年輕卵巢儲(chǔ)備功能減退患者囊胚非整倍體率及妊娠結(jié)局的分析

宋雪梅，鄧星，袁振亞，嚴(yán)為巧，黃曉潔，袁牧*

(1.徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,徐州 221009;2.宜春市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心,宜春 336000)

卵母細(xì)胞質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)(ART)助孕治療中能否成功妊娠的關(guān)鍵因素之一。目前在實(shí)施ART前一般會(huì)對(duì)患者的卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)估,包括患者年齡、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)和抗苗勒管激素(AMH)等[1-2]。隨著女性年齡增加,卵巢儲(chǔ)備功能逐步下降。近年來關(guān)于卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)的研究主要集中在不同促排卵方案在DOR患者中的應(yīng)用效果[3-4],以及雄激素、輔酶Q10、生長(zhǎng)激素等預(yù)處理方法對(duì)于DOR患者的輔助治療[5]。之前有文獻(xiàn)報(bào)道,ART治療中35歲以下婦女每周期的活產(chǎn)率為32.2%,35至37歲婦女為26.2%,38至40歲婦女則進(jìn)一步下降,僅為18.5%[6],故本研究中將年輕女性特指為<38歲的女性。Morin等[7]研究報(bào)道年齡<38歲DOR女性活產(chǎn)率低于卵巢儲(chǔ)備功能正常患者的原因是其每個(gè)周期獲得的卵母細(xì)胞數(shù)量少而非其卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能差。但對(duì)于年輕(<38歲)DOR女性,其卵巢儲(chǔ)備功能的過早減退是否會(huì)引起卵母細(xì)胞質(zhì)量下降及增加胚胎染色體非整倍體率風(fēng)險(xiǎn)的研究報(bào)道仍較少。胚胎植入前非整倍體遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-A)是在胚胎植入宮腔前進(jìn)行染色體數(shù)目的檢測(cè),以篩查非整倍體胚胎,挑選染色體正常的胚胎植入子宮,從而降低早期流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[8]。本研究通過對(duì)因反復(fù)自然流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴(yán)重畸精子癥行PGT-A的年輕DOR患者進(jìn)行研究,探討年輕女性DOR是否會(huì)影響胚胎的染色體非整倍體率,并進(jìn)一步觀察整倍體囊胚移植后胚胎的繼續(xù)發(fā)育潛能。

一、資料與方法

1.研究對(duì)象:回顧性分析2020年1月至2022年9月在徐州市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT-A患者的臨床資料,共計(jì)180例患者(243個(gè)周期),共收集達(dá)活檢標(biāo)準(zhǔn)的囊胚737枚。將納入患者按照是否存在DOR分為對(duì)照組(155例,196個(gè)周期)和DOR組(25例,47個(gè)周期)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床診斷為DOR[9](bFSH≥10 U/L,AFC≤5～7個(gè),AMH≤1.1 ng/ml);(2)女方年齡<38歲;(3)反復(fù)種植失敗(移植次數(shù)≥3次或累計(jì)移植≥4～6個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎或≥3個(gè)高評(píng)分囊胚仍未種植);(4)反復(fù)自然流產(chǎn)(≥2次自然流產(chǎn));(5)嚴(yán)重畸精子癥。其中DOR組納入標(biāo)準(zhǔn)滿足(1)(2)的同時(shí)需滿足(3)或(4)或(5),對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)滿足(2)的同時(shí)需滿足(3)或(4)或(5)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)卵巢手術(shù)史;(2)單基因病;(3)夫婦一方染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常;(4)手術(shù)取精者;(5)存在其它影響妊娠及流產(chǎn)因素者。所有行PGT-A的患者均簽署知情同意書。本研究將非整倍體及嵌合體胚胎的移植排除在研究范圍之外。

2.研究方法:(1)體外受精及囊胚培養(yǎng):常規(guī)促排卵后B超引導(dǎo)下穿刺取卵,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后拆除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞,MⅡ期卵母細(xì)胞行ICSI授精,使用G-TLTM一步式培養(yǎng)液(Vitrolife,瑞典)進(jìn)行胚胎培養(yǎng),在時(shí)差成像培養(yǎng)箱(Embryo Scope+,Vitrolife,瑞典)內(nèi)培養(yǎng)至囊胚。(2)囊胚活檢和PGT-A:采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]對(duì)囊胚進(jìn)行分級(jí),評(píng)分≥3BC或3CB的囊胚用活檢針取3～5個(gè)囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞后按照玻璃化冷凍試劑盒(加藤,日本)操作說明進(jìn)行玻璃化冷凍。活檢細(xì)胞全基因組擴(kuò)增采用胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒,二代測(cè)序采用Illumina測(cè)序平臺(tái)(北京嘉寶仁和),其中整條染色體異常、4 Mb及以上的拷貝數(shù)變異和染色體異常比例大于80%的囊胚為非整倍體囊胚,異常比例20%～80%的囊胚為嵌合體囊胚。(3)解凍周期移植及妊娠結(jié)果判定:采用人工激素替代周期準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜,所有患者均進(jìn)行單囊胚移植,于移植日給予黃體支持,移植術(shù)后5周行B超檢查,宮內(nèi)見孕囊及原始心管搏動(dòng)者判定為臨床妊娠,孕28周后的活胎分娩視為活產(chǎn)。(4)觀察指標(biāo):患者的基本資料(年齡、不孕年限、AFC、bFSH、AMH、bE2等)、胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)(2PN率、囊胚形成率、活檢囊胚整倍體率等)及妊娠結(jié)局(臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等)。2PN率=正常受精胚胎數(shù)/獲卵數(shù)×100%,囊胚形成率=總囊胚數(shù)/正常受精胚胎數(shù)×100%,可用囊胚形成率=活檢囊胚數(shù)/正常受精胚胎數(shù)×100%,整倍體率=整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,非整倍體率=非整倍體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,嵌合體率=嵌合體囊胚數(shù)/活檢囊胚數(shù)×100%,臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%,活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

二、結(jié)果

1.患者基本資料比較:兩組患者的年齡、不孕年限和bE2均無顯著性差異(P>0.05);DOR組的AFC和AMH顯著低于對(duì)照組(P<0.01),而bFSH水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者基本資料比較(-±s)

2.患者胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較:DOR組與對(duì)照組相比,2PN率、囊胚形成率、可用囊胚形成率和活檢囊胚整倍體率、嵌合體率均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者胚胎實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較(%)

3.患者移植整倍體囊胚后的妊娠結(jié)局比較:對(duì)照組有125個(gè)周期進(jìn)行了單囊胚移植,DOR組有20個(gè)周期進(jìn)行了單囊胚移植。移植周期的患者年齡、不孕年限、子宮內(nèi)膜厚度及優(yōu)質(zhì)囊胚移植周期比例(移植D5/D6優(yōu)質(zhì)囊胚周期占移植周期比例)均無顯著性差異(P>0.05);臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率亦無顯著性差異(P>0.05)(表3)。至撰稿時(shí)對(duì)照組隨訪發(fā)現(xiàn)宮外孕1例,胎兒畸形1例,活胎分娩51例;DOR組隨訪無宮外孕和胎兒畸形,活胎分娩7例,余在繼續(xù)隨訪中。需要說明的是納入本研究的25例年輕DOR患者形成的囊胚行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)后有3例患者沒有可移植胚胎,其中2例行2個(gè)周期促排卵分別獲1枚和3枚可供活檢的囊胚但均為非整倍體囊胚,另外1例行3個(gè)周期均未形成囊胚。

表3 兩組患者整倍體囊胚移植周期的一般資料及妊娠結(jié)局比較[(-±s),%]

討 論

生理狀態(tài)下女性卵巢內(nèi)原始卵泡隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸閉鎖、退化[1]。本研究結(jié)果顯示,雖然年輕(<38歲)DOR患者其AMH和AFC均顯著低于對(duì)照組、bFSH顯著高于對(duì)照組(P均<0.05),但兩組間臨床妊娠率和活產(chǎn)率并無顯著性差異(P>0.05)。說明對(duì)于年輕DOR患者而言,AMH、bFSH和AFC等指標(biāo)評(píng)估的是雙側(cè)卵巢內(nèi)存儲(chǔ)的原始卵泡數(shù)量,并不等同于卵母細(xì)胞質(zhì)量。這與2020年Tiegs等[11]的研究報(bào)道一致,其發(fā)現(xiàn)年輕DOR女性(<35歲,AMH<1.0 ng/ml)行宮腔內(nèi)人工授精(IUI)的妊娠結(jié)局與年輕卵巢儲(chǔ)備功能正常的患者相似。還有研究發(fā)現(xiàn)在接受IVF治療的女性中,DOR與活產(chǎn)率不存在相關(guān)性[12-13]。因此,不推薦無輸卵管梗阻等不孕因素的育齡期年輕女性行常規(guī)卵巢功能評(píng)估,避免引起不必要的焦慮恐慌情緒。

PGT-A適應(yīng)證包括高齡、反復(fù)自然流產(chǎn)、反復(fù)種植失敗和嚴(yán)重畸精子癥等[14-15]。此前有文獻(xiàn)對(duì)不同PGT-A指征患者形成囊胚的非整倍體率和妊娠結(jié)局進(jìn)行研究,認(rèn)為年齡大于40歲女性患者形成的胚胎染色體非整倍體率顯著增加,而反復(fù)種植失敗患者的非整倍體率和活產(chǎn)率與反復(fù)自然流產(chǎn)患者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[16-17]。2023年,本中心一項(xiàng)研究的結(jié)果顯示年齡<38歲的反復(fù)種植失敗、反復(fù)自然流產(chǎn)和嚴(yán)重畸精子癥患者的胚胎整倍體率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]。本研究依據(jù)卵巢儲(chǔ)備功能情況對(duì)行PGT-A的患者進(jìn)行分組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOR組與對(duì)照組患者的2PN率、囊胚形成率和可用囊胚形成率均無顯著性差異,但因AFC顯著低于對(duì)照組,DOR患者單次促排卵獲卵數(shù)少。因此,DOR組的患者往往需要多次取卵才能獲得可利用的整倍體囊胚進(jìn)行移植。本研究納入DOR組的25例患者共47個(gè)周期,其中16例患者需進(jìn)行≥2次促排卵周期來積攢胚胎。因此,建議DOR年輕患者盡早完成生育計(jì)劃。但本研究納入的DOR患者樣本量偏少,年輕DOR患者對(duì)胚胎非整倍體率的影響仍需要后期多中心大樣本研究的支持。

本研究結(jié)果顯示年輕DOR患者與卵巢儲(chǔ)備功能正常患者囊胚染色體整倍體率和活產(chǎn)率比較無顯著性差異(P>0.05),提示年輕DOR患者卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞數(shù)目減少并不顯著影響胚胎的繼續(xù)發(fā)育潛能。若DOR患者一次促排卵無整倍體囊胚可移植,可以通過增加取卵次數(shù)來增加累計(jì)獲卵數(shù)以獲得更多可用于受精的成熟卵母細(xì)胞。有學(xué)者分別對(duì)年齡<38歲和≤40歲的DOR患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn),DOR組與卵巢儲(chǔ)備功能正常的患者相比囊胚整倍體率和活產(chǎn)率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[7,19],本研究結(jié)果與其一致。2021年,Jaswa等[8]研究顯示≤42歲DOR患者胚胎整倍體率顯著低于卵巢儲(chǔ)備功能正常的對(duì)照組,但按不同年齡分組(<35歲、35～37歲、38～40歲、40～42歲)統(tǒng)計(jì)的DOR患者胚胎整倍體率與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,可能的原因是DOR組平均年齡顯著高于對(duì)照組所致(39.5歲 vs. 37歲),因?yàn)楦啐g患者本身卵母細(xì)胞質(zhì)量下降影響了活檢囊胚的整倍體率。因此,本研究中剔除了引起卵母細(xì)胞質(zhì)量降低的生理性高齡因素來研究DOR人群。

綜上所述,年輕DOR女性雙側(cè)卵巢內(nèi)儲(chǔ)備的原始卵泡數(shù)量減少與卵母細(xì)胞質(zhì)量的好壞并無相關(guān)性,且并不影響囊胚的整倍體率和活產(chǎn)率,但因卵巢功能的衰退速度無法預(yù)估,建議有生育要求的年輕DOR女性盡早生育。