海南不同成熟期諾麗果的蛋白鑒定及功能分析

邱靜 宋媛 王妮 王佳人 陳靜 陳光英 趙振東 何文英

摘 要：諾麗果（noni）是海南的一種特色水果，具有多種藥效價值，但關于其植物蛋白的研究卻很少。本研究采用基于BPP+酚提取法的雙向電泳技術，通過優化實驗條件，對花蕾期、半成熟及成熟期等3 個時期產自海南的諾麗果實進行蛋白質的提取分離，獲得其植物蛋白指紋圖譜；利用Image Master 5.0 軟件分析凝膠圖像篩選出高表達蛋白；再利用MALDI-TOF-MS 技術對這些蛋白酶解產物進行質譜鑒定；通過生物信息學手段對3 種諾麗果實的高表達蛋白初步進行蛋白功能分析。結果表明：花蕾期、半成熟及成熟諾麗果實分別有44、49 和40 個高表達蛋白，通過質譜鑒定，確定了其中分別有33、22 和39 個蛋白，從屬不同植物功能的蛋白種類；不同成熟期的高表達蛋白差異較大，涉及葉綠體連接酶、半胱氨酸蛋白酶、蛋白激酶、泛素連接酶、生長素反應因子等多種蛋白質。該研究為進一步開發利用諾麗果的植物蛋白提供科學合理的理論指導。

關鍵詞：諾麗果；不同成熟期；蛋白；功能分析

中圖分類號：S759.83 文獻標識碼：A

諾麗（Noni）即海巴戟（Morinda citrifolia L.），又名熱帶海巴戟、海巴戟天、四季果等，屬茜草科巴戟天屬植物，是一種生長于熱帶及亞熱帶的多年生常綠闊葉灌木或小喬木，波利尼西亞土著將諾麗作為民間藥物使用已有2000 多年歷史，民間多用于治療發燒、腹瀉、便秘、哮喘、惡心嘔吐、蚊蟲叮咬及動物咬傷引起的感染等疾病[1-2]。

諾麗植株的多部位含有多種活性成分，近年來已從諾麗的根、莖、葉、花、果實、樹皮、芯材等部位分離鑒定了300 余種化合物，主要包括黃酮、多糖、香豆素、蒽醌、環烯醚萜、生物堿、木脂素、香豆素、三萜、甾醇等化學成分[3]。現代藥理學研究表明，諾麗具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗焦慮、抗抑郁、降血脂、降血糖、肝保護、改善記憶、提高耐力、提高免疫力、減輕骨質疏松癥、改善關節疼痛及活動度、對缺血性神經元損傷的保護作用、多巴胺雙向調節等作用[4]。作為一種傳統藥食同源的植物，諾麗果實也是一種特色的熱帶水果，據報道，其中含有275 種以上的營養成分，除含抗氧化物、東莨菪堿、多醣體、及罕見的對人體健康非常重要的17 種虹甙類（環烯醚萜類）等化學成分以外，還包括人體所需的20 種必需氨基酸、9 種人體內無法自行生成的必需氨基酸；另含有豐富維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B3、葉酸等14 種維生素，含有鉀、鈉、鋅、鈣、鐵、鎂、磷、銅和硒等16 種礦物質，硒含量為其他水果的10 倍以上[5-7]。

由于諾麗的高營養價值，早在2010 年諾麗果漿被中華人民共和國衛生部列入了新資源食品名單，諾麗種植在我國海南省和云南省已具備一定規模[3]。通過追蹤不同產地諾麗果關鍵發育期主要活性物質的動態變化，不僅為諾麗果原材料的實時采收、質量控制以及縮短諾麗產品生產成本與周期提供科學依據[8]，也可對不同成熟度諾麗果進行主要活性成分分析。國內最新報道了云南產諾麗果不同成熟度諾麗果中多糖、總黃酮、總酚、總蒽醌、莨菪亭、總皂苷、桃葉珊瑚苷、蛋白質含量測定的研究，結果表明成熟度與活性成分間具有一定的相關性[8]。

國外也有較多關于諾麗果實及種子的種植、營養價值、藥理活性及機制的研究[9-11]。通過查閱國內外文獻，發現雖然有較多關于諾麗化學成分提取及其生物或藥理活性的研究，但還未見有諾麗不同成熟度的蛋白提取及其指紋圖譜的建立或其中功能蛋白發現分析的報道。作為一種有較高營養價值及藥理活性的藥食同源植物，研究其所含植物蛋白名稱、發現與其藥物活性相關的關鍵蛋白，對深度了解諾麗果實、指導育種、進一步開發諾麗果實均具有非常重要的理論和實際意義。本研究利用蛋白質組學的雙向電泳技術[12]，獲得海南不同成熟期的諾麗果蛋白圖譜，并利用生物質譜及生物信息學技術，鑒定分析諾麗果關鍵發育期主要蛋白質的動態變化，為進一步深入研究和開發諾麗果提供科學合理的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

花蕾期、半成熟及成熟諾麗果果實樣品，均采集于海南海口東山鎮諾麗果種植園（20°02′45.97″N，110°11′38.39″E），經海南師范大學生命科學院的陳玉凱副教授鑒定確為花蕾期、半成熟及成熟諾麗果果實（圖1）。將采集回來的花蕾期、半成熟及成熟諾麗果樣品用超純水清洗干凈，用錫箔紙包裹住放入保鮮袋中，于–80 ℃的冰箱中保存備用。

蛋白提取儀器及試劑：臺式恒溫振蕩器（精宏）；QL-866 渦旋混合器；SIGMA3-18K 低溫超速離心機（德國SIGMA）；超純水系統（上海和泰）；EYELA 搖床（東京理化）；蛋白質等電聚焦儀（Ettan IPGphor3）， 固相pH 梯膠條（pH3～10）；Image scanner III 掃描儀（美國通用公司GE Healthcare）；Image Master 5.0 凝膠圖像分析軟件；MultiTemp IV 恒溫循環器；UV-2700 紫外分光光度計（日本島津）；KQ2200E 型超聲波清洗儀（曙峰企業）；GM-0.33A 型隔膜真空泵（津騰）；Voyager-DE PRO ABI4700 時間飛行質譜儀（美國ABI 公司）。所有試劑均為國產分析純試劑，所有實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 BPP+酚抽提法提取蛋白 （1）取出樣品，切成小塊， 置于預冷的干凈研缽中， 加入少許 PVPP 粉末和少許二氧化硅粉末，在液氮環境中研磨到粉末狀；稱取3 g 研磨好的樣品粉末，加入至10 mL 離心管中，再加入10 mL BPP 提取緩沖液，充分渦旋震蕩10 min；再加入10 mLTris飽和酚，渦旋10 min；在SIGMA3-18K 低溫超速離心機中離心15 min（4 ℃，轉速：16000×g）；移取上層清液轉移至干凈離心管中，加入5 mLBPP 提取緩沖液，渦旋震蕩10 min 后離心15 min；再移取3 mL 上層清液轉移至干凈離心管中，加入15 mL 預冷過飽和硫酸銨甲醇溶液（AM 沉淀劑），置于–20 ℃冰箱中沉淀12 h 以上；從冰箱中取出離心管，用 AM 沉淀劑配平后離心15 min棄上清液；每管再加入2 mL 預冷甲醇，去上清液，渦旋均勻，重復2 次；再分別加入 2 mL 預冷丙酮，重復2 次轉移及離心步驟；去除上清液，分別加入適量DTT，混合均勻，按10 mg/mL 加入適量裂解液，于20 ℃恒溫溶解2 h 以上；待蛋白完全溶解到裂解液后，離心，取上清液，測定蛋白濃度。

（2）標準曲線法測定蛋白質含量。稱取1 mg牛血清蛋白充分溶解于1 mL 超純水中，配制成1 mg/mL 的標準牛血清蛋白儲備液。分別準確量取1 mg/mL 的標準牛血清蛋白儲備液若干體積，用超純水配制成0、2、4、6、8、10 μg/mL 的牛血清蛋白標準溶液。利用紫外分光光度計，測定在595 nm 處的吸光度值，根據朗伯-比爾定律，以牛血清蛋白標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作標準曲線。

1.2.2 蛋白質含量測定 采用Bradford 法測定樣品的蛋白濃度[13]， 使用紫外分光光度計， 在595 nm 的波長下測定花蕾期、半成熟及成熟諾麗果蛋白提取液的紫外吸光度值，根據標準曲線方程，計算樣品中蛋白質的含量。

1.2.3 單向電泳實驗 根據吳秀麗等[14]的方法進行單向電泳實驗，確定雙向電泳的最佳上樣濃度。

1.2.4 雙向電泳實驗 移取含有1.3 mg 蛋白質的提取液，用蛋白裂解液稀釋至樣品體積為455 μL，加5 μL IPG Buffer 于離心管中，輕輕震蕩使其混合均勻，轉移至IPG 膠條（pH 3～10）上，20 ℃恒溫水化18 h 以上；保持室溫20 ℃左右，設置聚焦極限電流為每根膠條50 μA，電壓參數如表1所示，進行一向等電聚焦；再將膠條放置在搖床上平衡15 min；在制備好的聚丙烯酰胺凝膠上進行二向垂直電泳操作，設置參數為：每張膠片5 W進行預電泳1 h，每張膠片7 W 至電泳結束；再進行凝膠染色和脫色、凝膠掃描和用ImageMaster 軟件分析凝膠圖譜[14]，篩選出高表達的蛋白并進行編號。

1.2.5 生物質譜鑒定及分析 挖取高表達蛋白質，分別用150 μL 超純水、150 μL 脫色液和100μL 乙腈處理，放置在搖床上搖蕩30 min，轉速設置為150 r/min，搖蕩后吸出離心管中的水，以上步驟重復3 次，直至蛋白粒變為無色，置于室溫下風干；將蛋白樣品離心后加入適量胰蛋白酶，放置在4 ℃冰箱中1 h 左右；再將其放置在PCR 儀上酶解蛋白（37 ℃，13 h）；設置轉速7000×g，離心5 min（20 ℃），備用；利用MALDI-TOF-MS進行蛋白鑒定；將所得的質譜數據通過MascotDistiller 軟件進行分析，再利用Matrix Science（http：//www.matrixscience.com）網站進行搜庫比對，確定蛋白的名稱、種類及其他信息。

2 結果與分析

2.1 不同成熟期諾麗果蛋白提取

通過Bradford 法測定3 種諾麗果的蛋白濃度，在波長為595 nm 處通過測定系列梯度濃度的標準牛血清蛋白溶液的吸光度值，建立標準曲線方程（未顯示），計算得出花蕾期、半成熟及成熟諾麗果蛋白溶液的濃度分別為6.808、11.30、5.89 mg/mL。

為獲得雙向電泳合適的上樣濃度，進行單向電泳實驗，結果如圖2 所示。不同成熟期諾麗果的蛋白分子量介于15～130 kDa 之間，花蕾期的蛋白主要在17、20、25 kDa 左右，半成熟期的蛋白主要在17、20、33 kDa 左右，而成熟期的蛋白則主要集中在15、20、25、33 kDa 左右。另外，從圖2 可以清晰看出樣品的蛋白條帶，說明不同成熟期諾麗果實蛋白質未降解，可以進行后續雙向電泳實驗操作。

在優化實驗條件下，通過雙向電泳實驗可以得到清晰明顯、分離效果很好的蛋白凝膠圖譜，再經ImageMaster 軟件分析在蛋白凝膠圖譜上標記高表達的蛋白點。花蕾期、半成熟及成熟諾麗果實分別有44、49 和40 個高表達蛋白（圖3）。

2.2 不同成熟期諾麗果蛋白質譜鑒定

將不同成熟期諾麗果中的若干高豐度蛋白質點，經過挖點、酶解和提取處理后，利用基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜儀（MALDITOF-MS）對其進行分析和鑒定，并設置參數以基質峰、酶自切峰進行校正，測定各蛋白肽段的質譜數據，再通過植物蛋白質數據庫進行對比來確定這些蛋白的名稱、種類等信息，最終成功鑒定出花蕾期有33 個蛋白點、半成熟期有23 個蛋白點、成熟期有39 個蛋白點，結果分別如表2、表3 及表4 所示。

2.3 不同成熟期諾麗果蛋白功能分析

以上通過利用雙向電泳實驗和MALDI-TOFMS生物質譜技術，對海南不同成熟期的諾麗果實中植物蛋白的提取和鑒定實驗，成功匹配了花蕾期、半成熟及成熟諾麗果實分別有44、49 和40 個高表達蛋白，通過質譜鑒定，相應確定了分別有33、49 及39 個蛋白，從屬不同植物功能的蛋白種類，對這些差異表達的蛋白進行了簡單的生物學功能分析，詳見表5～表7。花蕾期和半成熟期相同的蛋白有：硫氧還蛋白、驅動蛋白、葉綠體、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、蛋白連接酶、Squamosa 啟動子結合樣蛋白、轉錄因子；花蕾期和成熟期相同的蛋白有：轉移酶、可能的抗病蛋白、F-box 蛋白；半成熟期和成熟期相同的蛋白有：蛋白短梗、半胱氨酸蛋白酶、轉移酶、葉綠體、蛋白質Ycf2。

3 討論

諾麗果不同成熟期的蛋白相差較大，表現在眾多的生長、發育及遺傳功能方面。花蕾期的23號根向光蛋白與半成熟期的31 號光敏色素均與植物的光感應相關，由于開花是植物從營養生長到生殖生長的一個重要轉折點，直接影響著種子植物生育期的早晚、授粉及種子發育的最佳時期，這暗示不僅可通過人為調節光的某些特性來調控花蕾期諾麗果的根向光蛋白，從而促使花蕾期諾麗果盡快開花，也可從不同成熟的諾麗果提取根向光蛋白并用于科學培植諾麗果[91]。此外，發現花蕾期的8 號蛋白枯草桿菌蛋白酶[92]、18 號蛋白可能的抗病蛋白RPP1[93]與成熟期的19 號抗病蛋白Pik-1[94]，均與植物抵抗病菌相關，也表明這3種抗病蛋白可有望開發為高效、低毒的生物農藥。

本研究發現部分蛋白與動物體內的蛋白相同，具有不同的生物學或藥學功能，如花蕾期的1、28 號蛋白和半成熟期的34 為硫氧還原蛋白，作為一種小的熱穩定酸性蛋白，是細胞中重要的氧化還原蛋白，具有調節細胞抗氧化、抗脅迫、細胞凋亡、DNA 結合轉錄因子活性等功能，說明在諾麗果花蕾期到半成熟期的發育過程中，可能在抗氧化應激、阻止線粒體介導的細胞死亡、調節某些基因的表達等方面起關鍵作用[15]；作為人體重要的內源性抗氧化系統之一，硫氧還原蛋白被研究證明具有出色的抗氧化活性或調節眾多細胞生存相關信號通路，從而抵抗活性氧損傷[95]。

花蕾期的2 號、成熟期的24 號蛋白為驅動蛋白，作為一類重要的微管調節蛋白，可能在諾麗果的神經元的發育、紡錘體的組裝和染色體的分離過程中起著重要的作用[16]，人體驅動蛋白是分子馬達的一種，其通過結合和水解ATP，導致頸部發生構象變化，促使驅動蛋白沿著微管“行走”，完成細胞中貨物運輸的工作，能為細胞生命活動提供動力[96]。花蕾期中編號6、20、24 和29 均為蛋白連接酶，其中編號6 和20 為E3 泛素蛋白連接酶，其廣泛參與細胞內的代謝過程，比如細胞增殖、細胞周期調控、細胞的凋亡，人體這些酶的調節異常與多種疾病有關，如神經系統疾病與惡性腫瘤等[23]。編號24 和29 為生物素蛋白連接酶，通過調節微生物的乙酰輔酶A 羧化酶和丙酮酸羧化酶，控制重要代謝途徑的關鍵反應，從而有效控制微生物生長，也是極具開發前景的抗菌新靶點[24]；花蕾期的18、成熟期的19 抗病蛋白能識別病原體及微生物，并觸發免疫，對抗病原體以及微生物的侵擾[35]。花蕾期17、成熟期的34 號為F-box 蛋白，作為泛素連接酶復合物SCF的重要組成物，可能參與調控諾麗果的整個細胞周期，對人體診治腫瘤以及生殖方面的疾病也有重要的作用[34]。成熟期的8 號天冬酰胺酰β-羥化酶是一種能催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨的酰胺基水解酶，廣泛存在于植物、動物和微生物中；人類天冬氨酰參與并調節惡性腫瘤細胞的侵襲及轉移，在多種惡性腫瘤中過表達，參與并調節惡性腫瘤細胞的侵襲及轉移，并可介導抗腫瘤免疫反應，在腫瘤靶向治療、免疫治療中的作用逐漸受到重視[67]。成熟期的10 級12 號蛋白為鈣依賴性蛋白激酶，在Ca2+介導的信號轉導中起重要作用，可能參與調控成熟期諾麗果的植物激素信號通路、生物脅迫反應及其根、莖、葉或種子發育等過程[69]；人體鈣依賴性蛋白激酶對膽管癌細胞HuCCT1 血管的生成有一定的影響和調控[97]。半成熟期的10、13、14、16、18、19、20、21、22 和成熟期的29 號為半胱氨酸蛋白酶，是植物中重要的蛋白酶家族之一，可能參與半成熟期和成熟期諾麗果種子萌發、幼苗發育、脅迫響應和組織分化衰老等過程[46]；人體半胱氨酸蛋白酶抑制劑S 對于胃癌的鑒別具有重要作用，對極有可能作為新的腫瘤標志物以及它對于胃腸癌診斷具有極其重要的參考價值[98]。

諾麗果是一種藥食同源的植物，雖然大部分現有的研究是關于諾麗果不同部位化學成分的提取及在營養食品等方面的應用，但從蛋白質組學的方法挖掘諾麗果的科學及實用價值的國內外研究卻很少有。本研究用蛋白質組學揭示了不同成熟期果實的蛋白種類及功能，以上結果表明在不同成熟期的諾麗果中大多數蛋白、激素以及酶均存在著藥學作用，在一定程度上可補充說明諾麗果的藥理活性，對后續深入了解諾麗果實、指導育種以及進一步開發諾麗果實提供理論依據。

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