單細胞水平解析人牙齦間充質干細胞異質性

吳昊 劉紫微 鄭穎 戴雅文 時權

（解放軍總醫院第一醫學中心口腔科，北京 100853）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的優良生物學特性給人類疾病治療帶來了新希望，顯現出巨大應用潛力。但越來越多的研究證實MSCs內部具有異質性，常規群體水平的測序分析往往無法反映MSCs最真實的特征［1］。而缺乏對MSCs功能異質性的全面了解，嚴重阻礙了MSCs有效的、可復制的臨床應用［2］。單細胞測序技術是在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序，利用生物信息學分析，挖掘單細胞水平基因組的生物學意義，揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性，在發掘新的疾病診斷標志物、分辨細胞亞型、差異基因等方面具有獨特的優勢［3-4］，為探究MSCs內部的功能異質性提供了可能［5］。

牙齦干細胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）是從牙齦固有層中提取的間充質干細胞［6］，其不但容易獲得、來源豐富，而且具有良好的生物學功能，在組織工程、再生醫學、免疫疾病治療方面展現了較好的應用前景［7］。本研究擬分離培養人GMSCs，利用單細胞轉錄組測序（single cell RNA sequencing, scRNA-seq）技術對GMSCs進行分析，從微觀角度分析GMSCs內部的功能異質性，為GMSCs的精準化應用提供理論與實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 細胞培養皿、離心管（NEST，中國）；α-MEM、胎牛血清（GIBCO，美國）；Dispase、IV膠原酶、胰蛋白酶（Sigma，美國）；PBS（碧云天，中國）；CCK-8（同仁，日本）;CD73-PE、CD29-APC、CD90-FITC、CD105-APC、CD31-PE、HLA-DRFITC抗體（BD Biosciences，美國）、臺盼藍（碧云天，中國）；10×Genomics Single Cell 3'v3試劑盒（10×Genomics公司，美國）。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡（Nikon，日本）；酶標儀（Thermo Fisher，美國）；流式細胞儀（BD Biosciences，美國）； 10×Genomics測序儀（10×Genomics公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 GMSCs分離培養及鑒定 人牙齦組織來自我院口腔科接受智齒拔除術、阻生尖牙導萌術的患者。患者既往體健，無傳染病、慢性病、牙周疾病，牙齦組織經患者同意后獲得，臨床實驗標本的獲得經過解放軍總醫院倫理委員會批準。根據本課題前期的方法提取人GMSCs［8-10］，簡要步驟為：獲得牙齦組織立即至于含4×雙抗的α-MEM培養基中并轉移至超凈工作臺，PBS漂洗3-5次后放在2 mg/mL的Dispase酶中4℃消化12 h。隨后分離牙齦，收集固有層皮片剪碎，IV型膠原酶37℃消化1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清。將細胞重懸后至于10 cm細胞培養皿中，用含10% FBS、2×雙抗、2 mol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培養基中，37℃、5% CO2的環境下培養。6 h后棄除原培養基及未貼壁的細胞，加入新鮮培養基繼續培養。細胞匯合率達80%時，1∶4傳代培養。取P3代GMSCs，消化離心后PBS重懸細胞，調整細胞密度為1×106個/mL，流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD90、CD73、CD29、CD105、CD31、HLA-DR。將GMSCs按2×103/孔的密度接種96孔板，CCK-8法測定GMSCs增殖曲線。

1.2.2 單細胞測序樣本制備 取生長良好的P3代GMSCs，用PBS洗滌2遍，加入0.125%無EDTA胰酶消化細胞，離心、棄上清，PBS重懸細胞制成單細胞懸液，取10 μL的細胞懸液與90 μL 0.4%臺盤藍溶液混合，細胞計數，要求單細胞懸液細胞存活率在95%以上，細胞濃度700-1 200 cells/μL，細胞總量不少于5×105，無明顯的結團現象，用于建立單細胞轉錄本文庫。參照10×Genomics平臺操作流程及要求制備單細胞微滴并建立文庫，進行單細胞轉錄組測序。

1.2.3 數據分析 高通量測序中產生的原始數據文件經CASAVA堿基識別轉化為測序讀段（sequenced reads）。使用Fast QC軟件對原始數據進行質量控制評估。采用Cell Ranger對原始數據進行數據質量統計和比對參考基因組，對高通量單細胞轉錄組進行定量，獲得高質量細胞數、基因中位值、測序飽和度等質量控制統計信息。

應用Cell Ranger Seurat軟件對細胞進行聚類和分群；利用CellCycleScore函數對細胞進行G1、S和G2/M分期、細胞周期狀態推斷；應用Seurat中的VlnPlot函數對GMSCs表面標記物、成骨、成軟骨等相關基因表達水平進行分析；應用FindAllMarkers函數獲得GMSCs細胞亞群的差異表達基因，并對各亞群的標記基因進行GO通路富集分析。CellPhoneDB分析各個亞群之間受體配體的互作關系情況。

2 結果

2.1 GMSCs觀察與鑒定

本研究中提取到的人GMSCs呈旋渦狀貼壁生長，為長梭形、多邊形（圖1-A）。體外培養的GMSCs生長旺盛，增殖趨勢呈“S”型（圖1-B）。流式細胞儀檢測GMSCs陽性表達CD73、CD90、CD105、CD29，陰性表達CD31、HLA-DR（圖1-C）。

圖1 GMSCs培養與鑒定Fig.1 Culture and identification of GMSCs

2.2 單細胞測序數據質量

根據圖2中的基因數和線粒體數分別設置過濾參數及閾值，過濾掉多重細胞、基因數小于200以及線粒體基因比例大于20%的低質量細胞，共獲取了9 842個高質量的單細胞測序數據，每個細胞基因檢測數中位數為4 245，細胞中的Fraction reads為91.3%。

圖2 數據總體質量Fig.2 Overall data quality

2.3 GMSCs細胞亞群分析

t-SNE可視化結果顯示GMSCs包含9個細胞亞群，但每個細胞亞群包含的細胞數不同（圖3-A）。如圖3-B所示，在單細胞水平分析GMSCs的細胞表型結果表明，GMSCs高表達ENG（CD105）、NT5E（CD73）、THY1（CD90）、ITGB1（CD29）和CD44，陰性表達CD34、CD14、PTPRC（CD45）及PECAM1（CD31）。

圖3 單細胞測序分析GMSCs功能亞群與標記物Fig.3 Single cell sequencing analysis of functional clusters and markers of GMSCs

2.4 GMSCs亞群增殖異質性分析

CellCycleScore函數對所有細胞進行G1、S、G2/M細胞周期狀態分析（圖4-A），結果顯示GMSCs總體G2/M期所占比例為41.59%；亞群1、3、5、6、7、8、9的G2/M比例最低，提示這些亞群內的細胞大多處于靜止期，細胞增殖能力低，其中亞群6的G2M期比例最低為16.44%；而亞群2（99.08%）、亞群4（78.93%）的G2/M期細胞所占比例明顯高于其它亞群，提示這些細胞大多處于分裂期，細胞增殖能力強。以上結果提示GMSCs包含的9個細胞亞群具有增殖的異質性。

圖4 GMSCs亞群細胞周期與三系分化基因表達分析Fig.4 Analysis of cell cycle and three-line differentiation gene expression in GMSCs clusters

2.5 GMSCs多向分化能力異質性分析

GMSCs的9個細胞亞群表達三系分化的基因差異結果顯示，成脂、成軟骨、成骨相關的基因表達在9個細胞亞群中的表達不完全相同（圖4-B-D）。其中，亞群7的相關基因表達與其余亞群具有較大不同，在本研究展示的基因中，其只高表達成脂相關基因CAV1與CD81。成軟骨相關基因在亞群9僅MEG3高表達。

2.6 GMSCs亞群差異表達基因分析

9個亞群具有不同的基因表達譜（圖5），對top表達的marker基因分析顯示，亞群2/4具有較高的相似性，相對高表達TOP2A、UBE2C、KPNA2、CENPF等基因；亞群3/6具有較高相似性，高表達HIST1H4C、HIST1H1B、CLSPN等基因；亞群5高表達DKK1、KRT7、ID1等基因；亞群9高表達MALAT1、FN1、NEAT1等基因。對不同亞群的基因進行GO通路富集分析（圖6），亞群2/4主要與細胞分裂相關，亞群3與ATP代謝、鈣黏著蛋白附著、蛋白絲氨酸激酶活性相關，亞群5主要與胞外基質組成、氧化應激反應、腺體發育相關，亞群6主要與G蛋白偶聯受體結合、受體配體活性、信號受體激活相關，亞群7/9與細胞黏附、胞外基質組成相關，亞群8主要與胞外囊泡形成和分泌相關。

圖5 GMSCs亞群差異表達top基因heatmap圖Fig.5 Heatmap of differentially expressed top genes in GMSCs clusters

圖6 GMSCs亞群差異基因 GO 通路富集分析Fig.6 Analysis of GO pathway enrichment of GMSCs clusters differential genes

2.7 GMSCs各亞群之間受體配體互作情況

如圖7-A所示，在GMSCs各亞群中，亞群9與其他亞群間的通訊最為活躍，進一步分析亞群9和其他亞群的受配體對相互作用，結果顯示其與亞群1-7在PROS1/AXL受體配體對的相互作用均較強，且亞群9與亞群7在多個受體配體對中均顯示了較強的作用，涵蓋了WNT通路、轉化生長因子及胞外基質等相關的受體配體對，如WNT5A/FZD2、TGF-β1/TGFbR2、NOTCH2/IL-24等（圖7-B）。

圖7 GMSCs各亞群之間受體配體互作情況Fig.7 Interactions of receptors and ligands between different clusters of GMSCs

3 討論

MSCs具有多種優良的特性，在組織工程、疾病治療等方面被寄予厚望。但是進一步研究發現MSCs治療疾病的效果存在差異性［1,11］，嚴重影響了MSCs的臨床轉化應用，造成這種現狀的原因之一可能是MSCs內部的功能異質性。因此，深入分析MSCs內部的功能異質性，提高對MSCs細胞亞群的認識對MSCs的精準與有效應用具有重要的意義。本研究利用scRNA-seq技術，首次對GMSCs的異質性進行分析。

本研究成功提取了人GMSCs，目前GMSCs的分離與培養方法比較成熟，本課題組前期已經利用相同的方法提取到GMSCs并從形態、表面標記物、多向分化等方面進行了鑒定［8-10］，本文中的鑒定結果與前期結果相一致。單細胞分析顯示GMSCs內部具有9個功能亞群，這些亞群在細胞增殖能力、多向分化能力等方面具有異質性。對GMSCs細胞亞群的表面標記物基因分析結果與常規的流式細胞儀檢測結果相同。既往研究顯示GMSCs具有較強增殖能力，且這種能力高于骨髓干細胞、牙周膜干細胞［12-13］。本研究中對細胞周期檢測顯示，GMSCs的G2/M期占比為41.59%，高于經單細胞測序研究的人羊水間充質干細胞［14］、臍帶間充質干細胞［15］等，與既往關于GMSCs增殖能力的研究結果相一致。但GMSCs各個亞群的具體比例不同，尤其是亞群2、4，具有高于其他亞群的G2/M期比例，說明GMSCs內部存在增殖異質性。

GMSCs的多向分化能力已經被證實［6］，我們前期研究也證實GMSCs在體外可以向成脂、成骨、成軟骨向分化［8-10］。本研究對GMSCs單細胞測序分析顯示GMSCs亞群多向分化能力具有異質性，其各細胞亞群相關基因的表達量有差異。這與鄭瑞婷等［14］的研究一致。此外，我們的研究顯示GMSCs亞群7的基因表達情況與其余亞群具有較大差異，可能是一類特殊的細胞群，尚需進一步研究。

細胞通訊分析可以了解細胞與細胞之間的互作關系，解析細胞間通信網絡，揭示發育過程中各類細胞的相互作用、挖掘疾病潛在的治療靶點等。本研究中發現GMSCs亞群9與其他亞群間的通訊非常活躍，因此，進一步分析了亞群9和其他所有亞群的受體配體對相互作用，結果顯示其與亞群1-7在PROS1/AXL受配體相互作用均較強，且亞群9與亞群7在多個受體配體對中均作用較強，這些結果提示我們有必要針對亞群9及PROS1/AXL受配體在其中的作用深入探討，以明確其中潛在的生物學特性與作用。

對各個亞群表達的基因分析顯示，不同亞群的細胞基因表達譜、富集的生物學通路具有差異性。例如亞群2/4高表達細胞增殖相關的基因TOP2A、UBE2C、KPNA2等，GO通路富集分析也顯示亞群2/4主要與細胞分裂相關，這與對GMSCs亞群細胞周期分析的結果相一致。本研究與目前關于MSCs功能異質性的研究相類似［16-17］，這些研究結果都證明了在MSCs內部的功能異質性及其可能的生物學基礎，同時也提示需要對MSCs的內部異質性進行深入分析才能獲得需要的MSCs功能亞群及生物學作用，從而實現臨床的精準應用。

本研究為后續進一步研究GMSCs的生物學特征以及相關的機制提供了研究基礎。但本研究也有一定的局限性，雖然初步分析了GMSCs亞群的異質性，但為了對GMSCs的功能亞群進行精準定義，需要進一步對各個亞群的具體功能及對應的表面標記物進行確定，才能為GMSCs功能亞群的分選及精準應用提供參考。

4 結論

本研究基于單細胞水平分析了GMSCs的異質性，證實了GMSCs存在不同的功能亞群，且各個亞群的基因組表達譜、增殖能力存在差異性，即GMSCs具有功能異質性、增殖能力的異質性，需進一步研究各亞群的生物學特性為GMSCs精準應用奠定基礎。