接種組亞硝酸鹽峰值為2.61 mg/kg，對照組為6.12 mg/kg，接種組較對照組低。陳大鵬等[38]以娃娃菜的尾菜為原料，接種混合菌種發酵泡菜，自然發酵泡菜的“亞硝峰”出現在發酵的第3 d，為32.1 mg /kg，而人工接種發酵泡菜的“亞硝峰”出現在發酵第2 d，峰值較低，為9.03 mg /kg。本實驗得到結果與上述相似。

3 結論

本研究通過代謝產物與菌株共培養初篩，乳酸菌與酵母菌共培養復篩，篩選出一對具有相互促進作用的植物乳桿菌J05 與釀酒酵母Y21，對該菌組間培養方式、接種順序、接種比例等進行探究，再將篩選得到的菌組應用到人工接種發酵泡菜中，研究各菌組的發酵性能。發現互促組可較快進入發酵成熟期，縮短泡菜發酵周期，其還原糖含量在整個發酵過程中均維持在較低水平，各添加菌組亞硝酸鹽含量均要低于自然發酵組，其中互促組在整個發酵過程亞硝酸鹽含量較低，提高了泡菜食用的安全性。上述結果為乳酸菌與酵母菌互作關系研究及人工接種發酵泡菜的工業化生產，提供了一定的科學理論依據。