菠蘿加工副產物-乳清蛋白混菌發酵條件的研究

羅迦蔚,肖珊,胡峣峣,彭雪穎,胡文鋒*

1(華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510000)2(東莞理工學院 化學工程與能源技術學院,廣東 東莞,523808)

菠蘿又名鳳梨,其含有豐富的有機酸、氨基酸、維生素與礦物質等營養成分,并且味道清甜、氣味芬芳[1]。菠蘿原產于美洲熱帶地區,我國菠蘿的種植區域主要在廣東、廣西、福建、臺灣等地區,是我國華南地區主要的外銷水果[2]。我國的菠蘿加工制品主要有菠蘿罐頭與菠蘿汁,在菠蘿加工過程中會產生大量的加工副產物,約占菠蘿總量的50%[3],其營養成分與菠蘿果肉基本相同[4]。如果菠蘿加工副產物不加以有效利用,不僅會造成資源的浪費,也會成為環境污染源之一。目前關于菠蘿加工副產物再利用方面的研究,主要集中在以其為原料提取多酚[5]和多糖[6]等活性成分,以及發酵制備果酒[7]、果醋[8]等發酵產品。

發酵是果蔬加工副產物再利用的最常用方法之一。微生物發酵可使果蔬加工副產物中的總酚、有機酸等活性物質增加,并可提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)等酶的活力,也可賦予發酵產品更豐富的風味[9]。乳酸菌和酵母菌是果蔬發酵最常用的菌種,而且很多研究表明混菌發酵的效果更好[10-11]。在混合發酵過程中,酵母菌代謝可產生多種營養物質,而這些營養物質對乳酸菌的生長具有促進作用,同時酵母菌也能從乳酸菌的發酵產物中獲得有益于生長繁殖的物質與能量[12]。而利用土著菌混合發酵菠蘿及其加工副產物的研究還鮮有報道。

由于菠蘿加工副產物中蛋白質含量較低,添加蛋白質可以提高發酵體系的蛋白質含量,有利于發酵的進行。乳清蛋白是奶酪加工的副產物之一,有研究表明其在發酵過程中可產生多種生物活性肽,具有抗氧化、提高機體免疫力等多種保健功能[13]。本實驗利用乳酸菌和酵母菌發酵添加了乳清蛋白的菠蘿加工副產物,分別以發酵產品中的總酚含量和SOD酶活力為指標對發酵培養基和發酵工藝進行優化,并對發酵產品中的有機酸含量進行分析,以探究土著菌對果蔬發酵產品質量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿,市售;乳酸菌和酵母菌,實驗室從菠蘿果肉中篩選,經鑒定為乳酸乳球菌(LactococcuslactisLA5)和仙人掌有孢漢遜酵母(HanseniasporaopuntiaeSA2);YPD液體培養基、MRS肉湯培養基、MRS培養基,廣東環凱微生物科技有限公司;Folin-Ciocalteu試劑、SOD活性檢測試劑盒、沒食子酸(標準品),北京索萊寶科技有限公司;乳清蛋白,上海源葉生物有限公司;有機酸標準溶液、甲醇(色譜級),上海阿拉丁生化科技有限公司;NaOH、HCl溶液(均為食品級),諾爾化工有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Evolution 260分光光度計,美國賽默飛世爾科技公司;Spark 10M多功能酶標儀,瑞士帝肯公司;ZQZY-78BV振蕩培養箱,上海知楚儀器有限公司;恒溫恒濕培養箱,上海坤天實驗室儀器有限公司;HH-1數顯恒溫水浴鍋,常州澳華儀器有限公司;壓力蒸汽滅菌器,上海三申醫療器械有限公司;1260高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

選取新鮮菠蘿→榨汁→收集菠蘿加工副產物→添加蛋白→調節pH→65 ℃水浴15 min→加入酵母菌與乳酸菌→發酵→得發酵液→冷凍干燥48 h→菠蘿加工副產物發酵產品

1.3.2 發酵菌種子液的制備

將乳酸菌與酵母菌分別接入MRS與YPD液體培養基中。應用MRS和YPD液體培養基對乳酸菌和酵母菌進行活化復壯,然后培養14 h作為種子液。

1.3.3 菠蘿預處理

將采購的新鮮菠蘿去皮后榨汁,對榨汁后的殘渣即菠蘿加工副產物進行收集。按一定的質量比例加入蒸餾水,與菠蘿加工副產物進行攪拌混合成果漿后,添加乳清蛋白,用1 mol/L NaOH溶液與1 mol/L HCl溶液調節pH,之后置于65 ℃熱水中水浴滅菌15 min。冷卻后在無菌條件下接種活化后的乳酸菌與酵母菌,置于培養箱內暗處靜置發酵。發酵結束后收集發酵液,冷凍干燥48 h后得到菠蘿加工副產物-乳清蛋白發酵產品。

1.3.4 發酵配方與發酵工藝優化單因素試驗設計

研究不同梯度的菠蘿加工副產物添加量(30%、40%、50%、60%和70%)、乳清蛋白添加量(1.0%、1.4%、1.8%、2.2%和2.6%)、初始pH(3.0、3.5、4.5、5和5.5)對發酵產品的SOD酶活力與總酚含量的影響,進而對發酵配方進行優化。同時研究不同梯度的發酵時間(12、18、24、30和36 h)、發酵溫度(5、30、35、40和45 ℃)、乳酸菌接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)、發酵菌種接種比例(7∶1、6∶1、5∶1、4∶1和3∶1)對發酵產品中總酚含量與SOD酶活力的影響,對發酵工藝進行優化。單因素變化時,其他發酵參數固定,菠蘿加工副產物添加量設為50%,乳清蛋白添加量設為1.8%,乳酸菌與酵母菌的接種比例設為5∶1,乳酸菌的接種量設為2%(體積分數),發酵初始pH設為4.5,發酵時間設為24 h。

1.3.5 指標測定

SOD酶活力的測定參照試劑盒說明書的步驟進行;總酚含量的測定參照夏國燈等[14]的方法略作修改,結果以每克樣品中所含的沒食子酸的量(gallic acid equivalent, GAE)表示(mg GAE/g);有機酸的測定采用液相色譜法[15],通過高效液相色譜系統與紫外檢測器進行測定,有機酸的含量以mg/g表示。

1.3.6 發酵配方正交優化實驗

根據單因素試驗篩選出最佳菠蘿副產物添加量、乳清蛋白添加量、初始pH值,設計三因素三水平的L9(33)正交試驗,根據總酚含量進一步確定菠蘿加工副產物發酵的最優配方。正交試驗各因素水平如表1所示。

表1 正交試驗設計表

1.3.7 發酵工藝響應面優化

根據單因素試驗結果,對菠蘿加工副產物發酵溫度、發酵時間、乳酸菌接種量以及發酵菌接種比例4個因素進行四因素三水平Box-Benhnken Design試驗,以發酵產品中的SOD活力為響應值,以得到菠蘿加工副產物最優發酵工藝。響應面實驗各因素水平如表2所示。

表2 Box-Behnken實驗因素和水平設計

1.4 數據處理

每次實驗均進行3次重復操作,實驗數據處理、統計分析和圖表繪制采用Excel、Design-Expert11、SPSS 23和Origin軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

菠蘿加工副產物的添加量、乳清蛋白添加量、初始pH、發酵時間、發酵溫度、乳酸菌接種量、接種比例對發酵產品SOD活性與總酚含量的影響如圖1所示。結果表明,隨著菠蘿加工副產物添加量的增加,總酚含量與SOD活性隨之增加,當菠蘿加工副產物添加量為50%時,總酚含量達到最大值,為0.55 mg GAE/g,SOD活力也達到峰值,為149.84 U/g。當繼續增大菠蘿加工副產物添加量時,總酚與SOD活性則下降,這可能是由于隨著菠蘿加工副產物的增加,發酵培養基中糖含量增加,對微生物生長具有抑制作用[16]。

a-菠蘿加工副產物添加量;b-乳清蛋白添加量;c-初始pH;d-發酵時間;e-發酵溫度;f-乳酸菌接種量;g-乳酸菌∶酵母菌

隨著乳清蛋白添加量的增加,發酵體系中的SOD活性與總酚含量呈上升的趨勢。當乳清蛋白添加量為2.2%與2.6%時,發酵產品中總酚與SOD活力無顯著性差異。乳清蛋白添加量為2.6%時,SOD活性(155.80 U/g)和總酚含量(0.69 mg GAE/mL)達到峰值。綜合考慮,選擇乳清蛋白添加量1.8%～2.6%進行下一步的正交試驗。

如圖1-c所示,隨著初始pH值的增大,SOD活性與總酚含量呈先上升后下降的趨勢,當初始pH為5時,發酵體系中的SOD活力與總酚含量均達到最大值。當初始pH為5.5時,隨著初始pH的增大,SOD活性與總酚含量呈下降的趨勢。這可能是由于高的pH值抑制了乳酸菌與酵母菌的生長代謝,導致活性物質的產量降低。

如圖1-d所示,隨著發酵時間的延長發酵液的總酚含量與SOD活力呈現出先增加后減少的趨勢,當發酵時間為24 h時,SOD活力與總酚含量達到最大值。當發酵時間大于24 h,總酚含量與SOD活性呈下降趨勢,這可能是由于發酵基質的微生物數量增加導致的。

發酵溫度對發酵產物總酚含量及SOD活力的影響如圖1-e所示。隨著發酵溫度的增加,總酚含量與SOD活力呈先上升后下降的趨勢,當發酵溫度達到35 ℃時,SOD活力達到最大值為155.39 U/g,總酚含量同樣達到最大值為0.71 mg GAE/g。當發酵溫度過高時,SOD活力與總酚含量減少,這可能由于過高的發酵溫度抑制了乳酸菌與酵母菌的生長。

乳酸菌接種量對發酵產物SOD活力與總酚含量的影響如圖1-f所示。隨著乳酸菌接種量的增加,SOD活力與總酚含量呈先上升后下降的趨勢,當乳酸菌接種量為1.5%時,SOD活力達到最大值為154.74 U/g,總酚含量達到最大值為0.67 mg GAE/g,然而隨著乳酸菌接種量的增加兩者均呈下降的趨勢。這可能是由于接種量過大導致發酵產物減少。

發酵菌接種比例對發酵液SOD活力與總酚含量的影響如圖1-g所示。隨著乳酸菌接種比例的增大,發酵產品中SOD活力與總酚含量呈現先增加后減少的趨勢,當乳酸菌∶酵母菌為6∶1時,SOD活力與總酚含量達到最大值。當繼續增大乳酸菌接種比例時,SOD活力與總酚含量呈現下降的趨勢,這可能是由于當接種比例不適宜時,混合菌種間相互競爭生長空間與養分,繼而導致微生物生長不佳,使次級代謝產物減少。

2.2 正交試驗設計及結果

根據單因素試驗結果設計正交試驗,在不同發酵配方下測定各組發酵產品的總酚含量,結果如表3所示。

表3 正交試驗結果

由極差R可知,各因素對混菌發酵菠蘿加工副產物中總酚含量的影響順序為乳清蛋白添加量(C)>初始pH(B)>加工副產物添加量(A)。根據k1、k2、k3可知,最優發酵配方水平組合為A3B3C2,其總酚含量如表4所示,較優化前提高了2.5倍,三者間存在顯著性差異,可確定最優發酵配方為:菠蘿加工副產物添加量60%、乳清蛋白添加量2.6%、初始pH 5.0。

表4 正交試驗的驗證

2.3 響應面實驗結果

2.3.1 響應面實驗設計與結果

根據單因素結果,進行響應面分析。響應面二次多項式回歸方程的方差分析結果如表5所示?？傻迷撃Ｐ偷腇=17.35,P<0.000 1,表明該模型極顯著;回歸系數R2=0.945 5,表明該模型能較好地對實驗的真實情況進行擬合,自變量與響應值之間的關系顯著,表明該模型可以用來分析與預測菠蘿加工副產物的最佳發酵工藝。由4個因素的F值可得出,各因素對菠蘿加工副產物發酵產品中SOD活力的影響程度為:B(發酵溫度)>A(發酵時間)>C(乳酸菌接種量)>D(發酵菌接種比例)。

表5 回歸模型方差分析

2.3.2 響應面交互分析

根據響應面實驗設計原理,三維曲面彎曲程度越大,表明兩因素交互作用對響應值即SOD活力的影響越顯著。響應面實驗等高線圖為三維曲線在底部的投影,可以反映出因素之間交互相的強弱,為橢圓則表明兩因素之間交互作用顯著,呈圓形則與之相反,結果如圖2所示。

圖2 各因素交互作用對發酵產品中SOD酶活力影響的響應面圖

采用Design-Expert軟件,根據所建立的模型進行參數最優化分析,得到最佳的發酵工藝為發酵時間25.83 h,發酵溫度37.45 ℃,乳酸菌接種量1.6%,發酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.15∶1,在此條件下發酵產物的SOD活力為168.17 U/g。為了驗證實驗結果以便于實際操作,調整發酵工藝為發酵時間26 h,發酵溫度37.5 ℃,乳酸菌接種量1.6%,發酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.2∶1。在此條件下,發酵產物的SOD活力為168.03 U/g,與理論值差異不顯著(P>0.05),表明可利用該模型對菠蘿加工副產物的發酵工藝條件進行優化,具有實際價值。

2.4 發酵產品的理化指標

SOD與總酚是果蔬發酵產品中主要的活性物質。采用最優發酵工藝混菌發酵菠蘿加工副產物-乳清蛋白,將所得發酵產物與其他果蔬發酵產品進行了比較,如表6所示。菠蘿加工副產物-乳清蛋白發酵產品的SOD活力高于發酵菠蘿漿與香蕉酵素,較未發酵菠蘿提高1.95倍,但低于藍莓枸杞發酵果汁與藍靛果-沙棘發酵果汁;其總酚含量高于發酵菠蘿漿與蘋果梨酵素,較未發酵菠蘿提高了2.53倍,但低于草莓酵素、青梅酵素等發酵產品。這可能是由于選取的原料、發酵菌種以及處理方式的不同造成的。

表6 菠蘿加工副產物-乳清蛋白發酵產品與其他果蔬發酵類發酵產品的比較分析

有機酸是發酵產品的主要風味屬性來源,其組成和含量是影響發酵產品酸味的重要因素。由于有機酸具有降低腸道pH值和改善腸道菌群的作用,其在世界范圍內被廣泛應用。表7顯示了菠蘿加工副產物發酵前后7種主要有機酸的變化。與發酵前相比,蘋果酸含量下降了63.49%,這與MENDES 等[21]的研究結果一致,可能是由于蘋果酸在發酵過程中容易被大多數微生物利用引起的;檸檬酸含量從2.91 mg/g下降到2.07 mg/g,可能是由于乳酸菌將檸檬酸作為底物,經過三羧酸循環代謝產生乳酸、雙乙酰或其他物質而引起的[22]。與發酵前相比,總酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸和草酸的含量顯著增加,這與蘿卜腌制前后有機酸的變化趨勢一致[23]。如表7所示,乳酸(4.28 mg/g)和琥珀酸(3.51 mg/g)是發酵產物中的主要有機酸。乳酸通常是由于乳酸菌在發酵過程中產生的[24],而琥珀酸是酵母發酵過程中產生的一種重要代謝產物[25]。

表7 菠蘿加工副產物-乳清蛋白發酵前后有機酸含量的變化

3 結論

本實驗利用從新鮮菠蘿中篩選的乳酸菌與酵母菌發酵添加了乳清蛋白的菠蘿加工副產物,對其發酵配方與發酵工藝進行優化。得到的最佳發酵條件為:菠蘿加工副產物添加量為60%,乳清蛋白添加量為2.6%,初始pH為5.0,發酵時間26 h,發酵溫度37.5 ℃,乳酸菌添加量1.6%、發酵菌接種比例為乳酸菌∶酵母菌=6.2∶1。在此發酵條件下發酵產品中總酚含量為0.81 mg GAE/g,較未發酵前提高了2.53倍;發酵產品中SOD活力為168.02 U/g,較未發酵前提高了1.95倍;總酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸含量較發酵前均顯著提高。本研究為提高菠蘿加工副產物的利用率提供了一定的數據參考。