乳腺癌組織lncRNA LINC00467和miR-4735-3p表達水平與術后復發轉移的相關性

張碩穩 李 丹 賀 靜 杜志興 鄭麗華 劉永建

乳腺癌是繼肺癌之后女性癌癥相關死亡的第二大原因,全球發生率超過200萬例,并且每年以0.3%的速度增長[1]。因此,尋找能夠有效預測乳腺癌預后的新的生物學標志物有利于更精確地診斷和開發更好的臨床治療靶點。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可以參與調節各種生理和病理過程,如細胞增殖、凋亡、侵襲等[2]。近年來研究顯示,lncRNA在癌癥中異常表達,可作為早期篩查、治療及預后的生物學標志物,其中lncRNA LINC00467作為腫瘤促進基因參與各種類型的癌癥。例如,lncRNA LINC00467在結直腸癌組織和細胞中高表達,敲除后可在體外抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移,可作為潛在的預后生物學標志物,在結直腸癌的進展中至關重要[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)在基因表達的轉錄后調控中發揮重要作用,其表達異常影響腫瘤細胞的生長和轉移,miR-4735-3p是研究較少的家族成員之一,之前在膀胱癌細胞中的研究發現其具有抗腫瘤作用[4～6]。lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在癌癥中具有重要作用,但在乳腺癌中的研究尚未見報道,本研究檢測了lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌組織中的表達情況,旨在分析其表達水平與乳腺癌患者臨床預后復發轉移的關系,為尋找乳腺癌臨床治療靶點和預后指標提供新的見解。

對象與方法

1.一般資料:回顧性選取2017年4月～2019年4月于河北醫科大學第一醫院接受乳腺癌改良根治術治療的109例乳腺癌患者,均為女性,患者年齡31～68歲,平均年齡為50.07±9.65歲;腫瘤最大徑0.53～5.23cm,平均最大徑為3.14±0.96cm;腫瘤分化程度:低分化31例,中分化48例,高分化30例;TNM分期[7]:Ⅰ期38例,Ⅱ期42例,Ⅲ期29例。在手術過程中收集乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織(經病理診斷),立即置于液氮中短暫保存,術后保存至-80℃超低溫冰箱直至使用。本研究經河北醫科大學第一醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:LS-2017第63號),患者均簽署知情同意書。

2.納入與排除標準:納入標準:①患者均參照《乳腺癌診療規范(2018年版)》中的乳腺癌診斷標準確診[7];②均為初診病例,術前未進行過乳腺癌的相關治療;③術前檢查證實均不存在遠處轉移。排除標準:①術前接受過其他治療的患者;②全身性感染或合并其他惡性疾病的患者;③不配合治療的患者。

3.總RNA提取和反轉錄:取出凍存的乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織解凍,使用TRIzol試劑盒(批號:RK90273J,上海通蔚生物科技有限公司)提取總RNA,并通過核酸蛋白儀(型號:NanoDrop One/OneC,上海嘉鵬科技有限公司)評估RNA的純度(A260/A280>1.8)。使用反轉錄試劑盒(批號:LK90172,上海嘉鵬科技有限公司)將大約1μg的總RNA反轉錄為cDNA,-20℃條件下保存備用。

4.實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術檢測lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平:以GAPDH和U6作為內參,RT-qPCR分析的所有引物由上海通蔚生物科技有限公司合成,引物序列詳見表1。根據RT-qPCR試劑盒(批號:LK35172,上海嘉鵬科技有限公司)的說明書,在RT-qPCR儀(型號:CFX130,上海巴玖實業有限公司)上進行反應,反應條件如下:95℃預變性30s,隨后95℃變性5s,60℃退火30s,循環45次。檢測得到的數據使用2-ΔΔCt方法計算lncRNA LINC00467(內參GAPDH)和miR-4735-3p(內參U6)的相對表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列

5.隨訪乳腺癌預后復發轉移情況:對所有患者進行3年的術后隨訪,主要是通過門診復查的方式,隨訪時間從手術當天開始,隨訪截止日期為2022年4月30日,主要記錄術后乳腺癌復發轉移情況。

結 果

1.乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平比較:與癌旁正常乳腺組織比較,乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達水平較高,miR-4735-3p表達水平較低(P<0.05,表2)。

表2 乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平比較

2.復發轉移組和未復發轉移組患者的臨床資料比較:隨訪結果顯示3例患者失訪,31例出現復發轉移(復發轉移組),75例未出現復發轉移(未復發轉移組)。復發轉移組和未復發轉移組患者的年齡、腫瘤最大徑及腫瘤分化程度比較,差異無統計學意義(P>0.05),而TNM分期比較,差異有統計學意義(P<0.05,表3)。

表3 復發轉移組和未復發轉移組患者的臨床資料比較

3.復發轉移組和未復發轉移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平比較:與未復發轉移組比較,復發轉移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達水平較高,miR-4735-3p表達水平較低(P<0.05,表4)。

表4 復發轉移組和未復發轉移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平比較

4.乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達水平的相關性:經ENCORI數據庫預測,lncRNA LINC00467與miR-4735-3p存在相應的結合位點(圖1);乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達水平呈負相關(r=-0.492,P=0.000,圖2)。

圖1 lncRNA LINC00467與miR-4735-3p靶向關系預測

圖2 乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達水平的相關性分析

5.影響乳腺癌患者術后3年內復發轉移的因素分析:以乳腺癌患者術后3年內是否發生復發轉移(發生=1,未發生=0)作為因變量,以表3和表4中差異有統計學意義的指標,即以TNM分期(Ⅰ期=0,Ⅱ期=1,Ⅲ期=2)及乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平(連續變量)作為自變量進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,TNM Ⅲ期及lncRNA LINC00467表達水平是影響乳腺癌患者術后3年內復發轉移的獨立危險因素,而miR-4735-3p表達水平是保護因素(P<0.05,表5)。

表5 影響乳腺癌患者術后3年內復發轉移的多因素Logistic回歸分析

6.乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平對術后3年內復發轉移的預測價值:ROC曲線分析結果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p以及兩者聯合預測術后3年內復發轉移的AUC分別為0.784、0.842、0.943;兩者聯合預測變量方程為z=0.498×lncRNA LINC00467-0.327×miR-4735-3p-8.154,兩者聯合優于lncRNA LINC00467、miR-4735-3p單獨預測(z=2.863、2.016,P=0.004、0.044,詳見圖3和表6)。

圖3 乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平預測術后3年內復發轉移的ROC曲線

表6 乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平對術后3年內復發轉移的預測價值

結 果

乳腺癌患者的早期篩查和臨床治療手段已取得了一定的進展,但其耐藥性、轉移和復發仍然是最主要的障礙,導致乳腺癌患者的預后較差[8]。乳腺癌的治療手段通常與患者預后有關,隨著特效藥的臨床使用,患者的生存率得到提高[9]。故亟需一種有效的預后生物學標志物,為研究新的乳腺癌的臨床治療措施提供參考。

lncRNA和miRNA是基因表達的主要調節因子,并且是癌癥發病機制中的重要功能介質[10, 11]。lncRNA通過直接或間接相互作用促進癌癥的發生、發展、復發和耐藥性,可以作為潛在的有效生物學標志物[12]。lncRNA LINC00467是一種新型的lncRNA,其表達升高能夠促進腫瘤細胞存活并抑制細胞凋亡,在神經母細胞瘤、食管癌等多種腫瘤中發揮相似的功能,作為致瘤基因參與癌癥的發生和進展,被視為一個潛在的癌癥預后標志物[13]。本研究結果顯示,lncRNA LINC00467在乳腺癌組織中表達上調,與之前報道的觀點一致,可能在乳腺癌中具有腫瘤促進作用,表明lncRNA LINC00467的表達失調可能與乳腺癌的發病機制存在一定的關聯[13, 14]。

與lncRNA一樣,miRNA在大多數癌癥中也表達失調,包括乳腺癌[15]。最近有報道稱lncRNA可以通過影響miRNA參與調控基因的表達,進而調節各種類型的癌癥[16, 17]。Teng等[6]和Li等[18]研究顯示,lncRNA ARAP1-AS1與miR-4735-3p結合調控下游靶基因表達從而調節膀胱癌和卵巢癌的進展,并且表明miR-4735-3p能夠抑制膀胱癌腫瘤細胞的遷移和侵襲,在膀胱癌細胞中具有抗癌作用。本研究結果顯示,與癌旁正常乳腺組織比較,miR-4735-3p表達水平在乳腺癌組織中下調,表明其在乳腺癌中可能具有腫瘤抑制作用。lncRNA和miRNA之間的相互作用在乳腺癌的進展和復發等方面起著至關重要的作用[12,19]。本研究利用ENCORI數據庫網站,預測lncRNA LINC00467與miR-4735-3p有相應的結合位點。因此,本研究進一步分析兩者的相關性,結果顯示,乳腺癌組織中lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達水平呈負相關,隨著lncRNA LINC00467的表達上調,miR-4735-3p的表達降低。說明lncRNA LINC00467可能通過負向調節miR-4735-3p在乳腺癌的進展中發揮關鍵作用,下一步筆者將通過體內和體外實驗驗證兩者的關系。

乳腺癌的治療效果可能受到潛在發病機制的限制,結合lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌組織中的表達情況,本研究分析了兩者與乳腺癌患者術后3年內復發轉移的關系,結果顯示,復發轉移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達水平較未復發轉移組高,miR-4735-3p的表達水平較未復發轉移組低,表明lncRNA LINC00467異常升高可能與乳腺癌患者術后3年內復發轉移的發生有關。關于lncRNA LINC00467高表達與不良預后密切相關的研究在結直腸癌和骨質瘤等癌癥中均有報道[3,20]。本研究結果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達水平是影響乳腺癌患者術后3年內復發轉移的獨立危險因素,與以往的研究類似,提示lncRNA LINC00467的高表達可能與乳腺癌患者術后3年內復發轉移有關,可作為評估乳腺癌患者術后復發轉移的潛在指標。目前關于miR-4735-3p在臨床中的研究較少,本研究結果顯示,乳腺癌組織miR-4735-3p表達水平是影響乳腺癌患者術后3年內復發轉移的保護因素,其表達水平越低,越容易發生復發轉移。此外,本研究還繪制了ROC曲線,結果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達水平用于預測乳腺癌患者術后3年內復發轉移具有較好的價值,且兩者聯合具有更高的AUC,敏感度也相應提高,更有利于評估乳腺癌患者術后3年內復發轉移情況。

綜上所述,乳腺癌組織中lncRNA LINC00467高表達,miR-4735-3p低表達,兩者均可用于預測乳腺癌患者術后3年內復發轉移,且兩者聯合預測價值更高,推測lncRNA LINC00467可能負向調節miR-4735-3p參與乳腺癌的進展,但本研究使用的樣本量較小,可能使結果具有局限性,后期將開展大樣本量研究對其發病機制進行深入探討。