稻縱卷葉螟轉錄因子CncC對桿狀病毒CnmeGV感染的響應及功能

張楠，韓光杰，劉琴，李傳明，祁建杭，陸玉榮，夏楊，徐健

稻縱卷葉螟轉錄因子CncC對桿狀病毒CnmeGV感染的響應及功能

張楠，韓光杰，劉琴，李傳明，祁建杭，陸玉榮，夏楊，徐健

江蘇里下河地區農業科學研究所/國家農業微生物揚州觀測實驗站，江蘇揚州 225007

【目的】研究稻縱卷葉螟（）轉錄因子CncC（Cap‘n’Collar Isoform C）及其調控的抗氧化酶基因在抗稻縱卷葉螟顆粒體病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus，CnmeGV）感染中的作用，進一步豐富昆蟲抗桿狀病毒感染的免疫調控機制研究。【方法】使用RT-PCR克隆得到稻縱卷葉螟（）cDNA全長序列并分析其蛋白結構；以106OB/mL濃度的CnmeGV或同濃度的CnmeGV和1 mmol·L-1CncC抑制劑——ML385混合液飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲，感染后6—48 h取樣，分析ML385對CnmeGV誘導的稻縱卷葉螟丙二醛（MDA）含量變化的影響，同時采用RT-qPCR分析病毒DNA復制水平、稻縱卷葉螟、谷胱甘肽過氧化物酶-3（，）、錳超氧化物歧化酶（，）和硫氧還蛋白過氧化物酶（，）等基因的表達水平，并每隔24 h統計幼蟲死亡數，繪制10 d內幼蟲的Kaplan-Meier生存曲線。使用1 mmol·L-1ML385或1 mmol·L-1ML385和200 μg·mL-1抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）混合液飼喂感染的幼蟲，使用RT-qPCR分析不同時間病毒DNA復制水平。【結果】cDNA全長為3 404 bp，包括321 bp的5-UTR，847 bp的3-UTR和2 211 bp的ORF，編碼一個長度為736 aa的蛋白，預測蛋白質分子質量為75.8 kDa。稻縱卷葉螟感染CnmeGV后丙二醛含量在感染的前12 h內顯著上調，隨后在24 h恢復到正常水平，而在48 h低于對照組。病毒感染導致在12、24和48 h顯著上調表達，分別為對照組的1.56、2.16和2.63倍，NAC處理顯著降低了CnmeGV誘導的表達上調的倍數，分別降低至對照組的48.12%、59.83%和56.32%。ML385處理導致病毒基因拷貝數在12和24 h分別增至對照組的1.79和1.76倍，同時導致稻縱卷葉螟感染CnmeGV 10 d后的死亡率顯著升高，從單CnmeGV處理組的73.33%升至94.14%，而NAC處理能夠減輕由于CncC抑制導致的病毒基因拷貝數的上調。CnmeGV感染分別導致表達量在感染后48 h上調至對照組的3.68倍，表達量在12、24和48 h分別上調至對照組的1.73、2.62和2.77倍，表達量在12和24 h分別上調至對照組的1.76和2.10倍，但48 h恢復至對照組水平。使用NAC或CncC抑制劑處理感病幼蟲發現，、和對CnmeGV感染的響應被顯著削弱。【結論】介導了CnmeGV感染誘導的、和上調表達，降低CnmeGV感染導致的氧化應激，從而限制病毒在其體內的復制并降低氧化損傷。

稻縱卷葉螟；稻縱卷葉螟顆粒體病毒；CncC轉錄因子；氧化應激；抗氧化基因；桿狀病毒

0 引言

【研究意義】稻縱卷葉螟（）是水稻上重要的遷飛性害蟲之一，幼蟲通過卷葉取食危害，嚴重時可導致水稻出現大片白葉，影響水稻產量[1]。目前生產上主要采用化學殺蟲劑對其進行控制，但化學農藥的頻繁使用已導致稻縱卷葉螟抗藥性顯著上升[2]，因此，亟需尋求綠色高效的防控技術。桿狀病毒科是具有大型雙鏈DNA基因組的無脊椎動物病毒，目前根據病毒基因組的比較，將桿狀病毒科分為4個屬：甲型桿狀病毒屬（，鱗翅目特異性核多角體病毒）、乙型桿狀病毒屬（，鱗翅目特異性顆粒體病毒）、丙型桿狀病毒屬（，膜翅目特異性核多角體病毒）和丁型桿狀病毒屬（，雙翅目特異性核多角體病毒）[3-5]，桿狀病毒作為一種新型的生物殺蟲劑，具有毒力高、專一性強、不易產生抗性和環境穩定性好等特性[6]，有希望成為防治農業害蟲的首選生物農藥。1979年，研究人員首次從廣東省恩平縣水稻田稻縱卷葉螟幼蟲體內分離得到一株可感染稻縱卷葉螟的桿狀病毒——稻縱卷葉螟顆粒體病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus，CnmeGV）[7]，其在田間可有效控制稻縱卷葉螟種群數量，應用前景廣泛[8]。同時又有研究發現CnmeGV感染稻縱卷葉螟的預期初始死亡時間約為8.4 d，致死中時間為20.16—21.98 d[9]，這一特性導致感染的幼蟲仍可取食葉片危害，嚴重限制其推廣應用。因此，探明稻縱卷葉螟對桿狀病毒的防御機制將為增強桿狀病毒殺蟲劑應用效果提供有力的技術支撐。【前人研究進展】在哺乳動物中研究發現，病毒誘導的氧化應激是病毒感染引起的炎癥反應和組織損傷的一個關鍵致病機制[10]。因此，清除體內多余的活性氧（reactive oxygen species，ROS）對于保護細胞免受病毒感染損傷至關重要[11]。在昆蟲中，病毒感染同樣會導致宿主氧化應激損傷，例如，使用表達錳超氧化物歧化酶基因（-）的重組苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染粉紋夜蛾（）細胞系Tn-5B1-4后，其生存時間顯著高于感染野生型AcMNPV的細胞[12]。棉鈴蟲（）感染棉鈴蟲核多角體病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus，HearNPV）后，其體內會產生過量的ROS，導致血淋巴中的丙二醛（MDA）濃度顯著升高[13]。進一步研究發現，HearNPV感染棉鈴蟲誘導的高水平ROS限制了幼蟲的生長和發育[14]。另外，硫氧還蛋白過氧化物酶基因（）的敲低導致棉鈴蟲對HearNPV的易感性顯著增加[13]。對稻縱卷葉螟的研究發現，9種抗氧化酶基因和4種抗氧化蛋白基因mRNA表達響應CnmeGV的感染而上調，其中包括谷胱甘肽過氧化物酶-3基因（-）、-和[15]。桿狀病毒的感染會造成昆蟲氧化損傷，并激活昆蟲抗氧化酶系統。由于昆蟲不像脊椎動物那樣擁有完整的免疫系統，抗氧化酶系統在昆蟲防御病毒感染中就起著更為關鍵的作用，然而對于昆蟲在感染桿狀病毒過程中的抗氧化機制研究還較少。抗氧化反應通路的關鍵轉錄因子——核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）屬于亮氨酸拉鏈家族。在正常生理條件下，Kelch ECH結合蛋白1（Keap1）結合Nrf2蛋白，使其定位于細胞質中，最終被蛋白酶體降解。在氧化脅迫下，Keap1與Nrf2蛋白解離，Nrf2易位至細胞核，與小分子Maf蛋白結合到靶基因啟動子中的抗氧化反應元件（antioxidant responsive element，ARE），加速抗氧化基因的轉錄[16-17]。Nrf2通過誘導多種關鍵抗氧化基因的表達來消除細胞中過量ROS的積累，包括谷胱甘肽代謝酶[18-19]、參與硫氧還蛋白代謝的酶[20]以及多種過氧化物代謝酶[19,21]，因此Nrf2在細胞抗氧化防御中具有重要作用。Nrf2在昆蟲中又被稱為Cap ‘n’ Collar Isoform C（CncC）。在黑腹果蠅（）中，使用RNA干擾（RNAi）技術敲減的表達，顯著降低了果蠅取食百草枯后的存活率。相反，過表達則分別使雌、雄蟲存活率升高[22]。同樣在果蠅的研究中發現，CncC通過調控等抗氧化基因表達顯著降低了腸道干細胞中的ROS水平，導致腸道干細胞的增殖受到抑制，維持了腸道的穩態[23]。Nrf2調節病原微生物誘導的ROS生成，在細胞消除細菌和病毒等病原體的過程中具有同樣重要的作用[24]。甲型流感病毒（H1N1 virus）感染人鼻黏膜上皮細胞（HNEpC）會引起細胞內ROS水平的嚴重失調，mRNA的敲減則顯著增強了H1N1病毒在細胞中的復制[25]。有研究顯示，使用Nrf2激活劑激活Nrf2后，鯉春病毒血癥病毒（SVCV）在胖頭鯉肌肉細胞系（FHM）中的復制水平被顯著降低，而的敲減導致病毒-的轉錄水平顯著高于對照組[26]。在甜菜夜蛾（）中，敲減顯著下調過氧化物酶基因的表達，幼蟲感染囊泡病毒后病毒滴度和幼蟲死亡率均顯著上升[27]。【本研究切入點】已有多項研究揭示了Nrf2通過調節抗氧化酶參與宿主防御病原微生物在感染過程中的作用。然而，昆蟲CncC通路響應桿狀病毒感染調控抗氧化系統的功能還未見報道。【擬解決的關鍵問題】克隆稻縱卷葉螟同源基因的全長序列，分析響應CnmeGV感染引起氧化應激的表達模式，明確其通過調節稻縱卷葉螟抗氧化能力以抵抗病毒感染的作用。

1 材料與方法

試驗于2022年在江蘇里下河地區農業科學研究所完成。

1.1 試蟲與供試病毒

將稻縱卷葉螟成蟲按雌雄比1﹕1配對，放入1 L的杯口蓋有保鮮膜的塑料水杯中交配產卵。幼蟲使用玉米幼苗飼養于溫度（28±1）℃、相對濕度80%、光照強度6 000 lx的生化培養箱。飼養繁殖多代后，挑選健康、蟲體大小一致的3齡幼蟲供試。CnmeGV原始毒株為實驗室保存，以無菌水稀釋至1×106OB/mL后噴施于玉米葉片，供試蟲取食以增殖病毒。

1.2 CmCncC克隆

利用家蠶（）序列在稻縱卷葉螟轉錄組數據庫[15]中檢索稻縱卷葉螟同源基因，設計兩對特異性引物（表1）進行中間片段的RT-PCR、克隆和測序，拼接獲得中間片段序列。根據測序結果分別在5和3端設計兩條特異性引物（表1），使用cDNA末端快速擴增（RACE）技術進行巢式PCR，并克隆和測序，與上述獲得的中間片段拼接獲得全長cDNA。總RNA提取和單鏈cDNA合成以及RACE具體方法分別參照Qiagen公司RNeasy Mini Kit和寶生物工程（大連）有限公司PrimescriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis kit以及SMARTTMRACE cDNA Amplification試劑盒（Clontech）說明書。

1.3 稻縱卷葉螟丙二醛含量測定

分別使用1×106OB/mL CnmeGV飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲，收集取食6、12、24和48 h后的試蟲，以未感染幼蟲作為對照（Control），使用脂質氧化檢測試劑盒（碧云天生物）檢測CnmeGV感染對丙二醛含量的影響。同時，使用1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液飼喂稻縱卷葉螟幼蟲，以使用ML385飼喂的幼蟲作為對照，檢測ML385對CnmeGV感染誘導的丙二醛含量的影響。所有處理設置3個生物重復組，每組收集試蟲30只。

1.4 CmCncC在CnmeGV感染過程中的功能分析

1.4.1mRNA表達對CnmeGV感染的響應 分別使用CnmeGV或200 μg·mL-1NAC和CnmeGV的混合液噴于玉米葉片上，接種稻縱卷葉螟3齡幼蟲，收集感染6、12、24和48 h的試蟲，以未感染幼蟲作為對照（Control）。使用Trizol（Invitrogen）提取RNA后，熒光定量反轉錄PCR（RT-qPCR）檢測的表達，以稻縱卷葉螟-作為內參基因，引物見表1。所有試驗設置3個生物重復組，每組收集試蟲30只。

1.4.2 CmCncC抑制對CnmeGV DNA復制的影響 使用涂抹有CnmeGV或1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲，6、12、24和48 h后收集試蟲，根據Lo等[28]和韓光杰等[29]的方法并進行稍微修改進行病毒DNA的qPCR檢測，稱取100 mg幼蟲，使用DNAiso Reagent（Takara）提取DNA，并通過qPCR檢測病毒基因拷貝數以確定病毒DNA的復制水平，引物見表1。接著，為了檢測CncC的抑制是否是通過改變氧化還原狀態影響病毒的復制，使用有NAC、ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲，6、12、24和48 h后收集試蟲，如上檢測病毒DNA復制水平，以1 mmol·L-1ML385和CnmeGV混合液飼喂的幼蟲作為對照。所有試驗設置3個生物重復組，每組收集試蟲30只。

表1 用于RT-PCR、RT-qPCR和RACE的引物序列

1.4.3 CmCncC抑制對CnmeGV殺蟲效果的影響 首先，為了明確飼喂ML385對幼蟲生存率的影響，使用涂抹有ML385的玉米葉片飼喂幼蟲，每隔24 h統計試蟲的死亡數，并以健康幼蟲作為對照。接著使用涂抹有ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲，每隔24 h統計試蟲的死亡數，并以僅感染CnmeGV的幼蟲作為對照。參見徐健等[9]方法統計蟲口死亡率和死亡時間，繪制生存曲線。所有試驗設置3個生物重復組，每組收集試蟲30只。

1.5 GPx-3、Mn-SOD和TPx響應CnmeGV感染的表達分析

使用CnmeGV飼喂稻縱卷葉螟3齡幼蟲，收集感染6、12、24和48 h的試蟲，以未感染幼蟲作為對照（Control）。使用Trizol（Invitrogen）提取RNA后，利用RT-qPCR分析-、-和表達量的動態變化，以稻縱卷葉螟-作為內參基因，引物見表1。接著使用NAC和CnmeGV混合液或ML385和CnmeGV混合液的玉米葉片飼喂幼蟲，6、12、24和48 h后收集試蟲，如上方法檢測、和的mRNA表達，以CnmeGV飼喂的稻縱卷葉螟為對照。所有試驗設置3個生物重復組，每組收集試蟲30只。

1.6 數據分析

使用GraphPad Prism 9.0統計軟件分析數據。數據表示為至少3個獨立試驗的平均值±標準誤差（SEM）。通過檢驗分析基因表達量及丙二醛含量的差異，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用Log-rank檢驗進行生存曲線比較，＜0.01或＜0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 CmCncC克隆及分析

（Genbank登錄號：OQ606863）cDNA全長3 404 bp，包括321 bp的5-UTR、847 bp的3-UTR和2 211 bp的ORF，編碼一個長度為736 aa的蛋白，預測蛋白質分子質量為75.8 kDa，等電點為6.36。氨基酸序列比對顯示，CmCncC與小菜蛾（）、棉鈴蟲、二化螟（）、草地貪夜蛾（）的CncC分別具有74.63%、75.03%、75.03%和75.03%的一致性，并且均包含有6個功能性Nrf2-ECH（Neh）同源結構域、CNC-bZIP DNA結合結構域和Keap1結合基序（DMG和ETGE）（圖1）。

圖中紅框標注的Neh1-6為CncC的6個保守功能域，藍框標注的為CNC-bZIP DNA結合結構域，綠框標注的為與Keap1結合基序（DMG和ETGE）

The six conserved functional domains of CncC, denoted by Neh1-6 in red boxes, are shown, as well as the CNC-bZIP DNA binding domain denoted by blue boxes, and the Keap1 binding motifs (DMG and ETGE) denoted by green boxes

圖1 CmCncC與小菜蛾CncC、棉鈴蟲Nrf2、二化螟CncC和草地貪夜蛾CncC氨基酸序列的比對

Fig. 1 Amino acid sequence alignments of CmCncC withCncC,Nrf2,CncC andCncC

2.2 稻縱卷葉螟體內丙二醛含量分析

以丙二醛含量作為脂質過氧化指標來驗證CnmeGV感染影響稻縱卷葉螟體內氧化應激的反應，結果顯示在感染6和12 h后，其體內丙二醛含量顯著上升至對照組（未感染CnmeGV）的4.84和17.25倍（＜0.05），而在感染48 h時，丙二醛含量則降為對照組的46.23%（＜0.05）（圖2-A）。進一步檢測了CmCncC抑制后稻縱卷葉螟丙二醛含量，結果顯示ML385+CnmeGV處理導致丙二醛含量在處理6、12、24和48 h后分別顯著上調至對照組（ML385處理）的7.25、23.62、3.88和2.10倍。與使用CnmeGV處理導致的丙二醛含量上調倍數比較顯示，ML385處理在12、24和48 h后顯著增強了病毒感染導致的丙二醛含量上調倍數（圖2-B）。結果表明ML385對CmCncC的抑制能夠增強CnmeGV感染導致的氧化應激損傷。

A：稻縱卷葉螟感染CnmeGV后丙二醛含量檢測Detection of MDA content after GnmeGV infection；B：ML385處理對病毒誘導的丙二醛含量變化的影響The effect of ML385 treatment on virus-induced changes in MDA content

2.3 稻縱卷葉螟感染CnmeGV后CmCncC表達水平

使用CnmeGV感染稻縱卷葉螟后，RT-qPCR檢測其體內mRNA表達水平的變化。結果顯示，在感染12—48 h內，的表達分別上調至對照組（未感染CnmeGV）的1.56、2.16和2.63倍（＜0.05）（圖3-A）。NAC處理顯著降低了CnmeGV誘導的表達上調的倍數，在處理12、24和48 h后，分別降低至GV/Control組比值的48.12%、59.83%和56.32%（＜0.05）（圖3-B）。結果表明，CnmeGV感染可能通過氧化應激途徑誘導表達。

2.4 抑制CmCncC功能對CnmeGV增殖及稻縱卷葉螟生存率影響

使用CncC抑制劑（ML385）與CnmeGV共同飼喂稻縱卷葉螟，檢測其體內病毒DNA復制水平，結果顯示CmCncC的抑制導致病毒基因拷貝數在12和24 h分別增至對照組（飼喂CnmeGV）的1.79和1.76倍（＜0.05）（圖4-A）。但附加NAC處理則會減輕由CmCncC抑制導致的病毒基因拷貝數的上調（＜0.05）（圖4-B）。同時，檢測抑制CmCncC功能對CnmeGV致死作用的影響，發現抑制劑本身對稻縱卷葉螟生長無明顯影響（＝0.7235）（圖4-C），而抑制劑與病毒共處理導致稻縱卷葉螟10 d死亡率顯著升高，從單病毒處理組的73.33%升至94.14%，兩者生存曲線呈顯著差異（＝0.018）（圖4-C）。

A：稻縱卷葉螟感染CnmeGV后CmCncC mRNA表達量檢測Detection of CmCncC mRNA level after CnmeGV infection；B：NAC處理對病毒誘導的CmCncC表達變化的影響The effect of NAC treatment on virus-induced changes in CmCncC mRNA level

A：CnmeGV合并ML385處理后，提取DNA，檢測CnmeGV granulin基因拷貝數After treatment with CnmeGV combined ML385, DNA was extracted and the copy number of the CnmeGV granulin was detected；B：NAC對抑制劑處理導致的病毒基因拷貝數變化的影響檢測The effect of NAC on the changes in viral gene copy numbers caused by ML385 treatment was examined；C：病毒感染后稻縱卷葉螟的生存動態分析The survival dynamics of the C. medinalis after viral infection were analyzed

2.5 CncC介導了CnmeGV感染對GPx-3、Mn-SOD和TPx mRNA表達的誘導

CncC通過調控抗氧化基因轉錄可有效防止氧化應激誘導的細胞損傷，、和等作為CncC重要的下游基因，在CncC調控宿主抗氧化應激中具有重要功能[30-32]。本研究發現，CnmeGV感染后，表達水平在48 h上調至對照組（未感染CnmeGV）的3.68倍（＜0.01）（圖5-A），表達水平在12和24 h分別上調至對照組的1.76和2.10倍（＜0.05），但是在48 h降低至對照組水平（圖5-B），表達水平在12、24和48 h分別上調至對照組的1.73（＜0.05）、2.62和2.77倍（＜0.01）（圖5-C）。使用NAC或CncC抑制劑處理則顯著降低病毒感染對、和表達的誘導作用（＜0.05）（圖6）。

3 討論

3.1 稻縱卷葉螟CncC蛋白具有典型的Nrf2轉錄因子結構域

Nrf2是響應氧化應激的關鍵轉錄因子，在昆蟲體內一般稱為CncC，被氧化應激激活的CncC通過與下游基因啟動子區的ARE元件結合刺激抗氧化基因轉錄，在保護細胞免受氧化損傷方面具有重要作用[33-34]。在果蠅和哺乳動物中的抗氧化作用已多有研究，但是在昆蟲抵抗桿狀病毒過程中的作用還未有報道。本研究克隆了稻縱卷葉螟同源基因的cDNA全長序列，氨基酸序列比對顯示，CmCncC與小菜蛾、棉鈴蟲、二化螟、草地貪夜蛾的同源蛋白具有較高的一致性，且均包含有6個功能性Neh結構域、CNC-bZIP DNA結合結構域和Keap1結合基序（DMG和ETGE）（圖1）。Neh1區域負責DNA識別；Neh2包含ETGE和DLG基序，這是與Keap1相互作用所必需的；Neh4和Neh 5是基因轉錄的反式激活域；Neh6充當降解決定子，介導細胞核中Nrf2的降解[35]。Keap1通過與Nrf2的Neh2結構域結合，將Nrf2隔離在細胞質中，形成Keap1-Nrf2復合物[36-38]。一旦進入細胞質，Keap1-Nrf2復合物就會與E3泛素連接酶結合，導致Nrf2降解并終止Nrf2信號通路[39-40]。氧化應激則使該復合物解離，導致Nrf2轉移至細胞核以激活其轉錄因子功能。

**：差異極顯著extremely significant difference (P＜0.01)。下同The same as below

圖6 NAC或ML385處理對CnmeGV誘導的抗氧化基因表達水平影響

3.2 CncC降低CnmeGV誘導的氧化應激以抵抗感染損傷

研究發現包括桿狀病毒在內的昆蟲病毒感染會導致昆蟲體內產生過量ROS[27,41-42]。本研究檢測了稻縱卷葉螟感染CnmeGV后體內丙二醛含量的變化，結果顯示，在感染后6和12 h，丙二醛含量顯著增加，而在48 h顯著降低（圖2），表明CnmeGV在感染前期迅速誘導大量的ROS生產，造成脂質氧化，而丙二醛在感染48 h后降低，則可能與細胞的大量死亡有關。研究結果表明在感染前期，病毒會迅速誘導宿主的氧化應激反應。這與在家蠶中的研究一致，家蠶核多角體病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosisvirus）感染導致家蠶體內ROS含量隨著處理時間的延長先升高后降低，在72 h時達到最高水平，在96 h則有所下降[43]。因此，為了降低氧化損傷，宿主昆蟲會激活自身的抗氧化防御系統以應對病毒的感染。進一步研究發現感染CnmeGV后稻縱卷葉螟表達會在12—24 h顯著上調（圖3-A），而抗氧化劑NAC處理則會導致對CnmeGV的響應顯著減弱（圖3-B）。與此發現相似，BmNPV感染導致家蠶超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶等抗氧化酶的活性先降低后升高[43]，表明桿狀病毒感染會引起宿主抗氧化防御系統的響應。使用ML385處理發現，CmCncC的抑制進一步提高了病毒感染導致的丙二醛含量升高（圖2），并顯著增加病毒復制和幼蟲死亡率（圖4-A、4-C），而CmCncC抑制導致病毒復制的增強會在一定程度上被NAC處理所拯救（圖4-B），這些結果表明誘導宿主的抗氧化功能對于保護宿主免受病毒引起的氧化損傷具有重要的作用。有研究指出，人樹突狀細胞感染登革熱病毒后，會誘導細胞內ROS水平增加，而由Nrf2調節的抗氧化通路的激活有助于通過維持氧化還原穩態來調節細胞抗病毒和凋亡反應[44]。然而在埃及伊蚊（）中發現，中腸中敲減導致氧化應激水平的上調則會顯著降低中腸中寨卡病毒的感染，這可能由于控制下的抗氧化機制在促進氧化還原平衡和中腸組織穩態的同時，也減弱了中腸屏障感染的作用[45]，因此有必要進一步研究在稻縱卷葉螟不同組織部位發揮功能的差異性。

3.3 CncC通過調控GPx-3、Mn-SOD和TPx mRNA表達參與減輕病毒感染誘導的氧化應激

Nrf2/ARE通路是迄今為止發現的最重要的內源性抗氧化信號通路之一。當體內氧化還原平衡失調時，Nrf2被激活，通過結合ARE來調節抗氧化基因的表達，例如-、-和等[30,46]。在骨髓間充質干細胞研究中，氧化應激促進Keap1-Nrf2復合物的解離，從而激活Nrf2，激活的Nrf2進入細胞核，啟動和等抗氧化酶基因的表達[47]。暴露于過量ROS時，昆蟲體內的CncC同樣會被激活。近期在赤擬谷盜（）的研究中指出，由溴氰菊酯引起的ROS過量導致昆蟲體內AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）被磷酸化激活，激活的AMPK又使CncC磷酸化從而也被激活[48]。之前有研究顯示，核多角體病毒感染棉鈴蟲后會導致過量ROS的產生，并誘導表達顯著上調，同時的敲減則顯著增加棉鈴蟲對病毒的敏感性[13]。在家蠶和果蠅研究中也發現，氧化應激誘導轉錄因子CncC參與了對表達的調控[23,30]。這些報道與本研究結果一致，在稻縱卷葉螟中，、-和表達會響應CnmeGV感染顯著上調（圖5），并且NAC或CncC抑制劑處理都會在一定程度上削弱CnmeGV感染對這些基因表達的誘導（圖6），這些結果表明作為響應氧化應激的轉錄因子，可能在病毒感染期間參與了對、和表達的調控以減輕氧化損傷，但CmCncC是否能結合這3個基因的啟動子區域進而直接調控這3個基因的轉錄還需要進一步的實驗驗證。

由于昆蟲的抗病毒機制，桿狀病毒制劑的殺蟲速度慢于傳統化學農藥，桿狀病毒殺蟲劑的殺蟲速度因昆蟲的抗病毒機制而變得很慢。因此，了解昆蟲抗病毒感染的免疫機制將有助于桿狀病毒殺蟲劑的推廣應用。本研究從CnmeGV感染引起氧化損傷的角度出發，分析了重要抗氧化轉錄因子CncC在抗病毒過程中的作用，闡明了昆蟲可通過CncC信號通路調節抗氧化基因表達，減少氧化損傷的功能。該結果為進一步明確害蟲免疫桿狀病毒的機制打下基礎，為增強桿狀病毒殺蟲劑的殺蟲效果提供了潛在靶標，有利于相關產品的推廣與應用。

4 結論

稻縱卷葉螟CncC屬于昆蟲Cap ‘n’ Collar家族，具有完整的CncC結構域，其通過介導桿狀病毒CnmeGV感染引起的、和mRNA表達上調，減輕了感染導致的氧化損傷。結果揭示了CncC的抗氧化功能對昆蟲免疫桿狀病毒的重要作用，為通過破壞稻縱卷葉螟的抗氧化能力提高桿狀病毒的殺蟲效果打下理論基礎。

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Response and function of the transcription factor CncC ininfected with baculovirus CnmeGV

ZHANG Nan, HAN GuangJie, LIU Qin, LI ChuanMing, QI JianHang, LU YuRong, XIA Yang, XU Jian

Lixiahe District Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu/National Agricultural Experimental Station for Agricultural Microbiology in Yangzhou, Yangzhou 225007, Jiangsu

【Objective】The objective of this study is to research the role of transcription factor CncC (Cap ‘n’ Collar Isoform C) ofand its regulation of antioxidant enzyme genes in the infection ofCnaphalocrocis medinalis granulovirus (CnmeGV), and to further enrich the study of immune regulation mechanism of insects against baculovirus.【Method】The full-length cDNA sequence ofin() was cloned by RT-PCR, and its protein structure was analyzed. Third instar larvae ofwere fed with 106OB/mL concentration of CnmeGV or a mixture of the same concentration of CnmeGV and 1 mmol·L-1CncC inhibitor ML385. Samples were taken 6-48 h after infection to analyze the effect of ML385 on the change of malondialdehyde (MDA) content induced by CnmeGV, and viral DNA replication levels, the expression levels of,-(-),(-), and() were analyzed by RT-qPCR. The number of larval deaths was counted every 24 hours, and the Kaplan-Meier survival analysis of the larvae within 10 d was conducted. Infected larvae were fed with 1 mmol·L-1ML385 or a mixture of 1 mmol·L-1ML385 and 200 μg·mL-1antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC), and viral DNA replication levels at different times were analyzed using RT-qPCR.【Result】The full length cDNA ofwas 3 404 bp, including a 321 bp 5-UTR, an 847 bp 3-UTR, and a 2 211 bp ORF that encoded a protein of 736 amino acids. The predicted molecular weight of the protein was 75.8 kDa. The MDA content insignificantly increased within the first 12 h of CnmeGV infection and returned to normal levels at 24 h, but was lower than the control group at 48 h. The expression ofwas significantly up-regulated at 12, 24, and 48 h after viral infection, by 1.56, 2.16, and 2.63 folds of the control group, respectively. NAC treatment significantly reduced the fold increase ofexpression induced by CnmeGV, to 48.12%, 59.83%, and 56.32% of the control group, respectively. Treatment with the ML385 caused an increase in viral gene copy number to 1.79 and 1.76 folds of the control group at 12 and 24 h, respectively, and significantly increased the mortality rate ofinfected with CnmeGV 10 d after treatment, from 73.33% to 94.14%. NAC treatment partially alleviated the up-regulation of viral gene copy number caused by CncC inhibition. CnmeGV infection led to a 3.68-fold increase in-expression level at 48 h after infection, and 1.73-, 2.62-, and 2.77-folds increase in-expression level at 12, 24, and 48 h after infection, respectively. The expression level ofincreased by 1.76 and 2.10 folds at 12 and 24 h after infection, respectively, but returned to the control group level at 48 h, and treatment with NAC or the CncC inhibitor significantly weakened the responses of-,-, andto CnmeGV infection.【Conclusion】CmCncC mediates the CnmeGV infection-induced up-regulation of-,-andmRNA levels and reduces oxidative stress caused by CnmeGV infection, thereby limiting virus replication, and reducing oxidative damage.

; Cnaphalocrocis medinalis granulovirus (CnmeGV); CncC transcription factor; oxidative stress; antioxidant gene; baculovirus

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.13.005

2023-03-21；

2023-05-13

江蘇省自然科學基金（BE20191216）、江蘇省自主創新資金項目（CX[20]1004）、江蘇省“333”優秀青年人才項目（蘇人才辦[2022]21號）、揚州市現代農業項目（YZ2021034）

張楠，E-mail：znfezhangnan@hotmail.com。韓光杰，E-mail：hanguangjie177@163.com。張楠和韓光杰為同等貢獻作者。通信作者徐健，E-mail：bio-xj@163.com

（責任編輯 岳梅）