特醫食品精優能緩解小鼠卵巢早衰發生的研究

馮艷芹，劉璇，劉曉婷，沈偉，李蘭

(青島農業大學生命科學學院/生殖科學研究院,青島 266109)

POF的發生主要與機體內氧化應激水平相關[10]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)又稱輔酶1,是氧化反應中必不可少的輔酶,具有有效的抗氧化作用[11]。大量研究報道,提高機體內NAD+的水平能夠有效改善卵巢功能、提高卵泡及卵母細胞數量[12-13]。NDA+無法直接通過口服補充,但是補充NAD+前體,如煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)、煙酸(niacin,NA)、煙酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)和煙酰胺(nicotinamide,NAM)能有效提高NAD+水平。有報道稱,補充NA和NAM能夠降低卵母細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,有效改善卵母細胞質量[14-16]。此外,Wang等[17]發現,通過補充NA可以提高卵巢對氧化應激的反應能力,抑制細胞凋亡進而提高卵巢儲備功能。除了NAD+前體外,Li等[18]發現卵母細胞體外培養過程中添加蝦青素(一種天然抗氧化劑)能夠提高抗氧化酶表達水平,維持卵泡及卵母細胞存活。由此可見,額外補充抗氧化劑能夠有效改善機體內的氧化應激狀態,提高卵巢功能。

單一藥物的抗氧化能力有限,而精優能(包含了NAD+前體、蝦青素、β胡蘿卜素、核黃素等抗氧化劑)作為一種特殊的醫學用途配方食品(特醫食品),能較好地滿足特定人群對營養素或者膳食的特殊需要。相較于普通食品,特醫食品營養相對豐富,營養配比更合理、均衡,有利于提高患者的整體健康水平,為疾病的治療提供良好的基礎[19]。本研究對POF模型小鼠持續灌胃28 d精優能,通過觀察其生殖系統的表型以及氧化應激等相關指標,探究精優能對POF發生的緩解作用。

材料與方法

一、實驗動物

本實驗所用實驗動物為ICR小鼠(購買于濟南實驗動物中心)。小鼠集中飼養于青島農業大學實驗動物房,保證適宜的溫度和濕度、充足的食物和飲用水。小鼠飼養及操作遵守實驗動物管理條例,符合倫理規范。本研究經學院倫理委員會批準。

二、主要試劑

精優能(女士型),由同方藥業集團提供,主要有效成分如表1所示。白消安(B2635;Sigma,美國);M2操作液(CE003;中國邁晨科技)、M16培養液(M7292;Sigma,美國);RNA快速提取試劑盒(AC0202;山東思科捷生物);兔抗小鼠Vasa同源體(mouse vasa homologue,MVH)多克隆抗體(ab13840;Abcam,美國)、兔抗小鼠骨形態生成蛋白15(BMP15)多克隆抗體(ab108413;Abcam,美國)、兔抗小鼠抗苗勒管激素(AMH)多克隆抗體(DF13527;Affinity,美國)、兔抗小鼠谷胱甘肽過氧化酶4(GPX4)多克隆抗體(A1933;武漢愛博泰克生物科技);DAB顯色液(ZLI-9017;北京中杉金橋)和化學發光試劑盒(P0018;上海碧云天生物技術)。

表1 精優能女士型主要有效成分及其功能

表1 精優能女士型主要有效成分及其功能

成分化學分子式功能NAMC6H6N2O參與能量代謝、抗氧化NAC6H5NO2參與能量代謝、抗氧化蝦青素C40H52O4抗氧化、抗炎癥、抗癌β胡蘿卜素C40H56抗氧化、抗癌癥核黃素C17H20N4O6參與能量代謝、抗氧化

三、實驗方法

1.小鼠處理方法:本實驗使用3周齡ICR雌鼠,按照體重進行單次200 mg·kg-1·d-1的白消安腹腔注射,建立POF小鼠模型。然后將POF鼠分成5組:一組進行持續28 d的PBS灌胃,作為模型對照組(B組);其余4組小鼠每天按照體重分別灌胃50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的精優能,持續28 d,標記為B+50、B+100、B+200、B+400組。另外,設立不注射白消安的空白對照組(CTRL組),PBS持續灌胃28 d。收集7周齡小鼠生殖器官樣本,通過對生殖器官臟器指數(臟器重量與體重之比)進行統計,分析精優能緩解POF的最適濃度。然后,以最適濃度(200 mg·kg-1·d-1)再次進行POF挽救,通過觀察生殖表型、氧化應激水平等指標,探究精優能對POF發生的影響。

2.小鼠卵巢石蠟切片與免疫組織化學染色:收集各組小鼠的卵巢,進行固定、沖水、梯度脫水、浸蠟、包埋、切片。得到白片后,進行二甲苯脫蠟、梯度復水、檸檬酸抗原修復;待抗原修復液自然冷卻后,洗滌并進行封閉(30 min)、孵育一抗(生殖細胞標記蛋白MVH)(4℃過夜)、孵育二抗(37℃,45 min);二抗孵育結束,再次洗滌后,按每張片子100 μl滴加顯色液,靜置1 min后,在體視顯微鏡下觀察染色情況;后經過PBS洗滌、蘇木精染色、藍化、復水、二甲苯透明、中性樹脂封片,得到可用于進行卵泡統計的卵巢切片,待鏡檢觀察。

3.GV期卵母細胞收集與體外培養:取7周齡小鼠卵巢,在M2操作液中剁碎卵巢,用口吸管將GV期卵母細胞撿出,移入M16培養液中,在37℃、5%CO2培養箱中進行培養,4 h后觀察生發泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)的卵母細胞比例,12 h后統計第一極體排出(first polar body extrusion,PBE)的卵母細胞比例。

4.實時定量熒光PCR(RT-qPCR):按試劑盒步驟對新鮮卵巢組織進行RNA提取,并將各組RNA濃度調至一致,再按試劑盒要求將RNA反轉為cDNA。配制RT-qPCR體系(20 μl),包含SYBR qPCR Master Mix、無酶無菌水、目的基因引物、cDNA,反應條件為5℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min,進行40個循環,檢測卵泡發育相關基因Bmp15、Gdf9、Amh和抗氧化酶相關基因Sod2、Cat、Gpx4的表達水平。以Gapdh為管家基因,用2-ΔΔCt法計算mRNA水平。目的基因的PCR引物序列如表2所示。

為解決地級以上市行政區域交界河段執法問題，廣東省組織主要江河沿線的地級以上市水務局簽訂了交界河段聯合執法協議，在屬地管理原則的前提下，進一步明確了工作職責和工作配合，努力消除執法的盲點。廣東與廣西交界的西江界首河段也簽訂了河道采運砂監管聯合執法協議，并進行了多次協作執法。

表2 各基因的PCR引物序列(5’-3’)

5.蛋白免疫印跡技術(Westerm Blot,WB):新鮮卵巢組織加入蛋白裂解液,進行充分裂解后,離心收集上清液,并加入上清液1/4量的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水煮5 min,制備蛋白上樣液;在恒壓100 V下進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳;隨后,在恒流300 mA下,將目標蛋白轉到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上,進行PVDF膜的封閉、洗滌以及目標抗體(BMP15、AMH和GPX4)孵育;最后,使用化學發光液顯色,檢測BMP15、AMH以及GPX4的蛋白水平。以GAPDH作為內參蛋白,統計目標蛋白表達量。

四、統計學處理及方法

結 果

一、不同濃度精優能對POF小鼠體重及臟器指數的影響

為探究不同濃度精優能對POF發生的挽救作用,本研究對持續灌胃28 d的各組小鼠進行體重檢測。結果發現,白消安處理的POF模型鼠以及灌胃精優能的POF鼠,體重無顯著差異(P>0.05)(表3)。此外,我們還觀察了7周齡小鼠生殖器官的形態,結果顯示,各組小鼠卵巢和子宮形態沒有明顯差異(圖1)。

A:7周齡小鼠卵巢形態圖;B:7周齡小鼠子宮形態圖。圖1 各組小鼠卵巢及子宮形態圖

表3 各組小鼠體重及生殖器官臟器指數比較(-±s)

通過統計臟器指數發現,白消安注射會造成小鼠卵巢和子宮指數顯著降低(P<0.05),但在灌胃28 d的200 mg·kg-1·d-1(B+200組)或400 mg·kg-1·d-1(B+400組)精優能后,小鼠的臟器指數較B組顯著提高(P<0.05)(表3)。

二、精優能對POF小鼠卵巢儲備功能的影響

上述結果發現,灌胃一定濃度(200 mg·kg-1·d-1或400 mg·kg-1·d-1)的精優能,能夠顯著提高POF模型小鼠卵巢和子宮指數(P<0.05)。為了明確精優能對POF發生的影響,接下來主要探究200 mg/kg精優能對POF小鼠卵巢儲備的挽救效果,并額外設置了非POF模型單獨灌胃28 d精優能(200 mg·kg-1·d-1)的組別:CTRL+200(C+200)組。

分析卵巢切片及卵泡計數發現:B組、CTRL組、B+200組間比較,各級卵泡比例均無顯著差異(P>0.05);各組總卵泡數分別為CTRL組(380.0±61.62)枚、B組(102.3±15.35)枚、B+200組(163±27.93)枚、C+200組(372.3±83.35)枚。B組總卵泡數較CTRL組顯著減少(P<0.01);B+200組卵泡總數較B組顯著增加(P<0.05)(圖2A、2B、2C)。

A:孵育MVH抗體后的小鼠卵巢切面及各級卵泡形態(棕色示MVH陽性細胞,即卵母細胞),右側列示各級卵泡典型圖像(PmF:原始卵泡;PF:初級卵泡;SF:次級卵泡;AF:有腔卵泡);B:各組卵泡總數統計圖;C:4組間各級卵泡比例統計圖。與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖2 精優能改善POF小鼠卵巢儲備

此外,RT-qPCR結果顯示,與B組相比,B+200組卵泡生長相關基因(Gdf9、Bmp15)及卵巢儲備相關基因(Amh)表達量顯著升高(P<0.01)。同時,WB檢測結果顯示,灌胃精優能后卵巢組織中BMP15和AMH的蛋白水平也顯著提高(P<0.05)(圖3)。提示精優能補充能夠改善POF小鼠的卵巢儲備功能。

A:各組相關基因mRNA表達水平比較:與B組比較,#P<0.01;B:各組中BMP15和AMH蛋白表達水平比較:與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖3 精優能改善POF小鼠卵泡發育及卵巢儲備相關基因的表達水平

三、精優能對卵母細胞數量及發育潛能的影響

在結果二中,我們發現精優能能夠增加卵泡數量、改善卵巢儲備,但其對POF小鼠卵母細胞發育潛能是否有影響還有待繼續研究。因此,本實驗收集了7周齡小鼠GV期卵母細胞進行體外培養,觀察其發育情況(圖4);并對GV期卵母細胞數量、GVBD率以及PBE率進行統計分析,結果發現,200 mg·kg-1·d-1的精優能能夠顯著增加POF小鼠GV期卵母細胞數量(P<0.05),促進了POF小鼠第一極體排出(P<0.05)(表4)。

圖4 7周齡小鼠卵母細胞發育情況(比例尺:100 μm)

表4 不同處理各組小鼠卵母細胞成熟指標的比較(-±s)

四、精優能對POF小鼠抗氧化能力的影響

為了探究精優能是否是通過抗氧化作用緩解白消安造成的POF,我們檢測了幾種常見的抗氧化酶的表達水平。結果發現,與B組相比,B+200組卵巢組織內Sod2、Cat和Gpx4 mRNA水平均顯著升高(P<0.05),GPX4蛋白水平也顯著增加(P<0.05)(圖5),提示精優能可以有效提高卵巢內抗氧化能力。

與B組比較,*P<0.05,#P<0.01。圖5 各組小鼠卵巢組織內抗氧化酶表達水平比較

討 論

大量研究證實,體內外各種不利因素會造成卵巢內卵泡數量降低、卵母細胞質量下降,最終導致卵巢功能衰竭,如POF[4,9,20]。其中,化療造成的POF格外普遍。現階段,有大量化療藥物用于構建POF小鼠模型,如順鉑、環磷酰胺、白消安等[8-9]。白消安是極少數能夠在3歲以下兒童中使用的化療藥物之一,但對生殖能力有著嚴重損傷[21-22]。已有研究報道,白消安能夠影響卵巢儲備及卵母細胞質量[1]。本研究也發現,與空白對照組相比,注射白消安后,小鼠卵巢及子宮指數明顯降低、卵泡及卵子數量也顯著減少,呈現典型的POF癥狀。

臨床上常常使用激素補充治療來改善POF,但激素治療存在依賴性,并且長期激素補充有可能造成腺癌、冠心病、中風等疾病[4,23]。近年來的研究發現,通過移植骨髓、臍帶血等間充質干細胞也可以有效改善POF[24-26],但其臨床試驗還未成熟。因此,尋求有效緩解POF的方法格外重要。

從POF發生機制上而言,ROS水平升高是誘發POF的潛在原因之一[10,27]。本研究發現,持續灌胃28 d精優能后,能夠降低白消安引起的POF小鼠的氧化應激水平,增加Cat、Gpx4等抗氧化酶的表達水平,有效緩解白消安誘發的POF小鼠卵巢及子宮指數、卵泡數量及卵母細胞成熟率的下降。這與先前的一些關于NAD+改善POF的研究結論[15,17,28]相一致。本研究發現,補充抗氧化劑尤其是復合型的抗氧化劑,可以有效改善化療等因素引起的POF,也為臨床POF患者提供了有效的食用級候選治療產品。事實上,NA、NAM不僅能夠改善POF,在生物醫學其他方面也有潛在的應用前景,包括抗腫瘤、抗炎癥、抗衰老等[29-30]。然而,需要注意的是,有研究稱,補充過量NAM會造成生物毒性,影響卵母細胞減數分裂進程。因此,關于NAD+前體在人類中的應用,還有待加強機制探索和有效監督。

綜上,本研究表明,持續28 d灌胃200 mg·kg-1·d-1的精優能,能夠通過降低POF小鼠卵巢內氧化應激水平,緩解POF小鼠生殖器官指數下降、卵泡及卵子數量降低,并有效維持卵母細胞發育潛能,有效緩解POF的發展過程。