基于廣義相加模型分析血清AMH對ART治療中獲卵數(shù)和累計活產(chǎn)結(jié)局的效應(yīng)研究

張玲，周佳，呂松杰，潘暉

(烏魯木齊友愛醫(yī)院,烏魯木齊 830000)

抗苗勒管激素(AMH)是由卵泡中的顆粒細胞分泌的二聚體糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)化生長因子β家族中的一員[1]。在整個女性的生育周期過程中,AMH在體內(nèi)的表達發(fā)揮著調(diào)控始基卵泡、保持卵泡正常發(fā)育、維持“卵泡池”穩(wěn)定的重要作用[2-3]。在輔助生殖技術(shù)(ART)領(lǐng)域,許多研究表明,AMH在評估卵巢儲備能力、治療結(jié)局等方面均可能發(fā)揮一定的作用。但大多數(shù)研究僅限于激素水平與治療結(jié)局相關(guān)的定性分析,關(guān)于AMH在治療過程中的作用機制及變化趨勢均缺乏深入的研究[4-5]。同樣,可能是由于年齡或其它因素,AMH的作用是否有顯著意義仍存在爭議[6-7]。廣義相加模型(Generalized additive model,GAM)是廣義線性模型的擴展,可采取非參數(shù)的方法探索變量之間的非線性關(guān)聯(lián),在探索變量關(guān)系、建立預(yù)測模型中效果優(yōu)于傳統(tǒng)模型[8]。本研究利用GAM建模,按年齡分為年輕人群和高齡人群,對AMH在刺激后獲卵、累積活產(chǎn)兩個階段的結(jié)局影響進行評估,探索其在評估ART治療效果中的預(yù)測意義和指導(dǎo)價值。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2021年12月在烏魯木齊友愛醫(yī)院首次行ART治療的不孕女性的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)首次來我院行ART治療的患者;(2)僅包括IVF/ICSI周期的女性;(3)病歷記錄關(guān)鍵信息完整;(4)既往無子宮、卵巢等婦科手術(shù)史。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)患者取卵周期未完成;(2)使用夫精人工授精(AIH)等技術(shù)參與治療的患者;(3)血清AMH指標(biāo)信息缺失;(4)伴有多囊卵巢引起的Ⅱ型排卵障礙患者;(5)合并有心、肝、腎或神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病;(6)伴有卵巢早衰等疾病。

本研究共納入653例患者的653個周期。按照年齡不同分為<35歲的年輕組(457例)和≥35歲的高齡組(196例)。

二、研究方法

1.治療流程:根據(jù)患者的月經(jīng)周期和個人情況,采取長效促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑方案(長方案)、GnRH拮抗劑方案或其它方案促排卵。月經(jīng)周期第2～4天采用陰道B超檢查患者雙側(cè)卵巢的基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC,即直徑2～10 mm的卵泡),超聲檢查后依據(jù)患者體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AFC、卵泡刺激素(FSH)水平等選擇合適的重組人FSH注射液(默克,德國)劑量,促排卵期間行超聲檢查監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及抽血檢測性激素水平,根據(jù)以上結(jié)果及時調(diào)整FSH用量。若雙側(cè)卵巢2個以上卵泡直徑大于18 mm,給予重組人絨促性素(HCG)(上海麗珠)誘導(dǎo)卵泡成熟,扳機后36 h于陰道B超下取卵。取卵后采用不同方式進行授精,培養(yǎng)至D3或D5胚胎后進行新鮮胚胎移植,其余胚胎采用玻璃化冷凍保存;首次移植失敗的患者,第2次移植解凍胚胎,直至所有胚胎移植完畢。胚胎移植后采用常規(guī)黃體支持治療。

2.血清AMH檢測:月經(jīng)周期第2天或第3天抽取靜脈血2 ml,3 000 rpm離心10 min后取血清,使用電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH水平,所用儀器為羅氏全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(ECL2010,瑞士)。

3.資料收集:從臨床電子病歷記錄中篩選出符合要求的患者的基本資料及相關(guān)治療信息。基本資料包括女性年齡、BMI、既往流產(chǎn)史、不孕因素、不孕類型及不孕年限等;治療信息包括AFC、血清AMH值、促排卵用藥方案、受精方式、獲卵數(shù)和單次取卵累積活產(chǎn)率等,并以獲卵數(shù)和累積活產(chǎn)作為不同階段的結(jié)局指標(biāo)。根據(jù)患者的獲卵數(shù)信息,采用三分法將獲卵數(shù)分為“過少/正常/過多”3個等級,根據(jù)術(shù)中獲卵數(shù)的第25百分位數(shù)和第75百分位數(shù)將取卵周期分為3組:<7組、7～18組、>18組(對應(yīng)“過少/正常/過多”),并重新賦值為1/2/3。活產(chǎn)指妊娠≥28周且胎兒出生時存活,累積活產(chǎn)指單個取卵周期所有胚胎移植后的總活產(chǎn)。活產(chǎn)的賦值為1(活產(chǎn))/0(無活產(chǎn))。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用R(4.1.2)統(tǒng)計軟件進行建模與分析。計量資料采用中位數(shù)(四分位法)[M(P25,P75)]表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,采用卡方檢驗及確切概率法檢驗。使用AMH與結(jié)局指標(biāo)(獲卵數(shù)等級及累積活產(chǎn))建立平滑樣條函數(shù)的單因素GAM;對于協(xié)變量使用單因素回歸篩選顯著變量,將有意義的變量納入指定平滑樣條函數(shù)的GAM建立多因素模型,計算方差膨脹因子(VIF)排除有共線性(VIF>5)的變量。對于有序結(jié)局變量采用有序Logistic回歸,二分類結(jié)局變量采用二元Logistic回歸方法進行擬合。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本資料

本研究共納入653例患者的653個周期,年齡21～47歲,所有周期的累積活產(chǎn)率為40.7%。年輕組(457例)患者的平均年齡為31(29,32)歲,平均AMH為3.19(1.88,4.72) ng/ml,累積活產(chǎn)率達44.0%;年輕人群中,又以是否活產(chǎn)分為活產(chǎn)組與無活產(chǎn)組兩個亞組,兩亞組間的年齡、AFC、AMH水平、促排卵方案(長方案占比)及獲卵數(shù)比較,有顯著性差異(P<0.05)。高齡組(196例)患者的平均年齡為38(36,39)歲,平均AMH為2.50(1.15,3.95)ng/ml,累積活產(chǎn)率為33.2%;高齡人群亦分為活產(chǎn)組與無活產(chǎn)組兩個亞組,兩亞組間的年齡、AFC及獲卵數(shù)水平有顯著性差異(P<0.05)。患者的基本資料及治療參數(shù)比較見表1。

表1 不同年齡組患者活產(chǎn)及無活產(chǎn)亞組的基本資料及治療指標(biāo)比較[M(P25,P75),n(%)]

將653個周期按照是否活產(chǎn)分為活產(chǎn)組(266個周期)和無活產(chǎn)組(387個周期),其中活產(chǎn)組平均年齡32(29,36)歲,平均AMH為3.53(2.09,5.19)ng/ml,促排卵Gn啟動劑量為187.5(225.0,225.0)U,平均取卵數(shù)為13.0(8.5,19.0)枚,累積活產(chǎn)率為33.2%。兩組間年齡、促排卵方案(長方案及其他方案占比)、AFC及血清AMH水平比較,有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

表2 活產(chǎn)組與無活產(chǎn)組患者的基本資料及治療指標(biāo)比較[M(P25,P75),n(%)]

二、不同年齡組患者血清AMH水平對獲卵數(shù)的影響

將患者連續(xù)的獲卵數(shù)按照三分法重新定義變量,分別將獲卵數(shù)<7組、7～18組、>18組定義為“過少/正常/過多”,以獲卵數(shù)水平作為結(jié)局指標(biāo),采用GAM模型分別估計ART患者在年輕人群及高齡人群中血清AMH水平與獲卵數(shù)的關(guān)系。

年輕組:收集457例年齡<35歲的ART患者信息,基于有序多分類Logistic回歸,選擇平滑樣條函數(shù)擬合AMH值與獲卵數(shù)的單因素GAM模型。如表3所示,單因素模型中AMH值對最終的獲卵數(shù)水平有十分顯著的影響,AMH擬合平滑曲線的有效自由度(EDF)為4.259(P<0.001),表明這二者之間的影響是非線性的。其它協(xié)變量中通過單因素回歸篩選出的有意義變量,包括女性年齡、AFC、子宮內(nèi)膜異位、排卵障礙以及促排卵方案等,通過加入?yún)f(xié)變量建立多元GAM模型以校正AMH的作用。多元模型顯示,AFC、促排卵方案及AMH水平均為影響獲卵數(shù)的顯著因素,AFC增加可以提高獲卵數(shù),使用拮抗劑方案的患者相比長方案會獲得更少的成熟卵;其它協(xié)變量如年齡增長、存在排卵障礙或內(nèi)膜異位對于獲卵數(shù)都會產(chǎn)生負(fù)向效應(yīng),但無統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)過協(xié)變量校正后,AMH對于獲卵數(shù)仍呈現(xiàn)顯著的非線性影響,EDF=3.485(P<0.001),相比單因素模型曲線更為平坦。圖1顯示了單因素和多因素GAM模型中血清AMH值與獲卵數(shù)的曲線關(guān)聯(lián),當(dāng)AMH<2.7 ng/ml時,隨著AMH上升,個體獲卵數(shù)顯著增加;上升至接近2.7 ng/ml后,獲卵數(shù)變化趨于平穩(wěn);當(dāng)AMH超過5.8 ng/ml后,其對獲卵數(shù)的影響曲線又迅速上抬。

圖1 年輕人群中單因素(A)和多因素(B)GAM模型擬合血清AMH水平與獲卵數(shù)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)曲線

表3 GAM估計年輕人群AMH與獲卵數(shù)的關(guān)系

高齡組:收集196例年齡≥35歲的ART患者信息,采用同樣的方法進行建模。如表4所示,單因素模型表明AMH水平對于高齡人群的獲卵數(shù)亦有顯著影響,其產(chǎn)生效應(yīng)擬合曲線的EDF為3.385(P<0.001),影響是非線性的。將單因素回歸篩選出的有意義變量包括女性年齡、AFC以及促排卵方案等共同納入建立多元GAM模型。模型顯示,線性部分的AFC為影響獲卵數(shù)的顯著因素,AFC增加可以提高獲卵數(shù)。經(jīng)過協(xié)變量校正后,AMH的曲線效應(yīng)變得相對平穩(wěn),EDF=2.660(P<0.001)。圖2顯示了單因素和多因素GAM模型中高齡人群AMH水平與獲卵數(shù)的曲線關(guān)聯(lián),曲線呈倒U型,血清AMH水平在4～6 ng/ml之間對獲卵數(shù)提供的效應(yīng)最大。

圖2 高齡人群中單因素(A)和多因素(B)GAM模型擬合血清AMH水平與獲卵數(shù)的關(guān)聯(lián)效應(yīng)曲線

表4 GAM估計高齡人群AMH與獲卵數(shù)的關(guān)系

三、不同年齡組患者血清AMH水平對累積活產(chǎn)率的影響

分別收集年輕組和高齡組患者的治療信息及治療后的活產(chǎn)結(jié)局情況,采用GAM模型估計兩組患者中,血清AMH水平與累積活產(chǎn)結(jié)局的關(guān)系。

年輕組:將457例患者信息納入分析,采用基于平滑樣條函數(shù)的二元Logistic回歸方法,擬合AMH水平與累積活產(chǎn)的單因素GAM模型(表5)。單因素模型表明AMH水平對最終的累積活產(chǎn)率存在顯著影響,其效應(yīng)擬合平滑曲線的EDF為1.700(P=0.002),表明AMH與累積活產(chǎn)率可能存在非線性的關(guān)聯(lián)。通過單因素分析篩選出有意義的協(xié)變量,共同建立多元GAM模型并對各自變量計算VIF進行共線性診斷,所有變量的VIF均<5,表明模型中各變量間無共線性。通過多元模型對AMH的影響校正后發(fā)現(xiàn),AMH對累積活產(chǎn)提供的效應(yīng)不再顯著,EDF=1.000(P=0.878),二者的效應(yīng)呈直線關(guān)聯(lián)。圖3顯示了單因素和多因素GAM模型中AMH水平與累積活產(chǎn)的平滑曲線關(guān)聯(lián),單因素模型中隨AMH增加,其效應(yīng)增長逐漸平緩;多因素模型中AMH與效應(yīng)值的關(guān)系表現(xiàn)為直線。

表5 GAM估計年輕人群AMH與累積活產(chǎn)率的關(guān)系

圖3 年輕人群中單因素(A)和多因素(B)GAM模型擬合血清AMH水平與累積活產(chǎn)率的關(guān)聯(lián)效應(yīng)曲線

高齡組:將196例患者信息納入分析,采用與年輕組相同的方法建立累積活產(chǎn)的單因素和多因素模型(表6)。結(jié)果顯示,在單因素和多因素模型中,AMH水平對最終累積活產(chǎn)率的影響并不顯著,平滑曲線的EDF分別為3.672(P=0.275)和3.265(P=0.301),表明血清AMH與累積活產(chǎn)率可能存在非線性關(guān)聯(lián),但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表6 GAM估計高齡人群AMH與累積活產(chǎn)率的關(guān)系

四、建模擬合度評價

利用赤池信息量準(zhǔn)則(AIC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(BIC)指標(biāo)對模型的擬合度進行評估。高齡組的模型擬合表現(xiàn)普遍低于年輕組,這可能是因為納入兩個模型的有效自變量個數(shù)不同(表7)。

表7 GAM擬合度評價

討 論

近年來,血清AMH水平在女性生殖領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注。作為女性卵泡成熟的自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)因子,有研究表明AMH通過多條通路參與調(diào)節(jié)女性卵泡的生長與成熟[9]。在臨床應(yīng)用中,血清AMH水平作為一個臨床指標(biāo),在指導(dǎo)妊娠、診斷PCOS、預(yù)測早絕經(jīng)及卵巢早衰等方面體現(xiàn)出重要價值[10-11]。然而,AMH是否與相關(guān)疾病存在獨立的關(guān)聯(lián)以及是否存在有效的治療預(yù)測意義仍然存在爭議。ART作為解決不孕癥患者生育問題的新興技術(shù),為提高治療效果,探索妊娠結(jié)局的影響因素、為不同特征的患者提供個性化方案的呼吁逐漸受到重視[12]。因此,關(guān)于AMH是否與相關(guān)治療結(jié)局存在關(guān)聯(lián)及其預(yù)測價值需要進一步研究。為避免年齡因素以及PCOS疾病對關(guān)聯(lián)效應(yīng)的混雜,本研究納入653例接受ART治療的非PCOS不孕女性,按照年齡分為年輕組和高齡組,通過GAM探索在實行ART治療過程中,不同群體的血清AMH值與獲卵數(shù)及累積活產(chǎn)兩個結(jié)局指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)。

對于成年女性來說,女性年齡與AMH水平呈負(fù)相關(guān),隨著年齡的增長以及原始卵泡的消耗,血清AMH逐漸下降。Du等[13]為確定中國健康女性圍生理期血清AMH的正常參考值開展了全國范圍的多中心研究,指出AMH與年齡存在負(fù)相關(guān)關(guān)聯(lián),并提出二者可能表現(xiàn)為非線性的二次項關(guān)聯(lián)。Zhao等[14]還提出對于接受IVF治療的女性,在使用AMH預(yù)測妊娠率時應(yīng)考慮不同年齡的特異性。同時,年齡作為輔助生殖治療結(jié)局的獨立預(yù)測因素,35歲后的產(chǎn)婦年齡與胚胎非整倍體率、流產(chǎn)率增加和活產(chǎn)率降低的關(guān)聯(lián)密切[15-17],因此,在研究AMH與輔助生殖治療效果的關(guān)聯(lián)強弱時應(yīng)注意平衡年齡因素的影響。本研究中,以35歲作為分界線將患者分為年輕組和高齡組,在后續(xù)分析AMH對兩個結(jié)局指標(biāo)的作用時,年齡這一因素帶來的影響得到了有效平衡。此外,大多數(shù)研究對于AMH水平往往采用不同的分組標(biāo)準(zhǔn)簡單地進行截斷,這可能壓縮了AMH在人群中表現(xiàn)出的連續(xù)性分布提供的變量信息對結(jié)局的作用變化,從而導(dǎo)致許多研究結(jié)局沒有可比性[4-5,18-19]。基于AMH的連續(xù)性特征考慮,我們采用GAM探索AMH在輔助生殖的各階段結(jié)局中發(fā)揮的非線性效應(yīng)。GAM作為傳統(tǒng)廣義線性模型的擴展,不同于傳統(tǒng)模型默認(rèn)自變量與結(jié)局線性假設(shè)的前提,GAM允許自變量作為一個不加指定的平滑函數(shù),對模型采取非參數(shù)的非線性效應(yīng)估計[8,20]。在醫(yī)學(xué)研究中,GAM常用于探索變量間復(fù)雜的關(guān)系以及建立更準(zhǔn)確的預(yù)測模型。

盡管AMH是評估卵巢儲備能力的金標(biāo)準(zhǔn),但在與ART結(jié)局相關(guān)性的研究中仍然存在爭議。已有研究表明,AMH可以反映體內(nèi)的竇卵泡數(shù)量,且與促排卵刺激后的獲卵數(shù)成正比[5]。另有研究指出,AMH水平較低的年輕女性以及高齡女性均可能出現(xiàn)卵泡刺激后獲卵數(shù)低的問題,原因可能是血清AMH水平低往往提示女性卵泡池容量小、卵巢儲備功能低下,說明AMH可以進一步反映女性的生殖潛力[4,6]。本研究結(jié)合以往研究進一步探索了不同年齡組人群中血清AMH水平與獲卵數(shù)的曲線關(guān)系。在<35歲的年輕女性群體中,血清AMH水平與獲卵數(shù)整體呈正相關(guān)而非正比,在AMH濃度<2.7 ng/ml和>5.8 ng/ml時,AMH的增加對于獲卵數(shù)增加的影響幅度提升較快;在2.7～5.8 ng/ml范圍內(nèi),AMH的增加對獲卵數(shù)的影響較為平坦,此范圍內(nèi)的獲卵數(shù)變化不大。在≥35歲的高齡人群中,AMH與獲卵數(shù)的關(guān)聯(lián)出現(xiàn)了閾值效應(yīng),在4～6 ng/ml時AMH對獲卵數(shù)增加產(chǎn)生的效應(yīng)最高。本研究結(jié)果顯示,在相同的AMH升高情況下,獲卵數(shù)體現(xiàn)的結(jié)果不一樣,究其原因,可能與本研究中未剔除卵巢高反應(yīng)患者有關(guān)。AMH通過顆粒細胞數(shù)量間接反映竇前卵泡的數(shù)量[21];還有研究發(fā)現(xiàn),卵泡液中AMH水平隨卵泡增大而減少,當(dāng)卵泡直徑超過10 mm時,AMH幾乎檢測不到[22]。所以,實際獲卵數(shù)與AMH反應(yīng)的卵泡情況不能完全重合。另外,并不是所有對AMH有貢獻的竇前和小竇卵泡都會發(fā)育到竇卵泡[23]。Broer等[24]的一項薈萃分析發(fā)現(xiàn),通過聯(lián)合AMH與AFC建立卵巢反應(yīng)的預(yù)測模型,模型在預(yù)測卵巢反應(yīng)過度與反應(yīng)不良兩方面均有較高的準(zhǔn)確度。我們認(rèn)為這樣的曲線關(guān)系可以更好地發(fā)揮AMH在輔助生殖中的預(yù)測作用,同時也需要未來進一步研究加以驗證。

由于AMH在預(yù)測卵巢刺激反應(yīng)、卵巢儲備功能、PCOS以及絕經(jīng)年齡等方面的應(yīng)用都取得了良好的進展[2],許多輔助生殖領(lǐng)域的專家學(xué)者紛紛開始研究其在生育結(jié)局預(yù)測中的應(yīng)用價值。一項薈萃分析指出,在自然妊娠預(yù)測中,AMH對于年輕女性和高齡女性的預(yù)測價值均較差[25]。有研究提出,AMH水平較高可能表明卵母細胞質(zhì)量更好,相應(yīng)的人群可能獲得更高的妊娠率[26]。但后續(xù)的研究指出,血清AMH水平不僅與卵母細胞的質(zhì)量無關(guān),同時無論其水平如何,對體內(nèi)胚胎的發(fā)育潛力影響不大,無法影響IVF的臨床妊娠率[4,27-28]。Sun等[5]比較了臨床妊娠組和未妊娠組的AMH水平,發(fā)現(xiàn)兩組存在顯著性差異,但其中包含的混雜因素未得到合理校正,兩組的年齡、獲卵數(shù)等因素都表現(xiàn)出差異。由于當(dāng)前冷凍胚胎的普及,累積活產(chǎn)率取代單次移植活產(chǎn)率成為了更受歡迎的評價治療效果的指標(biāo)[29]。我們在活產(chǎn)關(guān)聯(lián)研究中選擇累積活產(chǎn)作為第二階段的結(jié)局,并考慮了AMH與累積活產(chǎn)率之間是否存在非線性關(guān)聯(lián),結(jié)果顯示,單因素分析中,年輕人群的AMH水平可能與累積活產(chǎn)率存在非線性關(guān)聯(lián),但通過協(xié)變量校正后,二者的關(guān)聯(lián)消失,這可能是由于獲卵數(shù)提供的中介效應(yīng),AMH本身與累積活產(chǎn)率之間沒有直接關(guān)聯(lián),在今后研究中還應(yīng)該增加其他變量以衡量累積活產(chǎn)率;在高齡人群中,AMH與累積活產(chǎn)率在單因素和多因素模型中均未表現(xiàn)出意義,這與以往研究一致。高齡人群中,由于年齡的跨度較大,研究年齡對AMH即卵母細胞質(zhì)量的影響時可以考慮繼續(xù)細分不同的年齡層,以驗證二者是否具有更相關(guān)性。Qiu等[7]利用限制性立方樣條探討了國內(nèi)育齡期女性AMH與生育能力的非線性關(guān)系,結(jié)果表明女性AMH與生育能力的關(guān)聯(lián)有限,關(guān)于AMH的影響仍需要更進一步的研究。

綜上所述,通過GAM擬合不同年齡組的人群信息,我們發(fā)現(xiàn)在ART治療中,AMH水平與獲卵數(shù)呈現(xiàn)非線性關(guān)聯(lián),在不同年齡組中AMH的效應(yīng)趨勢變化不同,AMH可以作為獲卵數(shù)的獨立預(yù)測因素;但無論哪個年齡段,AMH水平對累積活產(chǎn)的效應(yīng)有限。本研究對現(xiàn)有AMH與卵巢刺激反應(yīng)的關(guān)聯(lián)狀態(tài)進行了更深入地探索,有助于接受治療的患者和醫(yī)師通過檢測血清AMH水平準(zhǔn)確評估獲卵數(shù),為提高活產(chǎn)和避免卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的個性化診療方案提供了更多參考。但本研究也存在一些不足之處:首先由于年齡對卵母細胞質(zhì)量的影響,進行35歲的年齡劃分是否符合當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn),需要做進一步研究;其次,橫斷面研究只能探討變量間的相關(guān)性,無法探索二者的因果關(guān)聯(lián);再次,由于本研究只納入了單個中心的數(shù)據(jù),可及樣本量較小,需要更進一步的研究進行結(jié)論驗證。