三甲胺N-氧化物與肺動脈高壓的因果關(guān)系：兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析

曹溢，豐瑞誼，唐燕，羅強(qiáng)，張藝文，汪漢

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種進(jìn)行性肺血管疾病，其臨床特征是持續(xù)的肺血管收縮、肺血管重塑和原位血栓形成導(dǎo)致肺動脈順應(yīng)性降低和肺血管阻力增加，最終導(dǎo)致右心衰竭和死亡［1］。PAH的發(fā)病率和病死率均較高，估計(jì)每100萬成年人中就有10.6人罹患PAH［2］。盡管目前PAH治療方面有了新的進(jìn)展，但尚缺乏有效藥物，故其病死率仍居高不下［3］。因此，繼續(xù)探討可能參與PAH的其他病理生理學(xué)機(jī)制非常必要。研究表明，腸道菌群代謝產(chǎn)物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）與PAH密切相關(guān)［4］，但具體因果關(guān)系尚未完全明確。孟德爾隨機(jī)化方法是探索暴露因素與結(jié)局關(guān)系的一種流行病學(xué)方法［5］，其可克服觀察性研究中的反向因果關(guān)系和潛在混雜因素的影響。本研究基于兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析，以TMAO為暴露因素、PAH為結(jié)局，探討了TMAO與PAH的因果關(guān)系，以期為PAH的防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 TMAO的數(shù)據(jù)集來自全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome wide association study，GWAS），包括弗雷明翰心臟研究的2 076名歐洲參與者的人類代謝組的匯總數(shù)據(jù)［6］，詳見https://academic.oup.com/nar/article/42/D1/D975/1061961。PAH的數(shù)據(jù)集來自芬蘭數(shù)據(jù)庫，包括162 962名歐洲受試者的16 380 163個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）信息，詳見https://gwas.mrcieu.ac.uk/datasets/finn-b-I9_HYPTENSPUL/。

1.2 工具變量的選擇 由于GWAS中很少有腸道菌群代謝產(chǎn)物的SNP達(dá)到全基因組顯著性水平（P＜5×10-8），故本研究選擇具有提示性全基因組顯著性水平（P＜5×10-5）的SNP作為工具變量。工具變量的選擇基于以下3個(gè)條件：（1）工具變量與TMAO顯著相關(guān)；（2）工具變量與PAH無關(guān)；（3）僅有TMAO影響PAH。采用Plink軟件提取備選SNP，備選SNP需滿足以下條件：（1）P＜5×10-5；（2）連鎖不平衡參數(shù)（r2）＜0.001；（3）設(shè)置區(qū)域?qū)挾葹?0 000 kb，以保證各SNP之間相互獨(dú)立。其次，利用catalog和PhenoScanner數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析備選SNP是否與混雜因素相關(guān)，本研究僅納入與混雜因素不相關(guān)的SNP。最后，采用F統(tǒng)計(jì)量判斷SNP與TMAO的相關(guān)強(qiáng)度，以F統(tǒng)計(jì)量≤10為存在弱工具變量偏倚的可能性，剔除存在弱工具變量偏倚可能性的SNP。

1.3 孟德爾隨機(jī)化分析方法

1.3.1 效應(yīng)量估計(jì) 采用逆方差加權(quán)法（inversevariance weighting，IVW）評估TMAO與PAH之間的關(guān)系，如存在異質(zhì)性則使用隨機(jī)效應(yīng)模型，否則使用固定效應(yīng)模型。其次，使用MR-Egger回歸、最大似然比（maximum likelihood，ML）、加權(quán)中位數(shù)（weighted median，WM）和MR多效性殘差和與異常值（MR pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO）及MR穩(wěn)健性評分（MR-robust adjusted profile score，MRRAPS）對IVW的結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充［7］。

1.3.2 水平多效性和異質(zhì)性檢驗(yàn) 首先，使用MRPRESSO檢測異常值，若存在異常值，則去除異常值后重新進(jìn)行分析。然后進(jìn)行留一法敏感性分析，其是每次排除單個(gè)SNP，對剩余SNP重新進(jìn)行IVW分析，從而判斷單個(gè)SNP對IVW結(jié)果的影響。其次，采用MR-Egger法的截距表示是否存在水平多效性，若截距的P值＜0.05則認(rèn)為存在水平多效性。再者，采用Cochran'sQ檢驗(yàn)分析工具變量的異質(zhì)性；最后，采用漏斗圖分析研究結(jié)果的潛在偏倚情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R軟件中的TwoSampleMR包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以O(shè)R值及其95%CI表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 工具變量的選擇 經(jīng)篩選，與TMAO密切相關(guān)的工具變量共9個(gè)，分別是rs4846884、rs12131532、rs17131718、rs1538291、rs12116428、rs7522157、rs3935570、rs6656619及rs11583422。9個(gè)工具變量的F統(tǒng)計(jì)量均＞10，提示存在弱工具變量偏倚的可能性較小。

2.2 孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果 IVW 分析結(jié)果顯示，TMAO可能會增加PAH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149），P=0.048〕；上述關(guān)系在ML〔OR=1.806，95%CI（1.004，3.251），P=0.049〕、MR-PRESSO〔OR=2.063，95%CI（1.165，3.652），P=0.037〕及MR-RAPS〔OR=2.063，95%CI（2.054，2.259），P=0.015〕中被證實(shí)，但在MR-Egger回歸〔OR=1.394，95%CI（0.302，6.422），P=0.685〕和WM〔OR=1.919，95%CI（0.859，4.288），P=0.112〕中未被證實(shí)，見圖1～2。

圖1 主效應(yīng)圖Figure 1 Main effect diagram

圖2 每個(gè)SNP對PAH影響的森林圖Figure 2 Forest map of the effects of each SNP on PAH

2.3 水平多效性和異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果 MR-PRESSO分析結(jié)果顯示，本研究納入的SNP不存在異常值。留一法敏感性分析結(jié)果顯示，逐一刪除單個(gè)SNP后IVW分析結(jié)果無明顯變化，見圖3。MR-Egger法的截距分析結(jié)果顯示，本研究不存在任何水平多效性（P=0.369）。Cochran'sQ檢驗(yàn)結(jié)果顯示，工具變量不存在異質(zhì)性（P=0.586）。漏斗圖分析結(jié)果顯示，所有工具變量呈非對稱性分布，表明該研究結(jié)果可能存在潛在偏倚，見圖4。

圖3 留一法敏感性分析結(jié)果Figure 3 The results of leave-one-out sensitivity analysis

圖4 漏斗圖Figure 4 Funnel plot

3 討論

本研究基于兩樣本孟德爾隨機(jī)化分析探討了TMAO與PAH的因果關(guān)系，IVW分析結(jié)果顯示，TMAO可能會增加PAH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)〔OR=1.777，95%CI（1.002，3.149）〕；上述關(guān)系在ML、MR-PRESSO及MR-RAPS中被證實(shí)，但在MR-Egger回歸和WM中未被證實(shí)，考慮IVW分析的統(tǒng)計(jì)效應(yīng)值最好，故認(rèn)為該結(jié)果比較可靠，提示TMAO與PAH可能存在因果關(guān)系，TMAO每升高1個(gè)單位，PAH發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高77.7%，故干預(yù)TMAO或產(chǎn)TMAO的腸道菌群可能對預(yù)防PAH具有積極作用。

本研究孟德爾隨機(jī)化分析結(jié)果與既往臨床研究結(jié)果一致，如MOUTSOGLOU等［8］研究表明，PAH患者腸道菌群失調(diào)，其中血液循環(huán)中短鏈脂肪酸和次級膽汁酸較低可能會促進(jìn)PAH的發(fā)生。KIM等［9］通過宏基因組學(xué)分析比較了18名1型PAH患者〔平均肺動脈壓為57.4 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）〕和13名對照者的糞便微生物組，結(jié)果顯示，PAH患者微生物菌落的分類和功能發(fā)生了明顯變化，與對照者相比，PAH患者精氨酸、脯氨酸和鳥氨酸的合成途徑增加，與TMAO和嘌呤代謝相關(guān)的細(xì)菌菌落增多。HONG等［10］研究表明，腸道微生物組變化與PAH代謝組變化有關(guān)，且這些變化受到NPS2143的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性PAH和野百合堿誘導(dǎo)的PAH高風(fēng)險(xiǎn)大鼠模型TMAO水平升高，而特發(fā)性多環(huán)芳烴或缺氧誘導(dǎo)的PAH低風(fēng)險(xiǎn)小鼠模型TMAO水平則未升高，表明TMAO表達(dá)升高可能僅發(fā)生于嚴(yán)重PAH患者；此外，3，3-二甲基-1-丁醇是TMAO合成抑制劑，可以減輕PAH的病理改變，如其可以降低野百合堿誘導(dǎo)的PAH高風(fēng)險(xiǎn)大鼠模型的收縮壓、最大右心房壓，減輕右心室肥厚和減小肺血管厚度［11］，提示TMAO在PAH進(jìn)展中具有重要作用，可能是治療PAH的靶點(diǎn)。

目前，TMAO誘導(dǎo)PAH的具體機(jī)制尚不清楚。HUANG等［11］研究發(fā)現(xiàn)，DMB可以阻止巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，從而減輕肺血管損傷。此外，PAH的最重要病理生理學(xué)機(jī)制是肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，而TMAO可以促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞遷移［8］。TMAO僅是腸道菌群代謝產(chǎn)物的一種，盡管目前對其研究較多，但腸道菌群本身及其他代謝產(chǎn)物也可能對PAH的發(fā)生發(fā)展具有一定作用，如腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致腸壁滲透性改變，細(xì)菌或細(xì)菌成分從腸道直接轉(zhuǎn)移到血液循環(huán)中［12-13］；血液循環(huán)中的微生物代謝產(chǎn)物負(fù)荷改變可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞激活、炎性細(xì)胞因子釋放、血小板異常聚集和泡沫細(xì)胞形成，從而促進(jìn)PAH的發(fā)生發(fā)展。另外，微生物菌落其他代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸可激活G-蛋白偶聯(lián)受體或通過抑制組蛋白去乙酰酶來改變表觀遺傳，進(jìn)而激活調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮抗炎作用［14］。

綜上所述，TMAO增加可能導(dǎo)致PAH，TMAO與PAH可能存在因果關(guān)系，這為臨床設(shè)計(jì)PAH的微生物組依賴性代謝產(chǎn)物干預(yù)措施提供了思路。本研究基于大數(shù)據(jù)探討了TMAO與PAH的因果關(guān)系，此外，ML和MRRAPS分析結(jié)果與IVW分析結(jié)果一致，表明本研究結(jié)果比較穩(wěn)健。但本研究結(jié)果仍存在一定局限性：首先，不能完全排除飲食-基因或基因-環(huán)境之間的相互作用，這可能會影響研究結(jié)果；其次，無法解決孟德爾隨機(jī)化分析中未觀察到的多效性；最后，本研究對象為歐洲人群，該結(jié)果是否能推廣至其他國家的人群尚不清楚。

作者貢獻(xiàn)：曹溢、汪漢進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；唐燕、羅強(qiáng)、張藝文進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；豐瑞誼、羅強(qiáng)進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；汪漢負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。