DNA甲基化在解析毛竹自然變異中的應用

李英 岳祥華

（1.國際竹藤中心竹藤資源基因科學與基因產業化研究所，北京 100102；2.國家林業和草原局 北京市竹藤科學與技術重點開放實驗室，北京 100102； 3.國際竹藤中心三亞研究基地，三亞 572000）

我國是全球竹資源最豐富的國家，竹子種類、竹林面積和蓄積量均居世界之首。毛竹（Phyllostachys edulis）是我國竹類資源中栽培面積最大的竹種，毛竹林則是我國竹林的主要組成部分［1］。根據第九次全國森林資源清查數據顯示，我國毛竹林面積467.78萬hm2，占竹林總面積的72.96%［2］。但是，竹類植物優異種質資源挖掘嚴重不足，基礎研究薄弱，嚴重影響了竹類植物資源的創新應用［3］。

毛竹是禾本科喬灌木，長期處于野生狀態。由于開花周期長且大部分竹種花后很快干枯死亡，毛竹主要通過帶芽的地下莖（也稱“竹鞭”）、竹稈和竹枝等進行無性繁殖［4］。但是，在長期的演化過程中毛竹產生了豐富的自然變異體即突變體，它們大多由當地居民在野生的毛竹林中偶然地發現［5］。很顯然，這些突變體由于體細胞突變所引起；而植物的分化發育是功能基因、調控因子和表觀修飾等共同作用的結果。系統闡釋毛竹自然突變體形成的調控機制不僅是竹類植物生長發育的基礎理論問題，而且對竹子材性改良及竹林生長量提高均具有重要意義。本文綜述了毛竹自然變異研究現狀、植物DNA甲基化及其轉錄調控機制在植物發育過程中的研究進展，并展望了DNA甲基化在解析毛竹自然變異現象的潛在應用。因此，充分利用毛竹豐富的自然突變體材料，運用多領域技術方法聯合分析策略，解析關鍵突變表型或性狀的形成機制，有利于指導竹子精準育種。

1 毛竹自然變異研究進展

目前，中國竹類植物圖鑒中記載了共17種毛竹自然突變體［6］，它們在竹稈形態、顏色和節間形態等多個方面與野生型毛竹有明顯差別，分別是蝶毛竹（P.edulisf.abbreviate）、綠槽毛竹（P.edulisf.bicolor）、麻衣竹（P.edulisf.exaurita）、金絲毛竹（P.edulisf.gracilis）、黃皮毛竹（P.edulisf.holochrysa）、黃皮花毛竹（P.edulisf.huamozhu）、黃槽毛竹（P.edulisf.luteosulcata）、綠皮花毛竹（P.edulisf.nabeshimana）、強竹（P.edulisf.obliquinoda）、梅花竹（P.edulisf.obtusangula）、厚壁毛竹（P.edulisf.pachyloen）、斑毛竹（P.edulisf.porphyrosticta）圣音竹（P.edulisf.tubaeformis）、佛肚毛竹（P.edulisf.ventricosa）、龜甲竹（P.edulisf.Kikko-chiku）、花龜竹（P.edulisf.Mira）和青龍竹（P.edulisf.curviculmis）。其中，綠槽毛竹、綠皮花毛竹、斑毛竹、黃槽毛竹、黃皮花毛竹和黃皮毛竹主要在竿的顏色方面與野生型毛竹存在明顯區別，而蝶毛竹、強竹、梅花竹、圣音竹、佛肚毛竹、龜甲竹、花龜竹、青龍竹和麻衣竹主要在竿的形態方面與野生型毛竹存在明顯區別，至于厚皮毛竹和金絲毛竹主要在竿壁厚度方面與野生型毛竹存在明顯區別。

多位學者就毛竹及其變種的生態學特性［7］、生理生化特性［8］以及出筍規律和鞭根結構［9-10］等進行了研究。據此可以發現，與野生型毛竹相比，自然突變體在組織形態、激素水平以及生態效應等方面存在明顯差異。此外，多名學者運用EST、AFLP和SSR等分子標記技術，開展了野生型毛竹及其變竹的遺傳變異研究［11-12］。近年來，高通量測序技術快速發展。南京林業大學竹類研究所在毛竹和多個自然突變體植株發育早期的筍芽中鑒定到與維管分生組織發育相關的基因，并且它們主要富集在細胞壁構型、植物激素信號轉導等相關過程［13］。作者團隊前期選取野生型毛竹及其壁厚變種厚竹（P.edulisf.pachyloen）不同發育時期的地下筍芽為材料，聯合運用多組學測序技術繪制了毛竹及其變型厚竹的5個不同發育時期筍芽內部基因和miRNA動態表達圖譜，基因共表達趨勢分析結果顯示大部分基因在發育前期存在明顯的折點，并且該折點在厚竹和毛竹樣本中方向相反；有趣的是，野生型毛竹及其突變體表型出現明顯差異也是在這個時期。此外，該研究挖掘了調控筍芽發育的miRNA-mRNA模塊，發現了植物激素細胞分裂素在促進筍芽發育中的關鍵作用，利用雙熒光素酶報告基因技術和RNA FISH等技術驗證了miRNA與靶基因間的靶向調控關系及其在筍芽分生組織中的作用位點［14］。該成果發掘了調控竹子筍芽發育的關鍵遺傳因子，初步闡釋了筍芽組織形態動態變化的分子機理，剖析了毛竹與厚竹表型明顯差異的分子基礎。但是，稈壁增厚這一突變表型發生的原因尚不清楚。目前，毛竹自然變異相關研究局限在資源評價、轉錄組分析，表觀修飾對轉錄調控的效應及其作用機制仍不清楚。

2 DNA甲基化與轉錄調控的相關性

DNA甲基化（methylation）是真核細胞普遍的一種重要的調節基因轉錄表達表觀遺傳修飾方式。DAN 甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA methylthransferases，DNMTs）的作用下，以S-腺苷加硫氨酸（SAM）為供體，將甲基添加到特定堿基的過程［15］；該過程主要發生在胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸CpG中胞嘧啶第五位碳原子上，其產物稱為5-甲基胞嘧啶（5-mC）［16］。5-mC是真核生物DNA甲基化的主要形式，此外還存在N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）和7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。無論在植物還是動物中，CpG部分散在分布于基因組DNA序列中，部分則以高度聚集的CpG島狀態存在于轉錄調控區，如啟動子區。在植物中，DNA甲基化往往發生在對稱序列CG、CHG和非對稱序列CHH（H=A、C或T）中［17］。與基因突變不同，DNA甲基化是一種可逆的化學修飾，目前發現的植物甲基化主要有從頭甲基化（de novomethylation）、維持甲基化（maintenance methylation）和去甲基化（demethylation）3種模式。

以往研究結果顯示DNA甲基化異常往往能夠改變DNA構象、染色質結構和DNA的穩定性，進而抑制相關基因的轉錄調控，導致多種生物學通路的路徑發生改變［18］。研究發現小麥基因啟動子區域的DNA甲基化能夠調控對基因的表達［19］。在某些情況下，啟動子區DNA甲基化非但不抑制基因轉錄，相反會促進基因轉錄，如擬南芥的ROS1基因［20-22］和一些抑制番茄果實成熟的基因［23-24］。最近，北京林業大學油松研究團隊發現油松（Pinus tabuliformis）基因組存在大量高表達的大內含子基因，DNA甲基化修飾在外顯子和內含子區表現出很高的不均衡分布，作者預測DNA甲基化對基因不同區域的差異化轉錄調控發揮了關鍵作用［25］。中國科學院分子植物科學卓越創新中心朱健康研究團隊發現DNA甲基化能夠以多種方式調控基因的表達，并表示DNA甲基化在植物的轉錄調控過程扮演重要角色［26］。此外，研究發現DNA甲基化與組蛋白甲基化間存在協同作用［27-28］，DNA甲基化與組蛋白修飾及非組蛋白共同決定了染色質結構和開放程度，進而調控基因表達、轉座子沉默、染色質互作以及性狀遺傳［29］。當轉錄調控區域的CpG島發生甲基化修飾后，序列特異性甲基化結合蛋白（methyl cytosine binding protein,MeCP）與之結合，隨后組蛋白去乙酰化復合物與MeCP 結合作用于組蛋白使其發生去乙酰化，接著染色體狀態處于緊縮狀態，阻礙了轉錄因子與順式作用元件的結合，導致轉錄過程不能正常啟動，進而時空性調控植物發育調控因子的表達，影響細胞的分化以至關鍵發育過程，最終可能導致植物性狀的畸形［30］。

值得注意的是，研究表明部分非編碼RNA可能調控DNA 甲基化修飾效應。microRNA（miRNA）、long non-coding RNA（lncRNA）、circular RNA（circRNA）等非編碼RNA同樣存在大量的內含子序列［31］，經過剪切能夠形成特異二級結構，并以此行使生物學功能［32-33］。Song等［34］研究發現一類24 nt的miRNA能夠調控毛白楊花發育通絡相關基因的甲基化實現不同轉錄本的差異表達。有趣的是，針對野生型毛竹及其突變體厚竹兩個樣本組間鑒定到的DEmiRs，作者進行了靶基因預測以及功能富集分析，結果顯示這些靶基因主要富集在DNA甲基化和蛋白磷酸化生物學過程。這一發現表明竹子miRNA可能調控相關靶基因的表達，通過甲基化修飾過程，進而調控竹子筍芽組織的分化和發育，為發掘厚竹自然變異形成機制提供了新的視角。植物中DNA甲基化研究仍然主要集中在蛋白編碼區，而對占基因組近90%的非編碼區域尚未系統開展，加之非編碼區域是DNA甲基化修飾的富集區，開展非編碼區域基因序列的DNA甲基化修飾研究有助于全面理解和解析基因的轉錄調控。

3 DNA甲基化是植物發育過程的關鍵因子

植物組織的分化和發育是基因在一定的時間和空間特異性表達的結果。而表觀遺傳修飾能從多個水平上調控基因的表達［17］；并且不同植物不同水平的調控之間相互關聯，構成了一個復雜的表觀遺傳調控網絡。DNA甲基化［35］，作為真核細胞普遍的一種重要的表觀遺傳修飾方式，它能夠在不改變DNA序列的前提下調控基因的表達水平和模式，進而影響植物組織的生長和發育等重要生物過程［36］。在擬南芥中，僅有約5%的基因的啟動子區存在甲基化，對于大多數基因來說DNA甲基化并不調控它們的轉錄，因此大多數DNA甲基化水平的增加或降低并不會導致嚴重的生長和發育缺陷。而作物和林木樹種擁有更大的基因組，基因間區存在較密集的轉座子，同時甲基化水平也較高。例如，Niu等［25］發現中國松基因組的巨大性主要來源于轉座元件，而 DNA甲基化通過抑制轉座元件進一步復制對基因組進行監管。不難看出，轉座子或其他重復序列的甲基化擴散將使得啟動子區的DNA甲基化更為普遍。因此，DNA甲基化在某些作物和林木中作用于基因表達的調控效應比在擬南芥中更加重要，往往導致嚴重的生長和發育缺陷甚至死亡。

Cubas等［37］以花型為兩側對稱的野生型柳穿魚和花型為輻射對稱的突變體為研究材料，通過比較發現Lcyc基因啟動子區在突變體中存在廣泛甲基化，轉錄受到抑制；并且這種甲基化修飾是可遺傳的，可與突變表型共分離。有趣的是，突變體在體細胞發育過程中偶爾會發生表型逆轉，并且這與Lcyc的去甲基化和基因表達的恢復有關。這表明表觀遺傳突變可能在生物表型的遺傳、發育和進化中發揮重要的作用。Ong-Abdullah等［38］發現在油棕體細胞克隆株系中，Karma轉座子剪接位點周圍區域若存在密集的甲基化位點則正常坐果，而低甲基化則預示同源轉化、單性結實和產量驟降。

此外，DNA甲基化在植物生殖器官發育過程發揮重要作用。王子成等［39］發現菊花（Chrysanthemum morifolium）經5-azaC處理后植株的甲基化水平降低，開花時間提前，而其他表型性狀未受影響。此外還發現在亞棉花藥敗育過程中，基因組DNA甲基化程度明顯升高［40］。Walker等［41］發現一種獨特的RNA定向DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation，RdDM）能夠調控擬南芥雄性株系減數分裂細胞中的基因表達；而RdDM活性的缺失導致MPS1基因的錯誤剪接，從而破壞減數分裂。Manning等［42］發現當位于番茄Cnr（Colorless non-ripening）位點的Squamosa-promoter binding protein（SBP）-box基因的啟動子區發生DNA超甲基化突變時，果肉無色，細胞間黏附性大幅下降，抑制了番茄果實的成熟。此外，Wang等［43］發現番茄果實成熟過程中DNA甲基化能夠影響數百個多拷貝的轉錄因子基因的表達水平；并且對于某一多拷貝基因來說，其中一個基因拷貝總是明顯高于或者低于其他拷貝的甲基化程度，作者推測DNA甲基化促進了果實成熟通路轉錄因子基因的趨異進化，并在番茄果實成熟等重要生物過程發揮調控作用。

可以看出，無論是對于有性還是無性繁殖后代來說，DNA甲基化修飾所引起的變異都存在廣泛性和顯著性。研究結果顯示在植物無性繁殖過程中，DNA甲基化的增加或減少都有可能導致可遺傳的表型改變［44］。對于大多數無性繁殖的植物多通過分離具有分生組織的萌蘗、根狀莖、塊莖以及珠芽等營養器官的方式進行，而在頂端分生組織［45］、根尖分生組織［46-47］以及花芽分生組織［48］等細胞中廣泛存在著多種甲基化標記［17］。毛竹竹蔸、竹枝和竹稈上的芽能夠發育成地下部分的竹鞭和地上部分的竹稈等，因此多通過分株、埋枝、移鞭等無性繁殖技術進行繁殖。一旦突變發生在某個分生組織細胞中，很容易產生大量攜帶突變的衍生細胞，進而影響或者徹底改變該組織的形態；或者在分生組織中某些生物過程被異常地激活，進而影響到與之關聯的非分生組織細胞中某些基因的表達調控［26,49］。毛竹基因組大小約為2.0 Gb，其中60%為DNA重復序列［50-51］，轉座元件種類豐富且功能多樣［52-54］。不難看出，雖然毛竹主要進行無性繁殖，但是在長期的進化過程中DNA甲基化很可能通過調控基因表達、轉座子沉默、染色質互作等影響了某些性狀的遺傳和變異。但是，目前基于DNA甲基化的毛竹自然突變體形成的分子機制研究尚沒有報道。

4 DNA甲基化與基因組編輯技術

隨著基因組編輯技術的快速發展，植物表觀基因組的定向修飾研究取得了新成果。中國科學院遺傳與發育生物學研究所曹曉風院士課題組在擬南芥中證實了DNA甲基化抑制胞嘧啶脫氨酶催化的C→T轉換效率，并成功篩選獲得了對甲基化胞嘧啶高效編輯的單堿基編輯器APOBEC3BCtd-nCas9，該蛋白能夠有效編輯擬南芥和水稻中甲基化胞嘧啶，并可對編輯框內多個胞嘧啶實現單個C→T的精準編輯［55］。該團隊的另一研究則基于SunTag-dCas9-TETcd系統，成功構建了一套針對水稻基因組DNA甲基化靶向刪除的表觀編輯體系，成功刪除PRC2復合體關鍵成員OsFIE1基因和逆轉座子Tos17位點DNA甲基化并實現二者異位表達，獲得了一系列不同程度矮化的表觀等位突變體，他們還發現OsFIE1的低甲基化水平和植株矮化表型能夠穩定遺傳并且不依賴外源轉基因載體［56］。該研究首次在禾本科作物中建立了表觀編輯體系，為竹類植物的遺傳改良提供了新的工具和思路。

然而，目前竹子遺傳轉化體系尚不成熟，胚性愈傷組織誘導率低、遺傳轉化效率較低仍是竹子遺傳改良研究面臨的瓶頸問題，在竹類植物研究領域尚未見定點DNA 甲基化修飾研究的相關報道。因此，今后應致力于高效再生體系的建立，構建病毒基因載體［57］、納米基因載體［58］等介導的遺傳轉化體系，同時聯合經典遺傳學和CRISPR/Cas9的方法，利用基因組編輯技術對植物基因組進行定點或者多位點的DNA甲基化修飾，這將為闡述具有DNA甲基化位點調控基因表達的分子機制奠定基礎，對于植物組織分化發育過程表觀轉錄調控功能的精確解析具有重要意義。

5 總結與展望

毛竹自然變異形成過程調控機制復雜，涉及生理生化指標、基因表達、轉錄調控以及DNA甲基化修飾等多層次、多因子的作用，這為系統闡述毛竹自然變異形成的分子調控機制提供了大量有價值的信息。但是過去的研究尚存在以下不足：（1）先前的研究主要集中在竹子材性品質形成，快速高生長和開花調控方面，而對自然突變體這一優異種質資源挖掘嚴重不足、基礎研究滯后；（2）DNA甲基化已被證實在體細胞突變等自然變異過程發揮重要作用，但是，針對毛竹自然變異的DNA甲基化效應研究尚屬空白；（3）現有研究主要集中于基因組DNA甲基化水平與基因表達量的相關性分析，而DNA甲基化影響基因轉錄的分子機制尚不明確；（4）重要的是，如何有效運用經典遺傳學和CRISPR/dCas9體系探索DNA甲基化修飾對候選基因表達調控的分子機制一直是植物分子生物學研究領域的熱點和難點。

竹子在保障木材安全、加速生態文明建設和助力鄉村振興等領域發揮重要作用，但基礎研究相對薄弱；相對于其他竹種，毛竹的遺傳背景和基因組信息比較豐富，是基礎研究中非常有價值的研究材料。以毛竹及其突變體樣本為材料，明確野生型及其突變體在形態、生理生化指標以及DNA甲基化模式方面的變異規律，并分析其相關性；解釋DNA甲基化在組織分化和發育過程中的轉錄調控作用；利用基因組編輯技術，解析DNA甲基化在轉錄調控過程中的分子生物學功能。以上研究將為禾本科特別是竹類植物精準育種提供理論指導與技術支持。