淬滅酶對亞硝化-混合自養脫氮系統的影響

陳娜，張肖靜，張楠，馬冰冰，張涵，楊浩潔，張宏忠

（鄭州輕工業大學材料與化學工程學院，環境污染治理與生態修復河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

目前脫氮仍是污水處理領域的研究重點，特別是低碳氮比（C/N）條件下的高效脫氮問題仍亟待解決。傳統的硝化反硝化工藝因受碳源不足的影響，脫氮效率嚴重下降[1]。自養脫氮技術作為一種新型脫氮技術，可在低氧環境和無需有機碳源的條件下，實現脫氮[2]。據不完全統計，我國大約有65%以上的污水處理廠存在進水碳源不足的現象，針對于此，基于厭氧氨氧化的自養脫氮技術表現出明顯優勢[3]。由于自養脫氮系統中缺乏有機質，且系統污泥齡較長，因此系統中在伴隨大量微生物凋亡釋放出原生質時，易誘導內源反硝化的產生；另一方面在厭氧或缺氧條件下，部分微生物能夠吸收揮發性脂肪酸將其轉化為內部儲能物質，外部碳源不足時可分解胞內聚合物進行內源反硝化[4-7]。因此，本研究建立了亞硝化-混合自養脫氮工藝（厭氧氨氧化和內源反硝化），用于處理低C/N 廢水。據報道，亞硝化菌、反硝化菌及厭氧氨氧化菌均具有群體感應性能[8-10]，因此，該工藝極有可能受到群體感應的影響。

群體感應是微生物間的通信機制，通過釋放信號分子調控微生物的基因表達、胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）的 分 泌、生物膜的形成和蛋白酶的合成等[11]。群體淬滅則是群體感應的反過程。群體感應淬滅酶可以分解微生物之間用于交流的信號分子，從而使群體感應減弱或失效。目前研究較多的淬滅酶主要是酰基高絲氨酸內酯（acyl homoserine lactone，AHLs）介導的群體感應淬滅酶，包括AHLs-內酯酶、AHLs-酰基轉移酶以及AHLs-氧化還原酶。2009 年，Yeon 等[12]首次將酰基轉移酶應用于污水深度處理的膜生物反應器（membrane bioreactor，MBR）中，發現AHL-酰基轉移酶能使AHLs類信號分子淬滅，從而防止生物膜的產生，減緩膜污染。隨后，Kim 等[13]通過壓力作用直接將酰基轉移酶固定在膜組件上，發現能夠顯著抑制生物膜生長，有效緩解了膜堵塞現象。在此背景下，相關研究也不斷拓寬，如崔雪燕[9]通過研究酰基轉移酶對菌株反硝化的影響，發現20mg/L 的淬滅酶對菌株生長并未造成影響，但對反硝化過程具有明顯的促進作用。但這類研究大多關注微生物菌株的變化或者膜污染控制方面，未對反應系統的脫氮性能變化進行深入探究。

因此，本文以亞硝化-混合自養脫氮系統為研究對象，跟蹤分析群體感應淬滅酶-AHLs 酰基轉移酶對反應體系脫氮性能、EPS、溶解性微生物產物（soluble microbial products，SMP）的分泌、關鍵酶活和微生物群落的影響，探究淬滅酶對亞硝化-混合自養脫氮工藝的調控作用，以期為低C/N廢水的高效低耗處理提供理論支持，并為生物脫氮處理技術提供新的探索途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗設置

本研究接種污泥采用培養良好的MBR 反應器中的自養脫氮活性污泥。該MBR 已經在實驗室運行兩年以上，在進行本文實驗之前，MBR 的水力停留時間為18h，除了每天取樣帶走的泥量，沒有額外排泥，膜組件也保證了所有污泥被截留在反應器中。因此，該MBR 中存在大量死亡微生物殘體釋放的SMP，進而為內源反硝化提供了碳源[14]。該反應器中氨氮的氧化主要以亞硝化為主，總氮去除以亞硝化-內源反硝化為主，同時含有微量的厭氧氨氧化過程，但并未檢測到厭氧氨氧化菌。接種污泥的總氮去除負荷約為0.2kg/(m3·d)，混合液懸浮固體（mixed liquor suspended solids，MLSS）的質量濃度為10g/L。

將接種污泥混勻后等分至2個血清瓶中，分別命名為R1 和R2，R1 作為空白對照不加淬滅酶，R2中加入2μmol/L的淬滅酶，其他運行條件完全相同。兩個反應器置于搖床，每天于150r/min條件下避光反應18h，整個實驗運行30d。每個周期設置如下：進水5min，反應18h，靜置0.5h，換水5min，換水比控制在70%，剩余時間靜置。具體運行參數見表1。

表1 各反應器運行條件和平均進水水質

淬滅酶為酰基轉移酶Ⅰ（C30H34Cl2N4O），酶活力為500～1500U/mg，美國Sigma 公司產，淬滅酶在投加時先溶于甲醇中配成濃度為1g/L 的儲備溶液，再把溶液加入反應器中。因此空白對照組R1中各周期也添加了相同量的甲醇，以保證實驗的單一變量。實驗用水采用人工配置的模擬廢水，(NH4)2SO4用于提供氨氮，NaHCO3用于提供堿度。各周期始末測定pH、T和DO，并取水樣測定反應前后氨氮、亞氮、硝氮的濃度。整個實驗結束后，取污泥樣品用于測定EPS、SMP、關鍵酶活力和微生物群落結構。

1.2 水質指標測定方法

兩個反應器進出水氨氮、亞氮和硝氮分別采用納氏試劑分光光度法、N-1-萘基乙二胺分光光度法和紫外分光光度法測定[15]，pH、DO 和T采用便攜式多參數水質分析儀（德國WTW）測定，MLSS含量采用稱重法測定。總氮去除率（total nitrogen removal efficiency，TNRE）、氨氮去除率（ammonia removal efficiency，ARE）分別按照式(1)和式(2)計算。

1.3 EPS和SMP的測定

取5mL 污泥混合液，在8000r/min 下離心15min，上清液用于測定SMP。用pH 為7.0 磷酸緩沖溶液將剩余泥樣稀釋至原體積，超聲3min 后于水浴鍋中80℃條件下，將樣品加熱30min，每隔10min 搖勻1 次。冷卻后，在8000r/min 下離心15min，所得上清液用于EPS 的測定，SMP 和EPS中蛋白質和多糖的含量分別采用福林-酚法和蒽酮法測定[16]。

1.4 HAO和Heme-c的測定

取混合均勻的泥水混合液，在4℃、4000r/min條件下離心3min，棄去上清液并用緩沖溶液清洗定容至原體積，再重復上述步驟兩次。采用細胞破碎儀進行細胞破碎，隨后離心30min，得到的上清液即為粗酶液。羥胺氧化還原酶（hydroxylamine oxidoreductase，HAO）活性的測定如下：先取4mL反應混合液（1mmol/L 鐵氰化鉀和1mmol/L 鹽酸羥胺），再加入適量粗酶液并立即搖勻。隨后在25°C下反應15min后，加入2mL HCl 溶液終止反應，室溫放置5min 后于400nm 處測吸光度；空白組則先加入終止劑，再加入粗酶液。HAO 活性按照式(3)計算。

式中，A400為400nm處的吸光度；VL為測定液體積，mL；B為稀釋倍數；ε為吸光系數，L/(mol·cm)；b為比色皿寬度，cm；t為時間，min；V為粗酶液體積，mL；m為測定時的泥重，g。

Heme-c 的測定如下：向離心管中先加入1mL（體積分數為40%的吡啶和200mmol/L的氫氧化鈉）混合溶液，再加入適量的粗酶液混勻。將混合液加入到比色皿中，再加入3mg的連二亞硫酸鈉，此過程需在1min內于波長500～600nm范圍內進行光譜掃描[17]。Heme-c含量按照式(4)進行計算。

式中，A500、A535為500nm 和535nm 處的吸光度的差值；m為測定時加入粗酶液所對應的泥重，g。

1.5 高通量測序

用Qubit2.0 DNA 檢測試劑盒（Sangon 公司，中國）檢測樣品的DNA。采用高通量焦磷酸測序，使用V3-V4 高變區域的通用PCR 引物341F/805R （341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；805R：GACTACHVGGG-TATCTAATCC）進行擴增，高通量焦磷酸測序使用MiSeq測序平臺進行分析。所得序列與Silva數據庫中的微生物進行了比較。

2 結果與討論

2.1 淬滅酶對自養脫氮性能的影響

圖1反映了兩個反應器進出水中氮素含量及脫氮性能的變化情況。R1僅加入等量甲醇作為對照，R2 中加入了2μmol/L 的淬滅酶。R1、R2 反應器平均進水氨氮濃度分別為168.0mg/L、171.7mg/L。

圖1 淬滅酶對反應器脫氮性能的影響

在R1 中，以每5 個周期為一個階段取平均值進行脫氮性能分析，反應器的脫氮性能呈先升高后降低的趨勢。其中前兩階段出水氨氮濃度從35.3mg/L 降低至23.2mg/L，ARE 由80.4%升高至86.1%，TNRE由59.9%升高至61.9%。隨后反應器各階段出水氨氮和亞氮濃度不斷升高，兩者最終穩定在56.0mg/L 和47.5mg/L，出水硝氮含量不斷降低，最終降至9.0mg/L；各階段ARE 由80.3%升高至86.1%，后不斷下降至67.2%，TNRE由59.9%升高至61.9%，后不斷下降至37.4%。隨著反應的進行，反應器中氨氮的升高和亞氮的積累可能是自養脫氮微生物無法適應新環境，導致反應器污泥活性下降。最終ARE 由80.3%下降至67.2%，TNRE 由59.9% 下降至37.4%，兩者的下降幅度分別為13.1%和22.5%。根據進出水氮素濃度變化規律、較高的ARE和較低的TNRE，可以推測反應器中大部分的亞氮都由好氧氨氮氧化生成，由于兩組反應器DO 均小于0.05mg/L，因此反應器中基本不存在硝化過程。由于兩個反應器中都存在亞硝化過程，氨氮和亞氮的共存為厭氧氨氧化提供了反應的底物，因此這表明反應器中存在厭氧氨氧化過程，故反應器中大部分的硝氮主要來源于厭氧氨氧化過程，則反應器中的總氮主要依靠亞硝化-內源反硝化和少量厭氧氨氧化共同去除。

R2 反應器中加入2μmol/L 的淬滅酶，與R1 進行相同分析，反應器脫氮性能呈現不斷下降趨勢。其中前兩個階段出水氨氮由最初的34.7mg/L降低至31.5mg/L，ARE 由80.8%升高至81.9%。隨后反應器各階段出水氨氮和亞氮濃度不斷升高，兩者最終穩定在61.4mg/L和66.5mg/L，出水硝氮含量不斷降低，最終降至4.2mg/L；各階段脫氮性能ARE 由80.8%升高至81.9%，后不斷下降至64.4%，TNRE由51.5%不斷下降至26.4%，兩者最終的下降幅度分別為16.4%和25.1%。

結合圖1兩組反應器各階段氮素變化和脫氮性能的變化可知，R2 內出現了明顯的亞氮積累，各階段出水亞氮均高出R1 約19.0mg/L。阮心怡等[18]研究淬滅酶對菌株P.aeruginosa反硝化的影響結果表明，群體淬滅對提升菌株反硝化作用具有促進作用，這表明淬滅酶的加入具有促進R2 反硝化作用的可能。值得注意的是，R2各階段ARE比R1略有降低，且出水硝氮略低于R1，各階段TNRE 比R1平均低11.1%，這說明淬滅酶在強化亞硝化的同時，厭氧氨氧化過程受到抑制，不能及時消耗氨氮和亞氮，從而導致氨氮去除下降以及亞氮的積累。張肖靜等[19]研究群體感應淬滅酶對MBR-CANON系統脫氮的影響，發現淬滅酶抑制了亞硝化和厭氧氨氧化。這一結果與本研究略有不同，可能是兩個反應系統內微生物組成的不同以及淬滅酶濃度的較大差異造成的。另一方面，相關研究[9]表明，向原本含有外源信號分子的系統中加入20mg/L 的豬腎酰化酶后，厭氧反硝化作用被顯著促進，但實驗中各菌株亞氮積累量均較低。本文則主要表現為亞氮的積累，分析原因可能是：上述研究中反應系統含有充足的碳源，而本研究為自養系統，溶解淬滅酶的微量甲醇及內源碳源SMP 等并不足以使硝氮轉化為氮氣，而是停留在亞氮階段造成亞氮積累，即短程反硝化得到強化。

2.2 淬滅酶對污泥性能的影響

EPS為微生物的主要代謝產物，其分泌為微生物抵御外界環境的一種保護機制，SMP則主要與微生物的凋亡有關[20]。圖2 反映了反應器中EPS 和SMP 含量的變化情況。經過長期運行后，R1 的EPS 中蛋白質和多糖分別為45.2mg/g 和10.2mg/g，R2 的EPS 中蛋白質和多糖則分別為32.1mg/g 和5.2mg/g。與R1 相比，向反應器中投加2μmol/L 淬滅酶后，EPS 總含量由55.4mg/g 降低為37.2mg/g，原因是微生物之間會通過群感效應機制分泌大量的EPS或其他代謝產物，從而形成穩定的生物膜結構以幫助細菌向固體表面附著[21]。淬滅酶則會降解群體感應信號分子，抑制群感效應，從而降低微生物EPS的分泌。另一方面研究表明Metagenome是主要的EPS 產生菌和AHLs 類信號分子的產生菌[22]。值得注意的是，本研究向R2反應器中加入淬滅酶后，Metagenome菌屬相對豐度由2.19%減少至1.46%，因此Metagenome菌屬的減少直接降低了系統中EPS的含量；另一方面Metagenome菌屬的減少限制了AHLs 類信號分子的產生，從而減弱了群體感應，最終表現為EPS的降低。

圖2 長期作用后兩個反應器中EPS和SMP的變化情況

R1 的SMP 中蛋白質和多糖的含量分別為44.8mg/L 和22.5mg/L，R2 的SMP 中蛋白質和多糖的含量分別為73.9mg/L和10.5mg/L，可以看出淬滅酶的加入使得反應器中SMP 的含量由67.3mg/L 升高為84.4mg/L，這表明淬滅酶的加入使得部分微生物凋亡，這與R2 中微生物豐富度和多樣性降低的結果相一致。值得注意的是，淬滅酶的加入使得蛋白質含量明顯升高、多糖含量明顯降低，這表明淬滅酶使得SMP 的組成發生了變化。另一方面，相關研究表明[23]，在厭氧和缺乏外源營養物質條件下，反硝化菌可以利用SMP作為碳源進行反硝化。可以看出，R2 反應器中EPS 和SMP 類有機質含量低于R1，可能是淬滅酶誘導了反硝化菌的增殖，從而消耗有機質促進了內源反硝化。但由于外源有機質的缺乏和反硝化菌對內源有機質利用率有限，因此致使短程內源反硝化的發生，從而造成了亞氮積累，最終反應器脫氮性能降低，該結論和2.1 節脫氮過程的分析結果一致。

2.3 淬滅酶對關鍵酶活的影響

HAO 為生物脫氮過程的關鍵酶，其在硝化、反硝化以及厭氧氨氧化過程中均發揮著重要作用[24]。一方面亞硝化菌的HAO 能將羥胺進一步氧化成亞硝酸鹽，從而完成亞硝化，推動硝化作用；另一方面，異養反硝化菌的HAO 在氧化羥胺時產生一部分電子還原亞硝酸鹽，從而促進反硝化過程[25]。如圖3(a)所示，在R1中HAO酶活為0.80EU/g，在加入2μmol/L 淬滅酶的R2 中，HAO 酶活增高為0.99EU/g。這說明淬滅酶的加入促進了HAO 酶活，結合2.1節系統脫氮性能和脫氮途徑的分析，R2出水氨氮升高、硝氮降低以及亞氮積累，都表明系統亞硝化和短程內源反硝化增強，因此HAO 的增加與上述兩種反應過程的強化密切相關。

圖3 長期作用后兩個反應器中HAO和Heme-c的變化情況

Heme-c是厭氧氨氧化菌的特征色素[26]。圖3(b)反映了反應器內Heme-c的變化情況，R1中Heme-c的含量為0.002mmol/g，R2 中Heme-c 的含量為0.004mmol/g。相較于R1，淬滅酶的加入提高了Heme-c 的含量。有研究[27]表明Heme-c 含量增加，可能是厭氧氨氧化菌受到抑制后的應激反應，通過分泌更多的Heme-c以應對外部環境沖擊。結合R2中厭氧氨氧化受到抑制以及總氮去除下降的結果可知，淬滅酶的加入誘導厭氧氨氧化菌分泌更多的Heme-c 以抵抗其抑制。另一方面，據報道[28]，亞氮本身對微生物有毒害作用，出水亞硝酸鹽濃度為70mg/L 即可達到半抑制效果。R2 出水亞氮高達66.5mg/L，足以抑制厭氧氨氧化菌的活性，而微生物活性的降低又會反過來促進亞氮的積累。淬滅酶的抑制作用和亞氮的毒害作用相結合，是否會產生聯合毒害作用，從而影響脫氮性能，相關機理還有待深入研究。

2.4 淬滅酶對微生物群落結構的影響

對各反應器的活性污泥樣品進行高通量測序并分析，結果如圖4和表2所示。兩組反應器樣品的Coverage 均等于0.998，表明數據分析覆蓋了絕大多數微生物，保證了數據的可靠性。ACE 和Chao指數越大，表明以OTU 為分類單元的優勢物種的豐富度越大。可以發現，空白組R1的ACE和Chao指數高出R2 近1 倍，表明淬滅酶的加入降低了優勢微生物的豐度。Shannon 指數與Simpson 指數的變化趨勢相反，但反映的規律一致，Shannon 指數越大代表微生物的多樣性越高。R1的Shannon指數與Simpson 指數分別為3.8 和0.075，R2 分別為3.4和0.078。這表明兩組反應器的微生物多樣性相差不大。值得注意的是R1、R2反應器的微生物豐富度存在不容忽視的差異，造成這種差異的主要原因可能是淬滅酶的投加破環了部分微生物的群感效應，從而阻礙了部分微生物的生長繁殖。

圖4 屬水平微生物群落變化情況

表2 微生物測序多樣性指數和相對豐度

圖4 反映了兩組反應器中的微生物群落組成。如圖所示，R1和R2菌屬種類未發生變化，但各菌屬相對豐度發生了變化。可以看出各反應器中均未檢測出厭氧氨氧化菌，主要是因為反應器中厭氧氨氧化菌并不是優勢菌屬，由于濃度較低未被檢出。在R1 中，優勢菌屬主要為Hyphomicrobium、Arenimonas、Nitrosomonas和Truepera，它們的相對豐度分別為20.56%、7.37%、5.83%和4.33%。其中Hyphomicrobium、Arenimonas和Truepera為主要的反硝化菌屬[29-31]，Nitrosomonas為優勢亞硝化菌屬[32]。在加入淬滅酶的R2 中，Nitrosomonas的相對豐度增長至6.32%。這與張肖靜等[19]的AHLs 酰基轉移酶使脫氮系統亞硝化菌的相對豐度減少的結果略有不同，主要可能是兩個反應系統中菌群結構存在較大差異，因此亞硝化菌表現出不同的響應結果。Hyphomicrobium和Truepera反硝化菌屬的相對豐度基本不變，分別為20.94% 和4.64%，Arenimonas等反硝化菌屬的相對豐度略有減少，為6.43%。Zhang 等[33]研究發現，Arenimonas能有效消耗硝酸鹽，從而提高總氮（TN）去除效率，故Arenimonas的減少使得TN 去除率下降。同時相關研究[34]表明，Arenimonas與厭氧氨氧化關系密切，與自養脫氮性能呈正相關，因此Arenimonas相對豐度的降低也從側面反映厭氧氨氧化受到了抑制。有研究[35]表明，Thermomonas是短程反硝化體系中的優勢反硝化菌屬，值得注意的是，Thermomonas反硝化菌屬的相對豐度由0.28%增長至9.04%，出現了大幅度增長，這再次證明加入淬滅酶后短程反硝化的增強。此外，有研究認為Thermomonas為亞硝酸鹽產生的反硝化菌[36]，這說明，淬滅酶能夠促進硝氮轉化成亞氮，這也解釋了為什么R2出水亞氮高于R1。

結合上述分析，反應系統主要以亞硝化反應，結合內源反硝化和少量厭氧氨氧化協同脫氮，而淬滅酶的加入促進了系統短程內源反硝化并抑制了厭氧氨氧化過程，最終使R2 中亞氮積累，TNRE 下降。因此，淬滅酶有可能用于兩級式自養脫氮工藝（短程反硝化-厭氧氨氧化）短程反硝化單元的強化，進而為后續厭氧氨氧化提供亞氮基質，之后與氨氮廢水混合進行處理，最終實現低C/N比廢水的高效處理。

3 結論

在以內源反硝化為主要脫氮過程的亞硝化-混合自養脫氮系統中存在厭氧氨氧化過程，但不占優勢。2μmol/L 的淬滅酶長期作用于亞硝化-混合自養脫氮系統，導致反應器內亞氮大量積累，出水亞氮達到66.5mg/L，同時總氮去除顯著下降，相比未加淬滅酶的對照組降低了11.1%。淬滅酶的加入強化了短程反硝化，但抑制了厭氧氨氧化。淬滅酶抑制了污泥中EPS的分泌，但誘導了SMP的分泌，進而為內源反硝化提供了碳源。Heme-c 的增加有可能是厭氧氨氧化菌抵抗外界不利環境的一種機制。添加2μmol/L 淬滅酶使Nitrosomonas的相對豐度由5.83%增長為6.32%，Thermomonas反硝化菌屬的相對豐度由0.28%增長至9.04%。淬滅酶有望用于短程反硝化單元的強化，進而為兩級式自養脫氮工藝的厭氧氨氧化單元提供亞氮基質。