精子濃度在精子凋亡率及生精細胞脫落狀態中的作用分析

袁長巍，沈肖方，袁曉立，譚雙，曹興午

(1.北京美中宜和北三環婦兒醫院,北京 100088;2.中日友好醫院,北京 100029)

精液分析是評價男性生育力最基本、最直接、最重要的檢測項目,包括精液外觀、精液量、pH值、液化狀態、粘稠度、精子濃度、精子總數、精子活動率、精子活力分級、圓形細胞及精子形態等參數。但精液分析并不能準確預測因精子質量變化而產生的影響,因此有必要尋找其他的檢測指標,來提高男性生育能力的預測和管理[1]。在精子形態學評估過程中,我們更多關注正常與異常形態精子的百分率。而對于精子凋亡情況及生精細胞脫落狀態并未給予足夠的重視。精子凋亡率可以反映異常染色質狀態,而精液中生精細胞脫落增多則提示可能存在精子發生障礙或生精上皮受損。精液分析不僅可以對患者的生育能力提供一個初步評估,還可以對引起某些生育障礙的病因、病變發生部位提供參考,為確定病因或是否需進一步檢查提供依據[2]。目前,關于正常精子濃度與低精子濃度的精子凋亡率及生精細胞脫落狀態報道極少,本文對此進行分析并進一步探討其在男性不育實驗診斷中的應用價值。

一、資料與方法

1.研究對象:回顧性分析2022年8～12月于北京美中宜和北三環婦兒醫院生殖男科就診的861例不育癥患者的臨床資料。根據世界衛生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5版)》的參考標準[3]將納入患者按照不同精子濃度分為兩組:精子濃度≥15×106個/ml的為正常精子濃度組(n=775),精子濃度<15×106個/ml的低精子濃度組(n=86)。

2.精液標本采集及檢測:禁欲2～7 d后,采用手淫法取精。將精液放置于37℃水浴箱內,待完全液化后,充分混勻后進行檢測。采用北京穗加軟件提供的計算機輔助精子分析(CASA)系統,分析精子濃度及活動率。采用精子染色液(Diff-Quik)試劑盒(深圳華康生物),分析精子形態并嚴格按照操作流程及WHO手冊所給出的評估標準[3]進行分類計數,每張涂片至少評估200個精子,并計數正常和異常及頭部缺陷、中段缺陷、主段缺陷及過量殘留胞質精子的百分率。每張涂片評估兩次,以確保兩次結果無較大差異,計數200個精子內頭部暗染、固縮(凋亡)精子所占的比例分析精子凋亡率。并計數在200個精子范圍內精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞及精子細胞的脫落數量及占比情況。

二、結果

1.一般資料:與正常精子濃度組比較,低精子濃度組精子活動率和正常形態精子率顯著降低,精子凋亡率顯著升高(P<0.05),兩組間患者年齡比較無顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般資料比較(-±s)

2.生精細胞比較:在正常精子濃度組中共檢出995個生精細胞,平均每例檢出1.28個生精細胞(200個精子范圍內);而低精子濃度組中共檢出440個生精細胞,平均每例檢出5.12個生精細胞(200個精子范圍內)。正常精子濃度組生精細胞檢出率顯著低于低精子濃度組(P<0.05),兩組間各級生精細胞占比情況均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間生精細胞檢出率及各級生精細胞占比情況比較(%)

三、討論

精子的數量、活力及形態分析是評價精液質量最為經典的3個參數,各參數之間密切聯系,即使精子濃度或(和)活力正常,形態缺陷也可能影響精子受精能力,且為最重要的單一因素。精子形態是精子的外貌特征,在一定程度上亦是反映精子優劣的基礎。WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(第6版)[4]強調,精子形態學的評估價值不僅可用于判斷自然妊娠和輔助生殖技術(ART)結局的預后,還可以為睪丸和附睪功能判斷提供更多有診斷價值的信息。因此,在遵循精子形態學標準化評估的同時,對其各部位的缺陷特征與潛在疾病的關系應給予更多關注。特別是對于某些特異性畸形精子、凋亡精子及生精細胞的檢出,臨床上應給予重視。

Diff-Quik染色法是WHO推薦的精子形態學染色方法之一,因其簡單快速的特征在各實驗室廣泛應用。Diff-Quik染色法不僅可以觀察精子和生精細胞的形態,還可以通過精子頭部暗染程度來判斷和計數精子的凋亡率,在每張精子涂片中都可以看到淺色(正常染色模式)和深色(暗染、固縮)染色的精子頭部,后者則代表異常染色質狀態,屬于細胞凋亡的形態學特征,為精子DNA損傷的結果和表現[5]。精子頭部顏色較暗,其發生機制可能與精子DNA鏈斷裂或壓縮異常有關,最終導致染料結合位點增多而出現暗染狀態。精子凋亡在精子發生過程中是一個重要特征,自發性凋亡在維持精子的數量和質量方面非常重要,而誘發過多的精子凋亡則屬于病理現象,是導致精子DNA損傷的機制之一。精液中可以看到各種形態的凋亡精子,尤其以小頭精子最為常見;小頭精子常伴有頂體發育異常,這也是導致受精失敗的重要原因。雖然凋亡精子有一定的活力存在,但自身細胞結構已發生了變異,凋亡精子比例越高,發生不育的風險亦升高。末端脫氧核苷酸轉移酶脫氧尿嘧啶缺口末端標記法(TUNEL)主要用于特異性檢出精子凋亡引起的DNA損傷,靈敏度高,可用于精子DNA損傷的量化分析。有研究發現,Diff-Quik染色后,暗染精子(凋亡)百分率與TUNEL陽性精子比例呈現顯著相關性[6-7]。當把精子暴露于可促進DNA斷裂和染色質解聚的條件下,如過氧化氫、高溫環境時,其暗染精子百分率也顯著增加。有學者建議將32%的暗染率作為胚胎發育和妊娠的預測閾值,且該閾值與精子染色質結構分析法(SCSA)所建議的閾值(精子DNA碎片化指數≥30%)非常接近[7-8]。因此,當實驗室缺乏成熟可靠的精子DNA檢測方法時,Diff-Quik染色可作為評估精子異常染色質的一種參考指標,但此方法具有一定的主觀性,染色時間過長可影響評估結果,規范化培訓可減少結果的可變性。

在不同精子濃度精液中,精子凋亡均有一定的發生率。本研究結果發現,低精子濃度組不僅表現為精子活動率和正常形態精子百分率降低,而且精子凋亡率也顯著高于正常精子濃度組(P<0.05)。低精子濃度患者常因睪丸生精功能低下引起,病因眾多且復雜,有害因素可直接或間接的造成睪丸及附屬腺體受損、內環境紊亂、生精功能障礙等,這可能是導致精子數量較少,精子凋亡率增高的重要原因。引發精子凋亡異常的機制較為復雜,而精子的“凋亡逃逸”可能會使具有DNA損傷的生精細胞逃避某些凋亡途徑,并進一步分化為攜帶損傷DNA的成熟精子[9]。另外,生精細胞凋亡主要由生精細胞表面的腫瘤壞死因子受體超家族成員6(Fas)和支持細胞表面的Fas配體通過Fas/FasL途徑介導,Fas/FasL途徑可能是控制精子凋亡的重要途徑[10]。卵胞漿內單精子注射技術(ICSI)的使用可以使卵母細胞在不依賴于精子形態學的情形下完成受精,這在一定程度上削弱了精子形態學分析的臨床應用價值。由于精子缺陷的部位、受損程度及凋亡率不同,其生育結局可能有所不同。精子凋亡率升高必然會增加精子挑選困難,而凋亡精子的注入將可能誘導胚胎發生凋亡、囊胚形成率降低,繼而引起胚胎發育異常、早期流產甚至異常缺陷等的發生概率增加[11]。特別是對于一些因精子數量少而無法進行精子DNA檢測的精液標本,精子形態凋亡率分析可能對ICSI治療預后判斷有一定的參考價值。

正常精液中可見大量精子和少量生精細胞,各級生精細胞按數量、比例有序排出,呈常態脫落。由于睪丸受損的時間、程度及導致受損的因素不同,其生精細胞的脫落狀態及臨床表現也不盡相同[12]。本課題組研究發現,低精子濃度組精液中生精細胞的檢出率顯著高于正常精子濃度組(P<0.05),且平均每例精液生精細胞檢出的數量(200個精子范圍內)為正常精子濃度的4倍。在低精子濃度組中,生精細胞的檢出主要以精子細胞最為常見,初級精母細胞次之,精原細胞和次級精母細胞較為少見,與正常精子濃度組比較,各級生精細胞的脫落比例均未見顯著差異(P>0.05),說明生精細胞脫落增多是睪丸受損的敏感信號,是導致精子生成受阻、數量減少的重要原因,雖然各級生精細胞的比例并未表現出異常,但在部分低精子濃度精液中,仍可以觀察到生精細胞阻滯(部分)在初級精母細胞或精子細胞階段。在低精子濃度精液中,生精細胞常表現為凋亡特征,而凋亡的發生涉及一系列基因的激活、表達及調控等機制,其本質是更好的適應生存環境而主動采取的死亡過程。睪丸生精功能障礙的病程發展,必定有初始-受損-輕度-中度-重度的病變過程,生精細胞脫落也必然有早期、中期、高峰期和空化期的不同表現,以至精子數量的多寡及形態學的改變與睪丸損傷程度密切相關。如何及時、有效地控制生精細胞的持續性脫落仍是臨床上關注的重點和難點;而生精細胞的動態變化,可作為療效觀察和判斷預后的重要指標。

綜上,Diff-Quik染色不僅可以觀察精子的形態,還可以評估精子凋亡及生精細胞脫落狀態。特別是對于低精子濃度患者,進行精液生精細胞和精子凋亡率檢查,對進一步了解睪丸生精功能受損程度及精子異常染色質狀態有著重要價值。精液細胞學分析已進入推廣和應用階段,可以在推廣和實踐中不斷地深入、豐富、糾正和完善。而凋亡精子分類在臨床上的應用前景仍值得繼續關注、探討和總結。