淺談基因編輯技術(shù)在模式植物中的應(yīng)用研究

程迪思

（中國(guó)人民大學(xué)附屬中學(xué)，北京 100080）

0.引言

近年來(lái)，基因編輯等基因技術(shù)在疾病治療等領(lǐng)域都有著至關(guān)重要的地位，其中CRISPR/Cas9 技術(shù)是一種近些年中被研制出來(lái)的新型基因治療方法，并且被廣泛應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域。CRISPR 系統(tǒng)是生物長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)化而形成的，它具有免疫和防御外來(lái)入侵的病毒的功能。利用這一系統(tǒng)，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。CRISPR/Cas9 技術(shù)是一種高效的基因編輯技術(shù)，這項(xiàng)基因技術(shù)主要是對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行特定化學(xué)修飾。CRISPR/Cas9 技術(shù)常常被應(yīng)用于基因編輯中，能構(gòu)成一種較為前沿的基因編輯體系。在臨床醫(yī)學(xué)方面，這項(xiàng)技術(shù)常被應(yīng)用于血液病等遺傳疾病，且已經(jīng)具有一定的治療效果和較為成功的臨床案例。該技術(shù)的研究成果現(xiàn)已經(jīng)可以應(yīng)用于對(duì)部分常見(jiàn)脊椎模式動(dòng)物進(jìn)行精確化學(xué)修飾。

在20 世紀(jì)90 年代初，CRISPR 最早被發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)菌和古生菌中，利用這個(gè)CRISPR 序列，人們可以更方便地進(jìn)行生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此，這項(xiàng)技術(shù)也在許多領(lǐng)域中都很流行。2002 年，CRISPR 被正式定名， Jansen 實(shí)驗(yàn)室的工作人員，通過(guò)生物信息學(xué)分析等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了這種序列，后來(lái)，通過(guò)進(jìn)行基因組的測(cè)序發(fā)現(xiàn)了大部分古生菌和一部分細(xì)菌具有這個(gè)特殊序列。2005 年，Mojica、Bolotin、Pourcel 研究小組的成員發(fā)現(xiàn)了CRISPR 基因中一些間隔序列的來(lái)源，其源于外來(lái)噬菌體的序列或是一些質(zhì)粒。Mojica 實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)，病毒不能感染序列中帶有病毒同源基因的細(xì)胞，只能感染沒(méi)有同源序列的細(xì)胞，據(jù)此他們提出了假說(shuō)，CRISPR基因很有可能是執(zhí)行細(xì)菌免疫功能的有關(guān)基因。2008 年，Oost 實(shí)驗(yàn)室的工作人員發(fā)現(xiàn)了CRISPR 實(shí)現(xiàn)免疫功能的機(jī)制，為CRISPR 的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。2012 年以來(lái)，CRISPR 被廣泛用于基因的修飾、替換、敲入、切斷、敲除等技術(shù)，美國(guó)約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的實(shí)驗(yàn)室還利用CRISPR 技術(shù)對(duì)人類(lèi)的干細(xì)胞進(jìn)行改造，能夠高效地將目的基因進(jìn)行改變，實(shí)現(xiàn)表達(dá)特定蛋白，進(jìn)而可能有效地應(yīng)用于疾病治療過(guò)程中。目前，這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在已經(jīng)運(yùn)用在多種疾病的治療研究過(guò)程中。來(lái)自中國(guó)的四川大學(xué)華西醫(yī)院的科學(xué)家利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)來(lái)選擇性地敲除T 淋巴細(xì)胞中的部分基因再輸入腫瘤患者體內(nèi)，因?yàn)椴糠帜[瘤患者體內(nèi)的免疫細(xì)胞無(wú)法識(shí)別并區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)序增殖的現(xiàn)象，利用基因編輯技術(shù)可以使免疫細(xì)胞恢復(fù)至相對(duì)正常水平，并實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的針對(duì)性攻擊，以達(dá)到長(zhǎng)期免疫的效果，有效地治療肺癌疾病。2017 年3 月，英國(guó)的科學(xué)家利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)使因?yàn)橐暰W(wǎng)膜中的視錐細(xì)胞和視干細(xì)胞退化而失明的小鼠重新恢復(fù)視覺(jué)。由此展望，這一項(xiàng)技術(shù)可以成為對(duì)色素性視網(wǎng)膜炎等眼部疾病醫(yī)治的主要手段，通過(guò)CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)可以有效抑制因?yàn)榛蛲蛔兌鴮?dǎo)致的視錐細(xì)胞和視干細(xì)胞的衰亡，以此來(lái)打破此類(lèi)疾病無(wú)法醫(yī)治的現(xiàn)狀。2020 年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)證明了此項(xiàng)技術(shù)未來(lái)會(huì)在更多領(lǐng)域有所發(fā)展，目前，此技術(shù)用于多項(xiàng)動(dòng)物模擬試驗(yàn)中，研究結(jié)果顯示取得了較好的效果，未來(lái)進(jìn)一步在倫理規(guī)則的約束下有機(jī)會(huì)更進(jìn)一步地在人體疾病中繼續(xù)作為一種可靠的應(yīng)用工具。

1. CRISPR 技術(shù)概述

CRISPR 全稱(chēng)為常間回文重復(fù)序列。在發(fā)揮功能的過(guò)程中，常常是由CRISPR 和Cas 蛋白構(gòu)成。CRISPR 序列在實(shí)行免疫功能時(shí)，可以將外來(lái)侵染的DNA 剪切并且吸收到自身的基因序列中。在外來(lái)侵染物第二次侵染細(xì)胞時(shí)，該序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則實(shí)現(xiàn)與外來(lái)侵染的DNA的結(jié)合，并利用相關(guān)蛋白實(shí)現(xiàn)剪切。CRISPR 可以實(shí)現(xiàn)對(duì)部分基因的靶向編輯。這一系統(tǒng)具有高度靈活性和針對(duì)性，且擁有效率和成本上的優(yōu)勢(shì)。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有多樣性，根據(jù)CRISPR 的組成特征和Cas 基因的結(jié)構(gòu)特征、數(shù)量等，可以大致分為3 類(lèi)：第1 類(lèi)是結(jié)構(gòu)和組成最為復(fù)雜的系統(tǒng)，其中含有的Cas3 屬于解旋酶；第2 類(lèi)是現(xiàn)如今研究最為深入的一種，也是綜合性能最好的一種，Cas9 就是這一類(lèi)的代表蛋白；第3 類(lèi)包含特征性的Cas10，這一類(lèi)常發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌中。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)主要基于第2 類(lèi)CRISPR 系統(tǒng)，由Cas9、反式作用RNA（tracrRNA）和前體CRISPR RNA（前體crRNA）構(gòu)成。CRISPR 序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體crRNA 和tracrRNA，成熟的crRNA 與tracrRNA 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合形成局部雙鏈的結(jié)構(gòu)并進(jìn)一步與Cas9 結(jié)合形成復(fù)合體。依據(jù)同源互補(bǔ)配對(duì)的原則，整個(gè)核糖核蛋白復(fù)合物經(jīng)成熟crRNA 的引導(dǎo)與靶序列（目標(biāo)DNA）結(jié)合。局部解開(kāi)DNA 雙鏈并使之與 crRNA 相結(jié)合，Cas9 蛋白最終通過(guò)一系列操作（通過(guò)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)）實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 的切割。現(xiàn)如今已經(jīng)找到了一種引導(dǎo)RNA（gRNA）可以用來(lái)取代crRNA 和tracrRNA的功能，它可以通過(guò)同源互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合到上游的結(jié)合位點(diǎn)處，使工作流程進(jìn)一步簡(jiǎn)化。2012 年，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)在體內(nèi)具有切割DNA 的能力的基礎(chǔ)上，被證明在體外也同樣具有切割DNA 的能力，同時(shí)CRISPR 也被證明具有在活細(xì)胞中改變基因的潛能，這些研究為該技術(shù)的在不同領(lǐng)域的拓展奠定了方向。2013 年，CRISPR/Cas 基因編輯技術(shù)首次人工作用于植物的相關(guān)基因上，這一實(shí)驗(yàn)為該技術(shù)在模式植物中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

ZFNs 技術(shù)（鋅指核酸酶技術(shù)），TALENs 技術(shù)（類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)）和CRISPR/Cas9 技術(shù)均可以實(shí)現(xiàn)基因組編輯。理論上，ZFNs 技術(shù)適用范圍較廣，可以對(duì)諸多DNA 序列進(jìn)行編輯和調(diào)整。但是在實(shí)際應(yīng)用中，存在著諸多問(wèn)題。它需要龐大的基因表達(dá)文庫(kù)，成本高，且脫靶率高，還有潛在的細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)成功率較低，所以在實(shí)際應(yīng)用中很難拓展。相比而言TALENs 技術(shù)在這幾方面都有所改善，但是也存在著一些問(wèn)題，例如其構(gòu)建周期長(zhǎng)，很難進(jìn)行多靶點(diǎn)編輯，且成本較高，使這項(xiàng)技術(shù)很難在實(shí)際應(yīng)用中拓展。與前兩個(gè)技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)則具有顯著優(yōu)勢(shì)，首先這項(xiàng)技術(shù)設(shè)計(jì)更為簡(jiǎn)單，在應(yīng)用時(shí)能維持較低的成本，同時(shí)它的構(gòu)建周期比前兩種技術(shù)更短，可以進(jìn)行多靶點(diǎn)的編輯且能維持較高的修飾率。但是現(xiàn)在仍然存在脫靶率不確定等問(wèn)題有待優(yōu)化[1]。

2. CRISPR 技術(shù)在模式植物應(yīng)用概述

CRISPR/Cas9 技術(shù)在探究生物基因功能和動(dòng)植物的基因編輯等方面展現(xiàn)了非常廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。因?yàn)镃RISPR/Cas9 技術(shù)具有低成本高效率的優(yōu)勢(shì)，其在微藻等模式植物中的應(yīng)用得到了快速的進(jìn)步和發(fā)展。根據(jù)相關(guān)資料顯示，CRISPR/Cas9 技術(shù)首先應(yīng)用于萊茵衣藻這類(lèi)藻類(lèi)植物中，隨著這項(xiàng)技術(shù)在微藻中的拓展，越來(lái)越多的藻類(lèi)基因組測(cè)序得到完善，其提供的明確的遺傳背景等信息對(duì)衣藻等多種微藻的基因工程的研究和應(yīng)用起到了促進(jìn)的作用。CRISPR/Cas9 技術(shù)在衣藻中的廣泛應(yīng)用在體現(xiàn)了其顯著優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，還體現(xiàn)了其具有識(shí)別并測(cè)定特定基因的功能，具有開(kāi)發(fā)特定性狀的菌株的潛力。

2.1 CRISPR 技術(shù)在萊茵衣藻中的應(yīng)用簡(jiǎn)介

對(duì)于萊茵衣藻這類(lèi)模式植物的研究，早在20 世紀(jì)末就開(kāi)始了。作為模式植物，萊茵衣藻具有單細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)條件較為簡(jiǎn)單，樣本量較大等優(yōu)勢(shì)。所以這類(lèi)模式植物成為首批進(jìn)行基因組測(cè)序的藻類(lèi)。許多異源轉(zhuǎn)基因已在萊茵衣藻中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，其中包括抗生素抗性標(biāo)記基因等可以方便研究者研究基因表達(dá)和篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。這些特征促使萊茵衣藻成為早期研究基因編輯技術(shù)的模型藻類(lèi)。

自從CRISPR/Cas9 技術(shù)首次成功應(yīng)用于萊茵衣藻中，研究人員也成功地將Cas9 和sgRNA（小向?qū)Щ颍┺D(zhuǎn)入衣藻細(xì)胞中進(jìn)行了短暫表達(dá)，同時(shí)也首次成功敲除了萊茵衣藻中的內(nèi)源基因，但是研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了當(dāng)時(shí)的CRISPR/Cas9 技術(shù)具有極低的基因轉(zhuǎn)化效率且含有潛在細(xì)胞毒性等問(wèn)題。

為了有效降低Cas9 載體的細(xì)胞毒性和脫靶效應(yīng)，在隨后的幾年中，相關(guān)研究人員合成了Cas9-gRNA RNP（Cas9-gRNA 核糖核蛋白復(fù)合物）并成功將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入萊茵衣藻中，并且在不同基因座上都成功實(shí)現(xiàn)了突變。RNP 方法比起傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)在于這個(gè)方法顯著提高了基因沉寂的效率，從而降低了脫靶效應(yīng)的概率。因?yàn)檫@種蛋白只存在著瞬時(shí)活性并且隨后就會(huì)被細(xì)胞中相關(guān)蛋白酶所分解，所以RNP 方法也同時(shí)有效降低了細(xì)胞毒性。這一技術(shù)促進(jìn)了萊茵衣藻用于黃斑色素的工業(yè)生產(chǎn)，大幅提高了玉米黃素的產(chǎn)量。

隨著技術(shù)的進(jìn)步，CRISPR-Cpf1 核酸酶首次在萊茵衣藻中實(shí)驗(yàn)。通過(guò)其相關(guān)核糖核蛋白復(fù)合物與相關(guān)脫氧核苷酸作為DNA 的修復(fù)模板，實(shí)現(xiàn)了定向的DNA 取代，優(yōu)化了CRISPR/Cas9 技術(shù)。

研究人員首次將CRISPRi 系統(tǒng)（基因抑制/沉默系統(tǒng)）用于萊茵衣藻中的脂質(zhì)基因的調(diào)控。PEPC 與PEP 形成草酰乙酸，草酰乙酸后流入三羧酸循環(huán)中進(jìn)行相關(guān)蛋白的合成。通過(guò)一系列的反應(yīng)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了萊茵衣藻中的脂質(zhì)積累速率，從而實(shí)現(xiàn)了生物量的積累。為促進(jìn)基因編輯的效率，研究人員選擇了進(jìn)一步研究MAA7 基因，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)操作，成功優(yōu)化了RNP 復(fù)合物的濃度的轉(zhuǎn)化方案，并且確定了實(shí)現(xiàn)高效的靶向敲除的研究方向[2]。

2.2 CRISPR 技術(shù)在藍(lán)藻中的應(yīng)用簡(jiǎn)介

藍(lán)藻是生產(chǎn)生物燃料的理想的底盤(pán)生物，但是，它的基因組的修飾卻非常的復(fù)雜。隨著CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)基因組編輯方式的改變，藍(lán)藻的相關(guān)研究也實(shí)現(xiàn)了突破。其發(fā)展進(jìn)程與萊茵衣藻的研究進(jìn)程相似。

研究人員先通過(guò)將CRISPR/Cas9 技術(shù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) Cas9具有潛在的細(xì)胞毒性。后來(lái)將Cpf1 蛋白和Cas9 蛋白進(jìn)行毒性評(píng)估檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cpf1 蛋白的毒性更低，并通過(guò)對(duì)不同藍(lán)藻的基因點(diǎn)突變等實(shí)驗(yàn)證明CRISPR/Cpf1 技術(shù)更適合藍(lán)藻，且具有多功能性。

CRISPRi 系統(tǒng)后來(lái)也在藍(lán)藻工程學(xué)中得到了應(yīng)用，這一應(yīng)用取得了很多應(yīng)用成果，實(shí)現(xiàn)了高效生產(chǎn)銨鹽等技術(shù)的突破。在不斷的研究過(guò)程中，無(wú)酶活性但影響細(xì)胞活性的dCas9 被功能相近且對(duì)細(xì)胞活性影響較小的dCpf1 取代。無(wú)酶活性這一特點(diǎn)，推動(dòng)對(duì)于不能刪除只能抑制的必需基因的研究進(jìn)行。隨著多次研究進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)由dCpf1 介導(dǎo)的CRISPRi 系統(tǒng)極大地促進(jìn)了藍(lán)藻代謝工程學(xué)的發(fā)展，這一研究方式為藍(lán)藻生物量的提高提供了新的策略。

CRISPR 技術(shù)同樣具有多路復(fù)用的功能，可以實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)編輯。研究人員通過(guò)這一作用成功地優(yōu)化了藍(lán)藻，使其代謝過(guò)程得到了更廣大更全面地覆蓋，加速了藍(lán)藻代謝工程的研究。

2.3 CRISPR 技術(shù)在硅藻中的應(yīng)用簡(jiǎn)介

硅藻具有生產(chǎn)生物燃料和生物衍生化學(xué)品等的潛在的應(yīng)用潛力，CRISPR/Cas9 技術(shù)在硅藻中也有著重要作用。研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)得到了突變菌株，并且還實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定基因的精確敲除，有效地論證了在硅膠中進(jìn)行基因編輯的可行性。

CRISPR/Cas9 技術(shù)在硅藻中的應(yīng)用仍在不斷地完善的過(guò)程中。為了優(yōu)化CRISPR/Cas9 技術(shù)，研究人員采取了對(duì)CRISPR/Cas9 載體的優(yōu)化構(gòu)型，簡(jiǎn)化了篩選的步驟，實(shí)現(xiàn)了實(shí)質(zhì)性的突破。后來(lái)，研究人員進(jìn)一步改良這一技術(shù)，通過(guò)CRISPR/Cas9 切口酶優(yōu)化了部分模式植物的特定基因編輯，Cas9 切口酶的引用有效降低了脫靶效應(yīng)和時(shí)間消耗。但是CRISPR/Cas9 切口酶依然存在著在微藻拓展層次的局限性。

除了上述藻類(lèi)，CRISPR 技術(shù)也在其他藻類(lèi)上進(jìn)行著探索式的研究。研究人員對(duì)諸多工業(yè)產(chǎn)油微藻實(shí)現(xiàn)了CRISPR技術(shù)的應(yīng)用，并且大幅增加了產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂質(zhì)的進(jìn)一步累積。目前CRISPR/Cas9 技術(shù)在藻類(lèi)上的研究已逐步深入，其在相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展?jié)摿κ遣豢晒懒康腫3]。

3.結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas9 技術(shù)具有成本較低且可以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)修飾的功能，相較于以前的兩個(gè)技術(shù)，CRISPR/Cas9 技術(shù)擁有著顯著的優(yōu)勢(shì)。目前，這項(xiàng)技術(shù)為多種模式植物的相關(guān)工程提供了新的思路和方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)技術(shù)的應(yīng)用。但是其仍然面臨著脫靶率較高，存在潛在的細(xì)胞毒性等問(wèn)題，這項(xiàng)技術(shù)也沒(méi)有完全地應(yīng)用于所有類(lèi)型的模式植物中來(lái)驗(yàn)證它的普適性。針對(duì)這項(xiàng)技術(shù)潛在的細(xì)胞毒性，我們可以通過(guò)改變Cas 蛋白類(lèi)型，利用不同蛋白（例如：Cpf1 蛋白）來(lái)實(shí)現(xiàn)這項(xiàng)功能，同時(shí)我們可以利用體外合成RNP 的技術(shù)來(lái)降低其毒性。針對(duì)其脫靶效應(yīng)，我們可以通過(guò)增加sgRNA 的BP（堿基對(duì)數(shù)目），來(lái)降低脫靶效應(yīng)的頻率。未來(lái)CRISPR/Cas9 技術(shù)會(huì)在更多領(lǐng)域中實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在不同模式植物中的進(jìn)一步拓展也同樣值得期待。