兩細(xì)胞多核胚胎對活產(chǎn)結(jié)局的影響

付濤，朱家紅，劉軍霞，高洋，郝向偉，韓偉，武麗紅*

(1.重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,重慶 400013;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院,重慶 401147)

如何挑選優(yōu)質(zhì)胚胎移植以改善輔助生殖的臨床結(jié)局一直是胚胎學(xué)家們關(guān)注的重點(diǎn)。胚胎形態(tài)學(xué)評分是業(yè)界公認(rèn)的評分標(biāo)準(zhǔn),主要通過胚胎細(xì)胞數(shù)目、大小、均一性、碎片及空泡等對胚胎進(jìn)行評級,綜合胚胎評級挑選出優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行冷凍保存或移植[1]。早期胚胎發(fā)育過程中多核的出現(xiàn)是一種較為常見的異常現(xiàn)象,在IVF周期中,早期胚胎多核的發(fā)生率更是高達(dá)79.4%,而且第2天胚胎多核更常見[2]。

隨著時差培養(yǎng)(Time-lapse culture)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,胚胎生長發(fā)育的更多細(xì)節(jié)被實(shí)時記錄下來[3]。相較于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡觀察胚胎,時差培養(yǎng)系統(tǒng)能夠更加詳細(xì)地捕捉到胚胎每個階段的異常。胚胎多核現(xiàn)象并不是貫穿整個發(fā)育過程,基于時差培養(yǎng)系統(tǒng),胚胎是否存在多核現(xiàn)象能夠更準(zhǔn)確地被判斷[4]。目前早期胚胎多核對胚胎的發(fā)育及臨床結(jié)局影響的研究較多,但結(jié)果尚無定論。有的學(xué)者報道早期胚胎多核會導(dǎo)致胚胎染色體出現(xiàn)異常,進(jìn)而影響胚胎著床率及臨床妊娠率[5-6]。也有學(xué)者認(rèn)為早期胚胎多核可能存在自我修復(fù)機(jī)制,并不影響臨床結(jié)局[7]。目前,國內(nèi)外胚胎多核對胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局影響的報道主要集中在囊胚形成率及臨床妊娠率,對于活產(chǎn)結(jié)局的報道較少。本研究通過時差培養(yǎng)系統(tǒng)實(shí)時記錄數(shù)據(jù),觀察兩細(xì)胞胚胎和四細(xì)胞胚胎的多核情況,探討移植兩細(xì)胞多核胚胎來源囊胚對臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)局的影響,為兩細(xì)胞多核胚胎形成囊胚后的臨床應(yīng)用提供理論參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2020年7月至2021年11月于重慶市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行解凍復(fù)蘇單囊胚移植患者(共663個周期)的臨床資料和活產(chǎn)結(jié)局,并利用時差培養(yǎng)數(shù)據(jù)分析相應(yīng)胚胎的發(fā)育數(shù)據(jù)。依據(jù)兩細(xì)胞階段是否存在多核現(xiàn)象將其分為兩細(xì)胞無多核組(A組,n=547)和兩細(xì)胞多核組(B組,n=116);同時,根據(jù)兩細(xì)胞時多核現(xiàn)象的分布情況,將兩細(xì)胞多核組分為兩細(xì)胞1細(xì)胞多核組(B1組,n=75)和兩細(xì)胞2細(xì)胞多核組(B2組,n=41)2個亞組;另外,根據(jù)胚胎發(fā)育過程(兩細(xì)胞發(fā)育至四細(xì)胞階段)中多核現(xiàn)象的存在情況,將兩細(xì)胞多核組又分為兩細(xì)胞多核且四細(xì)胞無多核組(B3組,n=96)和兩細(xì)胞多核且四細(xì)胞有多核組(B4組,n=20)2個亞組。

本研究獲重慶市婦幼保健院倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.控制性促排卵與精液處理:根據(jù)女方卵巢儲備情況及個體激素水平差異采用個性化控制性促排卵方案,包括長方案、拮抗劑方案以及其他常用方案。通過陰道超聲和血清激素水平監(jiān)測卵泡生長情況,當(dāng)超聲監(jiān)測至少有3個主導(dǎo)卵泡≥18 mm時,給予HCG(珠海麗珠)注射,并在注射后35～37 h取卵。男方提前禁欲3～7 d,取卵日手淫取精收集精液樣本,經(jīng)密度梯度離心法收集精子沉淀。

2.體外受精與胚胎培養(yǎng):采用IVF或者ICSI授精。IVF授精:患者在HCG注射39～40 h后行IVF授精,控制授精濃度約為1萬條精子/50 μl微滴,將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入微滴自然受精,4～6 h后觀察到卵母細(xì)胞第二極體判斷為受精。ICSI授精:取卵后2 h用透明質(zhì)酸酶將卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞脫除,并在3～6 h內(nèi)完成ICSI授精。將IVF和ICSI授精形成的受精卵轉(zhuǎn)入卵裂培養(yǎng)基(G1,Vitrolife,瑞典),經(jīng)時差培養(yǎng)箱(Time-lapse,Embryoscope+,Vitrolife,瑞典)培養(yǎng)。在受精后第3天,將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)基(G2,Vitrolife,瑞典)中繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。

3.胚胎卵裂球多核觀察及胚胎質(zhì)量評價:通過Embryo Viewer軟件回溯移植囊胚的兩細(xì)胞階段和四細(xì)胞階段,進(jìn)行多核觀察,同時觀察第2天各組胚胎的卵裂模式,包括正常卵裂和異常卵裂。培養(yǎng)至第3天依據(jù)卵裂球均一性、碎片、胞質(zhì)形態(tài)對胚胎進(jìn)行形態(tài)學(xué)評分。培養(yǎng)至第5天和第6天參照Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)[8]對囊胚進(jìn)行評級,包括內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞評級。

4.囊胚冷凍及解凍:采用玻璃化冷凍/解凍商品化試劑盒(Kitazato,日本)冷凍及解凍囊胚[9]。囊胚冷凍:提前通過激光打孔將囊胚皺縮,然后,將囊胚經(jīng)ES液平衡9 min及VS液洗滌1 min后,迅速轉(zhuǎn)至冷凍載桿(Cryotop,日本)上,并置于液氮冷凍保存。囊胚解凍:從液氮中取出冷凍囊胚的載桿,并迅速置于TS液中1 min(囊胚脫落至TS液),然后將囊胚依次轉(zhuǎn)入DS液(3 min)、WS1液(5 min)和WS2液(5 min),最后將囊胚轉(zhuǎn)入G2培養(yǎng)基中行激光輔助孵化,并培養(yǎng)2～4 h后移植。

5.解凍囊胚移植及妊娠結(jié)局判斷:凍融移植周期包括人工周期和自然周期。人工周期中,經(jīng)B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm時,給予黃體酮(雪諾同,默克,德國)支持3 d后解凍囊胚。自然周期中,經(jīng)陰道超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm,排卵后Day 5解凍囊胚。解凍單囊胚經(jīng)B超引導(dǎo)行胚胎移植,胚胎移植后14 d查血β-HCG水平,移植后4周超聲檢測妊娠囊確定臨床妊娠。妊娠12周內(nèi)的流產(chǎn)判定為早期流產(chǎn),12周之后的流產(chǎn)判定為晚期流產(chǎn)。最終出生的活胎即活產(chǎn)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、納入人群和一般情況

回顧性分析663個解凍復(fù)蘇單囊胚移植周期,分為兩細(xì)胞無多核組(A組)和兩細(xì)胞多核組(B組),其中,兩細(xì)胞無多核組547枚胚胎,兩細(xì)胞多核組116枚胚胎。兩組人群平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限、抗苗勒管激素(AMH)水平無顯著性差異(P>0.05)。對兩組間的不孕原因(包括盆腔輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥、排卵機(jī)能障礙、不明原因、女性多因素、男性因素及男女混合因素)和不孕類型(包括原發(fā)不孕和繼發(fā)不孕)占比進(jìn)行統(tǒng)計,結(jié)果顯示均無顯著性差異(P>0.05)。兩組間不同促排卵方案(包括拮抗劑方案、長方案以及其他方案)占比也無顯著性差異(P>0.05),僅不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案(包括人工周期和自然周期)占比有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[(-±s),n(%)]

二、兩組患者周期特征及胚胎發(fā)育情況比較

兩細(xì)胞無多核組(A組)和兩細(xì)胞多核組(B組)兩組間卵巢刺激天數(shù)、Gn劑量、扳機(jī)日雌二醇(E2)水平、子宮內(nèi)膜厚度及獲得的卵母細(xì)胞數(shù)(獲卵數(shù))均無顯著性差異(P>0.05)。兩組間的不同受精方式(包括IVF、ICSI和補(bǔ)救ICSI)占比具有顯著性差異(P<0.05)。在胚胎發(fā)育方面,兩組間Day 2胚胎卵裂模式(正常卵裂和異常卵裂)占比、Day 3胚胎細(xì)胞數(shù)(包括<7細(xì)胞、7細(xì)胞、8細(xì)胞、9細(xì)胞和≥10細(xì)胞)占比、Day 3胚胎評級(包括優(yōu)質(zhì)、中等和一般)占比、Day 3可用胚胎數(shù)、囊胚時期(包括早期、擴(kuò)張期和孵化期)占比、囊胚評級(包括優(yōu)質(zhì)、中等和一般)占比、滋養(yǎng)層細(xì)胞評級(包括優(yōu)質(zhì)、中等和一般)占比及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評級(包括優(yōu)質(zhì)、中等和一般)占比均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者周期特征及胚胎發(fā)育情況比較[(-±s),n(%)]

三、兩組患者妊娠結(jié)局及新生兒情況比較

兩細(xì)胞無多核組(A組)和兩細(xì)胞多核組(B組)相比HCG陽性率、臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率(包括早期流產(chǎn)和晚期流產(chǎn))、活產(chǎn)率及早產(chǎn)率均無顯著性差異(P>0.05);兩組間新生兒體重、身長及性別比均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組患者妊娠結(jié)局及新生兒情況比較[(-±s),%]

四、臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)局的回歸分析

采用多元回歸分析方法進(jìn)一步驗(yàn)證兩細(xì)胞多核與臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)局之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,兩細(xì)胞無多核和兩細(xì)胞多核對臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率未表現(xiàn)出顯著影響(P>0.05);分析4個亞組與A組發(fā)現(xiàn),兩細(xì)胞多核及四細(xì)胞多核不同情況對臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率亦未表現(xiàn)出顯著影響(P>0.05)(表4)。

表4 兩細(xì)胞多核與臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)局的回歸分析

討 論

早期多核胚胎的發(fā)育潛能是現(xiàn)階段關(guān)注的重點(diǎn),探索早期多核胚胎的應(yīng)用潛能是胚胎學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。早期胚胎多核發(fā)生的病因機(jī)理尚不明確,目前報道的可能與有絲分裂過程中細(xì)胞核分裂胞漿未分裂、細(xì)胞核的錯誤分裂、細(xì)胞核分裂過程中核碎片產(chǎn)生等有關(guān)[10-11]。有研究報道,早期多核胚胎通過胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)檢測顯示染色體異常率達(dá)39.9%,但是移植基因正常的早期多核胚胎能獲得正常的健康嬰兒[12]。部分早期多核胚胎在后續(xù)的發(fā)育過程中可能通過自我修復(fù),染色體恢復(fù)正常,避免了多核對胚胎帶來的不利影響[13-14]。有研究報道,早期兩細(xì)胞階段多核胚胎與無多核胚胎的囊胚形成率無統(tǒng)計學(xué)差異(58.3% vs. 65.2%);同時,染色體正常的囊胚形成率(100% vs. 75%)也沒有統(tǒng)計學(xué)差異[15]。本研究結(jié)果顯示,兩細(xì)胞無多核組和兩細(xì)胞多核組胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)如胚胎細(xì)胞數(shù)、評級及卵裂模式等無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);此外,兩組間Day 3優(yōu)質(zhì)胚胎率(63.44% vs. 64.66%,P>0.05)和優(yōu)質(zhì)囊胚率(45.70% vs. 39.66%,P>0.05)無統(tǒng)計學(xué)差異,說明兩細(xì)胞多核胚胎具有良好的發(fā)育潛能形成囊胚。

早期兩細(xì)胞階段胚胎中約有42.53%的胚胎出現(xiàn)多核現(xiàn)象,在這些兩細(xì)胞多核胚胎中,大約有14%的胚胎發(fā)育到四細(xì)胞時仍然出現(xiàn)多核現(xiàn)象,73.4%的兩細(xì)胞多核胚胎能夠恢復(fù)正常狀態(tài),兩細(xì)胞多核對胚胎著床率沒有影響,而四細(xì)胞多核(至少有兩個多核)胚胎的著床率略低[16]。類似的,本研究中663枚胚胎中兩細(xì)胞多核胚胎有116枚,兩細(xì)胞胚胎多核率達(dá)17.50%;發(fā)育到四細(xì)胞階段,四細(xì)胞多核胚胎有20枚,四細(xì)胞胚胎多核率為3.01%,顯著低于兩細(xì)胞胚胎多核率,說明大部分兩細(xì)胞多核胚胎在后續(xù)發(fā)育過程中有絲分裂染色體重構(gòu)恢復(fù)正常;此外,本研究中兩細(xì)胞多核胚胎發(fā)育至囊胚后移植的結(jié)果顯示,兩細(xì)胞胚胎多核對臨床妊娠率、宮外孕率、流產(chǎn)率、早產(chǎn)率及活產(chǎn)率沒有顯著影響,20枚四細(xì)胞多核胚胎發(fā)育至囊胚移植后對臨床結(jié)局亦沒有顯著影響,進(jìn)一步證實(shí)胚胎多核存在自我修復(fù)機(jī)制,避免了多核對胚胎發(fā)育及著床帶來的不利影響。

早期胚胎多核對于胚胎發(fā)育及臨床結(jié)局的影響屢有報道[17-20],但是兩細(xì)胞多核對于活產(chǎn)率及新生兒出生結(jié)局影響的報道較少。一項病例對照研究的結(jié)論為136枚雙核或多核胚胎解凍移植后的臨床妊娠率雖然低于正常組,但是仍然獲得了可接受的妊娠結(jié)局和健康的新生兒,妊娠孕周、新生兒出生體重、胎盤重量及新生兒先天性缺陷發(fā)生狀況等沒有顯著差異[21]。本研究的臨床數(shù)據(jù)同樣顯示,兩細(xì)胞多核胚胎對活產(chǎn)率、新生兒體重、新生兒身長及新生兒性別比沒有顯著影響,提示兩細(xì)胞多核胚胎發(fā)育至囊胚后移植對于活產(chǎn)及新生兒結(jié)局沒有明顯不良影響。

從理論上講,兩細(xì)胞多核胚胎會增加胚胎染色體異常率及整倍性,從而對胚胎的發(fā)育及臨床結(jié)局產(chǎn)生不利影響,然而,胚胎自身存在自我修復(fù)機(jī)制,能夠一定程度上修復(fù)多核的延續(xù),本研究結(jié)果證實(shí)了兩細(xì)胞多核胚胎發(fā)育到四細(xì)胞時多核的比例明顯降低;研究結(jié)果亦表明,兩細(xì)胞多核胚胎對Day 3優(yōu)質(zhì)胚胎率、優(yōu)質(zhì)囊胚率及其形成囊胚移植后的臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及新生兒結(jié)局均無明顯不良影響。但由于本研究為回顧性研究,仍然存在一些不足之處,比如未觀察兩細(xì)胞多核卵裂期胚胎與臨床妊娠及活產(chǎn)結(jié)局的關(guān)系。因此,在卵裂期胚胎移植過程中,建議優(yōu)先選擇沒有多核的胚胎進(jìn)行移植,兩細(xì)胞多核胚胎可行囊胚培養(yǎng),形成囊胚的兩細(xì)胞多核胚胎仍具備臨床應(yīng)用價值。此外,隨著產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的廣泛應(yīng)用,有望進(jìn)一步深入探討兩細(xì)胞及四細(xì)胞多核胚胎的臨床應(yīng)用價值。