利用CRISPR/Cas9技術構建MDH2敲除細胞株及抗嘔吐毒素效應研究

施煒濤 姚春鵬 魏文康 王蕾 房元杰 仝鈺潔 馬曉姣 蔣文張曉愛 邵偉

（1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心 廣東省農作物種質資源保存與利用重點實驗室，廣州 510640；3.廣東省農業科學院蔬菜研究所 廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室，廣州 510640）

嘔吐毒素又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），屬于B型單端孢霉烯族毒素，作為一種廣泛存在于谷物和動物飼料以及食品中的真菌毒素，可由禾谷鐮刀菌、亞洲鐮刀菌等多種鐮刀菌產生［1-2］。受到霉菌污染的玉米、小麥、大豆等飼料原料及青貯飼料中均存在不同濃度的DON［3-4］。在對陜西、新疆、甘肅和寧夏4省收獲的小麥進行DON含量及流行率檢測，結果顯示82.9%的樣品受到DON污染，平均濃度達500 μg/kg，根據我國規定的DON標準（中國國家標準GB2761-2017），其中10%的陽性樣品超過1 000 μg/kg的最大限值［1］。對多地的飼料及原料取樣監測分析，其中玉米及其副產品均有不同程度的DON污染［5］。一份對豬飼料樣品的霉菌毒素含量檢測報告顯示，DON在不同品種豬飼料中含量普遍偏高，其中空懷母豬料和育肥料中DON含量高于國家規定［6］。

DON屬于劇毒或中等毒物的范疇，對人和動物具有廣泛的毒性效應，具體表現為嘔吐、炎癥、消化道出血，甚至死亡［7-8］。豬是對DON最敏感的動物之一，其次為小鼠、大鼠、家禽和反芻動物［9］。DON不僅對豬腸道具有局部毒性，而且會導致許多腸道功能失調并削弱免疫反應，減少采食量和體重增加［10］。攝入含DON的飼料時，豬的腸道會出現絨毛頂端壞死、多灶性萎縮和絨毛融合、固有層水腫、腸細胞胞漿空泡化、十二指腸絨毛高度降低和腸道細胞溶解等情況［11］。而當飼料中同時存在嘔吐毒素和其他霉菌毒素如鐮刀菌酸時，相互之間會產生協同和相加效應，混合物整體的毒性增強，出現嘔吐、拒食、生長緩慢等現象［12-16］。

近年來已報道多個與DON毒性有關的基因，王海飛等［16］利用CRISPR/Cas9敲除文庫篩選到THEM5等DON抗性重要候選基因。許寫等［17］通過構建了穩定干擾METTL3基因表達水平的IPEC-J2細胞系，發現降低該基因的表達水平可以抵抗由DON誘發的細胞凋亡和炎癥。Xu等［18］研究報道SLC4A11和MFSD3基因的過表達能夠增強DON處理下IPEC-J2細胞的活力。

蘋果酸脫氫酶2（MDH2）是線粒體中三羧酸循環（TCA）的關鍵酶之一，利用催化H+從蘋果酸的羥基轉移至NAD+上，以實現蘋果酸和草酰乙酸之間的可逆轉化，在乙醛酸旁路、氨基酸合成、糖的發生和氧化/還原平衡等代謝途徑也發揮重要作用。MDH2以二聚體形式存在，單體分子量35.6 kD左右，包含5個NAD+結合位點和1個質子結合位點［19］。已有研究報道MDH2與癌癥有密切聯系，MDH2能夠通過抑制PTEN增強子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲［20］。刺激MDH2能夠激活AKT通路，從而導致非小細胞肺癌（NSCLC）的轉移和侵襲［21］。在前列腺癌細胞中也檢測到MDH2的表達升高［22］。此外，MDH2被確定為是嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤的易感基因［23］。但目前尚未報道MDH2和毒素之間的存在聯系。

前期我們利用CRISPR文庫篩選了嘔吐毒素誘導細胞死亡的相關基因發現，MDH2是候選基因之一。但目前對于MDH2基因對于DON的影響在國內外期刊中并沒有相關報道，因此本研究采用CRISPR/Cas9系統構建豬MDH2基因穩定敲除的IPEC-J2細胞株，并檢測了MDH2基因抗DON毒性效應的影響，為后續深入探究MDH2基因對DON的毒性作用機制奠定基礎。MDH2基因后續可以作為抗DON的靶標，基因敲除或針對該靶標開發相關藥物，可降低DON對腸道細胞的損傷以及對人和動物的毒性，在醫療和畜牧業中具有潛在應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

IPEC-J2細胞系由本研究室保存；嘔吐毒素和二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司；pSpCas9-2A-Puro（PX459）V2.0質粒購自淼靈生物科技有限公司；P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit轉染試劑盒購自Lonza公司；T4連接酶、T4 PNK、10×T4連接緩沖液、限制性核酸內切酶BbsI購自New England Biolabs公司；大腸桿菌E.coliDH 5α感受態細胞購自北京金沙生物科技有限公司；無內毒素質粒提取試劑盒購自天根生物公司；胎牛血清FBS、胰酶、DMEM/F12培養基、嘌呤霉素購自Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Procell公司；通用型RNA提取試劑盒購自艾科瑞生物技術有限公司；一抗Anti-MDH2購自HUABIO公司；Anti-Tubulin購自Cell Signaling Technology公司；二抗Goat Anti-Mouse IgG（H+L）HRP和Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP購自Affinity 公司；動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒購自索萊寶公司；CCK8（cell counting kit-8）試劑盒購自Apexbio公司；YO-PRO-1/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 DMEM/F12完全培養基包含10%FBS和1%雙抗，IPEC-J2細胞接種于25 cm2底面積培養瓶中，放在37℃、5% CO2的細胞培養箱內培養。

1.2.2 DON的配制 用DMSO將DON粉末溶解，用0.22 μm濾膜過濾，配成5 mg/mL母液。再分別用DMEM/F12完全培養基配成濃度分別為4、2、1和0.5 μg/mL的DON溶液，整個過程在生物安全柜中完成。

1.2.3 豬MDH2基因sgRNA的設計 針對豬源MDH2基因（NCBI Gene ID: 397039）使用CRISPR DESIGN（http://crispr.mit.edu）網站進行設計，根據評分選取位于外顯子9126-9203區域的sgRNA。并在sgRNA的5'端添加CACCG，形成正向Oligo DNA（sgRNA-MDH2-F），在反向Oligo DNA（sgRNAMDH2-R）的3'端添加C，在5'端添加AAAC（表1）。

表1 MDH2靶向位點及sgRNA寡核苷酸序列Table 1 MDH2 targeting sites and sgRNA oligonucleotide sequences

1.2.4 豬MDH2基因編輯載體的構建及陽性克隆的篩選 首先將以上正鏈Oligo DNA（sgRNAMDH2-F）和負鏈Oligo DNA（sgRNA-MDH2-R）退火形成dsDNA，反應體系：正負鏈Oligo DNA各1 μL，10×T4 連接緩沖液1 μL，T4 PNK 0.5 μL，補H2O至10 μL，離心后置于PCR反應儀中進行反應（37℃ 30 min；95℃ 5 min）。取退火后形成的dsDNA與PX459載體連接，酶切與連接反應體系：PX459質粒模板25 ng，dsDNA和10×T4連接緩沖液各1 μL，BbsI和T4連接酶各0.5 μL，加入ddH2O補至10 μL體系，各成分離心后置于PCR反應儀中進行反應（37℃ 5 min；23℃ 5 min，25循環）。

放置連接產物和感受態細胞混合物于冰上30 min后42℃水浴熱擊90 s，經過冰浴冷卻5 min后，加入普通的LB液體培養基，置于37℃振蕩培養1 h，使細菌表達質粒編碼的Amp抗性基因并恢復到正常生長狀態；將菌液均勻涂布于含Amp的LB固體培養平板上，將培養皿倒置于37℃培養箱過夜培養。用含Amp的LB液體培養基對挑取的若干單菌落擴大培養，并提取質粒送至生工使用U6啟動子進行測序。

1.2.5 基因編輯載體的轉染及嘌呤霉素的篩選 用DMEM/F12完全培養基培養IPEC-J2細胞，置于37℃、5%的CO2培養箱中培養，待細胞密度達到70%-80%時，用胰酶將細胞消化下來，使用Lonza電轉儀將上述構建的基因編輯載體導入細胞核中。用濃度為4 μg/mL嘌呤霉素的完全培養基連續篩選7 d，每2 d更換新鮮的含嘌呤霉素完全培養基，同時以IPEC-J2細胞作為對照組進行觀察。待對照組完全死亡后用胰酶將存活的混合克隆細胞群消化下來，使用有限稀釋法稀釋成單克隆細胞于96孔板中。

1.2.6 單克隆細胞的篩選 待96孔板中的單克隆細胞團生長至一定數量，轉移至24孔板中進一步擴大培養，再進一步擴大至6孔板中，提取細胞的基因組DNA，設計特異性引物并進行高保真PCR，將PCR產物送至生工進行測序。引物序列請見表2。

表2 MDH2基因PCR測序引物Table 2 Primers for PCR sequencing of MDH2 gene

1.2.7 RT-qPCR檢測細胞中MDH2基因的表達水平 提取野生型IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞的RNA，通過逆轉錄為cDNA，加入到熒光定量PCR 96孔板之中，使用設計的引物進行擴增，94℃預變性30 s；94℃變性5 s、57℃退火15 s、72℃延伸10 s并收集熒光信號，共40個循環。每個樣品設計5復孔，并以β-actin作為參照基因，用相對定量法對結果進行分析。引物序列請見表3。

表3 MDH2基因RT-qPCR引物Table 3 RT-qPCR primers for MDH2 gene

1.2.8 Western Blot檢測細胞中MDH2蛋白的表達水平 將野生型IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞分別培養于六孔板中，等待長滿全孔后棄去培養基，用PBS清洗兩遍后使用細胞裂解液裂解細胞，冰上孵育10 min后離心取上清，加入上樣buffer，100℃煮樣10 min獲得蛋白樣品。對照組和試驗組分別各取15 μg蛋白樣品通過10%的電泳膠進行分離，并轉移至PVDF膜上，使用5%脫脂奶粉溶液室溫封閉后，TBST洗去剩余奶粉，一抗Anti-MDH2（1∶1 000稀釋）于4℃孵育過夜，TBST洗膜4次，每次20 min。用1∶6 000稀釋的二抗Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP與膜在室溫下孵育1 h，TBST洗膜4次，每次20 min。顯影液漂洗后用化學發光儀顯色拍照，以Tubulin為內參蛋白。

1.2.9 MDH2-KO在DON處理后的細胞活力測定 將野生型IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞以每孔2×104的密度接種96孔培養板，待細胞生長到合適密度，每孔加入不同DON濃度的完全培養基。每組加入等量100 μL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON濃度的完全培養基，每組濃度復5孔，充分混勻板中各孔的液體。第3天更換一次含不同濃度DON的完全培養基，并每天觀察細胞狀態，在37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養5 d。

用CCK8試劑測定細胞活力，在96孔板中選取5個無細胞孔，每孔加入100 μL DMEM/F12完全培養基，以獲得背景發光值。向96孔板中有液體的每個孔中加入10 μL CCK8試劑溶液，將96孔板置于37℃細胞培養箱中孵育1 h，酶標儀測量在450 nm處的OD值。

細胞活力計算公式:

細胞活力（%）=（實驗組OD-背景值OD）/（對照組OD-背景值OD）×100%

1.2.10 MDH2-KO在DON處理后細胞死亡率檢測 野生型IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞接種于六孔板培養板中，置于37℃、5%的CO2細胞培養箱內培養。待細胞長到合適密度，每孔更換為等量2 mL含4、2、1、0.5和0 μg/mL DON的完全培養基，第3天更換一次含不同DON濃度的完全培養基，共處理5 d。

將對照組和試驗組貼壁細胞用15%胰酶消化后用完全培養液重懸，并用PBS洗滌一次。對于上一步驟的每個沉淀加入500 μL YP1/PI檢測工作液，并重懸為單細胞懸液。放入37℃培養箱中避光孵育20 min。準備僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制YP1/PI檢測工作液的緩沖液宜保持一致。同時準備YP1和PI的單染樣品用于調節補償。孵育完成后，可以直接進行流式細胞儀檢測（YP1染色陽性細胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509 nm；PI染色陽性細胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617 nm），整個過程均需避光操作。將染色后的樣品置于冰上，并在1 h內進行流式細胞儀檢測和分析。

2 結果

2.1 MDH2基因編輯載體的構建

合成的sgRNA單鏈經退火形成雙鏈，將其與PX459空載體經限制性內切酶BsbI酶切后的線性載體片段連接，構建重組質粒。從載體U6啟動子后開始測序，結果顯示插入PX459載體的堿基序列與設計的sgRNA序列完全一致，表明重組質粒構建成功，測序結果如圖1所示，命名為PX459-sgRNA-MDH2。

圖1 重組質粒PX459-sgRNA-MDH2測序峰圖Fig.1 Sequencing peak of recombinant plasmid PX459-sgRNA-MDH2

2.2 MDH2-KO細胞株的構建與驗證

通過單克隆稀釋和擴大培養，并挑選10株單克隆細胞提取基因組DNA，將通過高保真PCR所得產物送至公司測序。測序結果顯示其中一株為單峰（圖2），且與野生型MDH2基因（圖3）相比缺失5 bp堿基（圖4），這種缺失突變可導致基因開放閱讀框改變、翻譯提前終止。與IPEC-J2野生型細胞株相比，該細胞株的mRNA表達水平顯著降低，且組內mRNA表達水平差異有統計學意義（P＜0.001）。單克隆細胞蛋白樣品的Western blot鑒定結果見圖5-B，與野生型IPEC-J2細胞相比，篩選得到的細胞株中MDH2蛋白表達水平幾乎完全喪失。結合基因組PCR產物測序及Western blot實驗結果，認為該單克隆細胞系中目的基因被完全敲除且為單克隆，命名MDH2-KO。

圖2 MDH2-KO細胞系CRISPR靶位點測序峰圖Fig.2 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2-KO cell line

圖3 MDH2野生型IPEC-J2細胞系CRISPR靶位點測序峰圖Fig.3 Sequencing peaks of CRISPR target sites in MDH2 wild-type IPEC-J2 cell line

圖4 野生型IPEC-J2細胞與MDH2-KO序列比對圖Fig.4 Sequence comparison of wild-type IPEC-J2 cells with MDH2-KO

2.3 MDH2基因的敲除對IPEC-J2抗嘔吐毒素毒性效應的影響

2.3.1 CCK8檢測發現MDH2基因的敲除提高DON處理后的細胞活力 將野生型IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞系分別以每孔2×104的密度接種于96孔培養板中，用嘔吐毒素（4、2、1和0.5 μg/mL）處理5 d后，用CCK8試劑測定細胞活力。發現MDH2-KO細胞系與野生型IPEC-J2細胞相比，在DON濃度為4、2、1和0.5 μg/mL的條件下細胞活力分別極顯著提高18.67%（***P＜ 0.001）、19.59%（***P＜ 0.001）、26.36%（***P＜ 0.001）和27.01%（***P＜ 0.001）（圖6）。表明敲除MDH2基因后可增強IPEC-J2細胞對嘔吐毒素的耐受性。

2.3.2 流式檢測發現MDH2基因的敲除降低DON處理后的細胞死亡率 不同濃度DON對IPEC-J2細胞和MDH2-KO細胞的死亡率影響結果如圖7所示，經過YP1/PI染色和流式細胞儀檢測，正常活細胞為Q4區域（YP1-/PI-），凋亡細胞的細胞核被染為綠色位于Q3區域（YP1+/PI-），壞死細胞的細胞核被染為紅色位于Q1和Q2區域（YP1-/PI+和YP1+/PI+）。與野生型細胞相比，敲除MDH2使不同濃度DON（4、2、1和0.5 μg/mL）作用5 d條件下細胞死亡率分別極顯著降低30.33%（***P＜ 0.001）、15.81%（***P＜ 0.001）、16.00%（***P＜ 0.001）和14.7%（***P＜ 0.001）。表明敲除MDH2基因后可增強IPEC-J2細胞對嘔吐毒素的抗性。

圖7 流式檢測DON處理后IPEC-J2和MDH2-KO的細胞死亡率Fig.7 Flow assay of cell mortality of IPEC-J2 and MDH2-KO after DON treatment

3 討論

本研究表明MDH2在DON誘導的細胞死亡毒性中發揮重要作用。DON毒性機制包括：誘導細胞活性氧（ROS）和活性氮（RNS）積累引起氧化應激及脂質過氧化，破壞DNA結構［24］；促進凋亡蛋白Caspase家族表達引起細胞凋亡［25］；與rRNA結合后激活p38、JNK、ERK1/2、MAPKS等信號通路抑制蛋白質合成影響細胞功能［26］。許多研究發現DON處理后細胞的ROS水平提高，與細胞凋亡和炎癥相關的基因及蛋白表達增加［27-28］。而由DON處理提高的ROS會破壞線粒體膜結構，導致通透性增加，凋亡因子Cyt-c釋放進入細胞質內，并激活下游Caspase凋亡蛋白家族，引發細胞凋亡［29］。此外，DON對前列腺癌細胞的作用與NF-κB/HIF-1α信號轉導有關，并以劑量依賴的方式顯著增加HIF-1α的表達［30］。

MDH2既在能量代謝過程中發揮關鍵作用，也與細胞死亡調控有密切聯系。MDH2作為TCA循環的關鍵酶利用NAD-NADH輔酶系統催化蘋果酸可逆地氧化為草酰乙酸，產生的NADH作為氧化磷酸化的還原當量，是細胞ATP生物合成、耗氧的基本過程，但同時也能為mETC提供電子誘導ROS的產生并啟動細胞死亡過程［31-35］。Zhao等［36］發現敲除MDH2基因能夠顯著降低蘋果酸處理后HeLa細胞中的ROS水平和細胞凋亡，表明MDH2在調節細胞凋亡過程中起著至關重要的作用。Wang等［37］報道了MDH2基因的突變會阻止Caspase-3活化和果蠅幼蟲唾液腺細胞死亡，并導致細胞的ATP水平降低。抑制MDH2可降低腎小管上皮細胞缺氧-復氧狀態下HIF-1α水平和氧化應激，并減少細胞凋亡和鐵性細胞死亡，表明MDH2也可以通過調控HIF-1α相關的信號途徑來調控細胞死亡［38］。

綜上可見，DON與MDH2在調控細胞死亡方面存在共同的信號途徑，本研究揭示了MDH2基因的敲除賦予IPEC-J2細胞抗嘔吐毒素的能力，能減少嘔吐毒素誘導的細胞死亡。我們推測MDH2基因的敲除可能通過降低ROS的水平、抑制Caspase凋亡蛋白和下調HIF-1α的表達，從而減少細胞死亡降低嘔吐毒素對細胞的毒性。而MDH2基因在這些途徑中具體發揮哪些功能還需進一步深入研究。

4 結論

本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功制備出豬MDH2基因敲除的IPEC-J2單克隆細胞系，并通過細胞活力和細胞死亡檢測，證明敲除MDH2基因能使細胞具有抗嘔吐毒素毒性效應的能力。