奧硝唑誘導弱精子癥與少弱精子癥大鼠模型的建立

劉勝京，晏斌，安曉靜，耿強，韓強，趙豐，張繼偉，王福，郭軍*

(1.中國中醫科學院西苑醫院,北京 100091;2.天津中醫藥大學第一附屬醫院,天津 300193;3.首都醫科大學附屬北京中醫醫院,北京 100010)

男性不育癥是指夫婦備孕1年以上,性生活規律且未采取避孕措施,由于男方因素導致女方不能懷孕的一類疾病[1]。其中,弱精子癥與少弱精子癥是男性不育癥最常見的原因[2],然而目前臨床尚缺乏治療弱精子癥及少弱精子癥的有效藥物[3-4],通過構建穩定的弱精子癥及少弱精子癥動物模型,對探索弱精子癥及少弱精子癥的發病機制及新藥研發均具有重要的意義。

奧硝唑(Ornidazole,ORN)是繼甲硝唑、替硝唑之后的第3代硝基咪唑類抗生素,具有良好的抗厭氧菌和抗原生質(如滴蟲等)感染作用,常用于泌尿生殖道感染等疾病。目前生殖毒性結果顯示ORN對雄性大鼠生殖系統具有可逆性影響,其影響程度與給藥劑量有關[5]。有研究證實其可用于誘導弱精子癥及少弱精子癥模型,但是其影響環節及影響生殖功能的具體機制尚不清楚。本實驗通過對大鼠進行不同劑量ORN灌胃處理,研究ORN造模效果,同時對ORN誘導的大鼠弱精子癥及少弱精子癥的作用部位及原因進行探討,以期為弱精子癥及少弱精子癥的研究提供理論基礎。

材料與方法

一、材料和試劑

1.實驗動物:SPF級雄性SD大鼠48只,體重200～220 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:SCXK(京)2021-0006]。動物分籠飼養,每籠6只,自由攝食飲水。室溫(23±2)℃,濕度(60±5)%,12 h/12 h光暗周期。實驗前適應性喂養1周。本研究已通過中國中醫科學院西苑醫院動物倫理委員會審查,取得倫理審查批件(批件號2021XLC051-受1)。

2.主要試劑與儀器:ORN(E120437)購自安耐吉化學公司;羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose-Na,CMC-Na)、戊二醛固定液購自北京索萊寶科技有限公司;睪丸固定液(Davidson’s固定液)購自上海源葉生物科技有限公司。SSA-Ⅱ精子檢測分析系統(北京穗加軟件有限公司),透射電鏡(HT7800,日立,日本)。

二、研究方法

1.動物分組:將48只SD大鼠隨機分為空白對照組(NC組)及ORN 200 mg·kg-1·d-1劑量組(ORN 200組)、ORN 400 mg·kg-1·d-1劑量組(ORN 400組)、ORN 800 mg·kg-1·d-1劑量組(ORN 800組),每組12只。因ORN不溶于水,為避免灌胃時未能混勻引起劑量的不穩定,影響造模結果,故ORN采用1% CMC-Na制成混懸液,NC組給予等量的1% CMC-Na溶液灌胃,共持續28 d。

2.大鼠一般情況觀察:各組大鼠每周稱重1次,并每日觀察外觀體征、行為活動、飲食攝水、排尿排便、皮毛光澤度及精神狀態等。

3.實驗取材:連續干預28 d后,大鼠經天平稱重,使用異氟烷吸入麻醉?？焖偃〕鲆粋雀讲G,將附睪尾于含有1 ml PBS緩沖液(37℃溫浴)的EP管中剪碎,溫浴5 min,制備精子懸液,檢測精子濃度及活力。另一側附睪及雙側睪丸于冰上取出,剔除多余脂肪,精密天平稱重后,放置于睪丸固定液及液氮保存。采用取血針抽取大鼠腹主動脈血到促凝管中,放置分層后于離心機3 000轉/min離心10 min,取上清,保存于-80℃冰箱備用。

為避免血液對樣本的影響而干擾電鏡的觀察,每組選3只進行血管灌注處理,大鼠麻醉后,暴露心臟,100 ml注射器從心臟處插入升主動脈,先以PBS緩沖液快速沖洗血管,然后用4%多聚甲醛灌注固定,直至大鼠四肢及尾部抽搐皺縮。把附睪及睪丸完整取下后完全浸入4℃預冷戊二醛固定液內,固定1 min后,于固定液內分解為米粒大小組織,轉入新戊二醛固定液固定保存,用于電鏡觀察。

4.大鼠附睪及睪丸指數計算:電子天平稱重大鼠,精密天平稱取大鼠附睪及睪丸重量,計算附睪及睪丸的臟器指數。計算方式如下:臟器指數=(臟器濕重/大鼠體重)×1 000‰。

5.精子質量的檢測:將精子懸液吸出10 μl加入含990 μl的PBS緩沖液離心管中混合均勻,將稀釋后的精子懸液滴加到預熱的精子計數板上,使用SSA-Ⅱ精子分析系統分析精子質量。精子檢測由同一人操作完成以減少實驗誤差。

6.蘇木素-伊紅(HE)染色觀察附睪及睪丸組織病理形態學變化:將睪丸固定液固定后的附睪及睪丸組織,經固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色,鏡下觀察。

采用約翰遜評分(Johnsen score)將睪丸分為1～10個等級,根據生精小管中精子的發生及精子發生障礙程度做出定量判斷的評分表,分數越高,睪丸功能越好[6]。具體評分如下:1分:無生精上皮;2分:無生精細胞,只有支持細胞;3分:只有精原細胞;4分:無精子或精子細胞,精母細胞較少;5分:無精子或精子細胞,精母細胞較多;6分:無精子或后期精子細胞,初期精子細胞較少;7分:無精子或后期精子細胞,初期精子細胞較多;8分:每小管小于5條精子,后期精子細胞較少;9分:生精功能輕度改變,后期精子細胞較多,上皮細胞排列紊亂;10分:生精功能正常。

7.透射電鏡觀察附睪及睪丸超微結構:將戊二醛固定的附睪及睪丸組織,經固定、脫水、包埋、固化后,使用超薄切片機萊卡EMUC7切片,經醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后,透射電鏡下觀察附睪及睪丸線粒體超微結構并拍照。

三、統計學分析

結 果

一、各組大鼠的一般情況

NC組大鼠實驗過程中精神狀態良好,活動反應正常,體重穩定增長。ORN各組大鼠均出現不同程度的少動、反應遲緩、倦態萎靡、進食量減少、體重增長緩慢、毛色稀松無光澤的現象,其中大鼠倦怠乏力癥狀灌胃初期更明顯,且隨劑量增加而加重,ORN 800組大鼠萎靡癥狀表現最為嚴重。灌胃28 d過程中無大鼠死亡。

二、ORN對大鼠體重、附睪及睪丸指數的影響

與NC組相比,ORN 200組大鼠體重、附睪指數、睪丸指數均無顯著變化(P>0.05);ORN 400組體重及附睪指數下降(P<0.05),睪丸指數無顯著變化(P>0.05);ORN 800組體重顯著減輕(P<0.01),附睪及睪丸指數顯著下降(P<0.001)(圖1)。

與NC組比較,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖1 各組大鼠體重、附睪及睪丸指數比較

三、ORN對大鼠精子濃度及活力的影響

與NC組相比,ORN 200組精子濃度及精子活力無顯著變化(P>0.05);ORN 400組精子濃度無顯著變化(P>0.05),精子活力顯著降低(P<0.001);ORN 800組精子濃度及活力均顯著降低(P<0.001)(表1)。

表1 各組大鼠精子濃度及活力比較(-±s)

四、ORN對大鼠附睪及睪丸組織形態的影響

HE染色結果顯示:NC組大鼠附睪頭和附睪尾中附睪管排列均緊密,管腔可見大量精子,睪丸生精細胞排列整齊,各級生精細胞層次清晰,可見大量精子生成;與NC組相比,ORN 200組無明顯變化;ORN 400組附睪管腔內精子數量無明顯變化,部分纖毛排列紊亂,睪丸生精小管形態規則,生精細胞數目無明顯改變,排列偶有紊亂,但可明顯看到各級精母細胞的層次,可見大量精子;ORN 800組附睪頭及附睪尾均可見附睪管腔內精子數量明顯減少,纖毛排列紊亂,可見大量圓形退變精子,睪丸生精小管間距變寬,生精細胞大量減少,排列紊亂,各級精母細胞層級基本消失,生精小管管腔內可見壞死脫落的生精細胞團,精子數量明顯變少(圖2～4)。

NC組:附睪管排列整齊,精子豐富;ORN 200組:形態與NC組基本一致;ORN 400組:附睪管上皮細胞局灶纖毛紊亂;ORN 800組:精子數量減少,附睪管上皮細胞纖毛紊亂。圖2 各組大鼠附睪頭HE染色結果

各組大鼠睪丸約翰遜評分統計結果顯示,ORN 200及ORN 400組與NC組相比無顯著性差異(P>0.05),ORN 800組的評分顯著低于NC組(P<0.001)(圖5)。

圖中圓圈代表每只大鼠的約翰遜評分;與NC組比較,***P<0.001。圖5 各組大鼠睪丸約翰遜評分比較

五、ORN對大鼠附睪及睪丸超微結構的影響

大鼠附睪尾透射電鏡超微結構結果顯示:NC組上皮細胞形態基本正常,細胞核呈橢圓形;胞質內線粒體豐富,線粒體形態基本正常,呈桿狀或橢圓形,內嵴豐富、排列正常;ORN各組均可見豐富線粒體,但線粒體輕度腫脹,內嵴減少(圖6)。

大鼠睪丸透射電鏡超微結構結果顯示:NC組生精細胞形態基本正常,細胞核呈橢圓形,胞質內線粒體豐富,線粒體形態基本正常,呈桿狀或橢圓形,內嵴豐富、排列正常;ORN各組均可見較多線粒體,但隨著劑量增加,線粒體腫脹程度加重,線粒體嵴逐漸稀疏,且線粒體空泡化逐漸加重(圖7)。

N:細胞核;M:線粒體。圖7 各組大鼠睪丸透射電鏡下超微結構比較

大鼠精子尾部線粒體中段橫切透射電鏡結果顯示:NC組可見完整的精子線粒體鞘,并可見完整且結構清晰的9+9+2結構(9根外周致密纖維、9根軸絲及2個微管),未見周圍微管和中央微管畸形。ORN 200組可見精子線粒體鞘輕微腫脹,ORN 400組可見精子線粒體鞘有輕度損傷及腫脹,但ORN 200及ORN 400組外周致密纖維完整,未見周圍微管和中央微管畸形,仍能看到清晰及較為完整的9+9+2結構。ORN 800組精子線粒體鞘出現明顯腫脹及斷裂,大小不一,有空腔出現,內部軸絲斷裂(圖8)。

圖8 各組大鼠精子尾部線粒體中段橫切透射電鏡下超微結構比較(×20 K)

討 論

目前弱精子癥及少弱精子癥模型的制備方法,包括物理方法、化學方法及基因敲除等方法。其中化學方法因其簡單、穩定、高效,是最常用的造模方法[7-8]。關于弱精子癥的動物模型制備方法主要圍繞ORN展開[5,9-11]。少弱精子癥模型制備的化學方法主要包括環磷酰胺、白消安、腺嘌呤等化療藥物,以及雷公藤多苷、ORN等[7-8]。開發穩定且具有較好關聯性的弱精子癥及少弱精子癥動物模型,對藥物研發及藥物機制闡述具有重要意義。

本課題組對目前少弱精子癥常見化學造模方法進行文獻梳理及預實驗探索,并比較其優缺點。環磷酰胺及白消安作為化療藥物,造模采用腹腔注射的方法,造模劑量及天數目前文獻記載仍不完全一致,且存在藥物注射過量或操作不當時極容易造成大鼠死亡率過高,而注射過少則睪丸組織損傷不明顯等問題[12-13]。腺嘌呤具有較為嚴重的腎損傷特點,不能排除腎衰對生精功能的直接影響,可能更適宜作為腎損傷合并睪丸功能低下的模型[14]。雷公藤多苷作為中藥提取混合物,成分復雜,包括雷公藤甲素、雷公藤紅素等多種成分。而市場上雷公藤多苷標準提取物往往僅以雷公藤甲素為單一評價指標,導致各種雷公藤多苷提取物魚目混雜[15],對藥物質控帶來一定挑戰,可能不如單一化合物誘導的動物模型更為穩定。ORN作為三代抗生素,可劑量依賴性地造成可逆性的雄性動物不育,為其誘導少、弱精子癥模型的建立提供了基礎[5,9-10,16-17],是較為理想的弱精子癥與少弱精子癥造模藥物之一。

本研究結果表明,ORN 400 mg/kg對大鼠灌胃28 d,會引起大鼠精子活力顯著下降,對精子濃度無顯著影響;ORN 800 mg/kg對大鼠灌胃28 d,會引起大鼠精子濃度及活力均顯著下降,這與之前文獻記載[5,9-10,16-17]一致,認為ORN 400 mg/kg灌胃28 d可用于弱精子癥大鼠模型的制備,ORN 800 mg/kg灌胃28 d可用于少弱精子癥大鼠模型的制備。本研究對精子發生的部位睪丸,以及精子發育成熟的部位附睪進行了觀察與相關的檢測,從附睪、睪丸病理及超微結構角度闡述ORN對附睪及睪丸的病理損傷,為弱精子癥及少弱精子癥大鼠模型的構建提供了更多證據。

附睪可儲存和排放精子,有促使精子成熟和分泌液體供給精子營養的作用,可分為頭、體、尾三部分,其不同區域功能不同[18]。本研究通過HE檢測,發現ORN對同組附睪頭及附睪尾病理學影響未見明顯差異,其影響機制可能與附睪內環境及蛋白表達等有關[18]。此外目前的實驗多采用精子檢測分析系統進行精子數量分析,但大鼠精液檢測與人類精液檢測相比,仍存在一定誤差,因此附睪病理檢查在判斷大鼠精子數量等方面仍存在一定價值,可在今后男性不育癥相關動物研究中予以一定重視。

ORN對于附睪及睪丸損傷情況存在劑量依賴現象,ORN 200 mg/kg大鼠灌胃28 d,對大鼠附睪及睪丸臟器指數、精子濃度及活力未見顯著影響,HE染色觀察附睪及睪丸組織未觀察到明顯損傷。透射電鏡發現附睪線粒體體積偏小,睪丸線粒體出現內嵴減少,并有部分線粒體空泡化,精子線粒體未見明顯異常。說明ORN 200 mg/kg灌胃28 d對大鼠附睪及睪丸組織影響未見明顯影響,附睪及睪丸組織線粒體有輕微損傷,但未影響到精子線粒體結構,未引起附睪及睪丸組織明顯損傷。ORN 400 mg/kg灌胃28 d時,附睪指數及精子活力顯著降低,但睪丸指數及精子濃度未見異常,HE染色觀察附睪及睪丸組織未見明顯損傷,但超微結構下已經可見附睪及睪丸線粒體出現內嵴減少及部分空泡化現象,精子線粒體出現損傷,但仍可見較為完整的精子線粒體結構。說明ORN 400 mg/kg灌胃28 d對大鼠附睪影響更為明顯,主要造成大鼠精子活力下降。當ORN每日給藥量達800 mg/kg給藥28 d時,會造成附睪及睪丸指數顯著下降,附睪精子數量及活力顯著減低,HE染色可見睪丸精原細胞減少且排列紊亂,各級生精細胞及精子細胞明顯減少。超微結構下可觀察到附睪及睪丸線粒體空泡化明顯,精子線粒體明顯腫脹斷裂。說明ORN 800 mg/kg灌胃28 d對附睪及睪丸損傷明顯,可嚴重影響睪丸的生精功能。此外ORN 800 mg/kg組灌胃初期,大鼠可出現數小時萎靡現象,部分大鼠癥狀嚴重時無法正常行動及進食,在一定程度符合中醫“腎虛”“虛象”癥狀,可為中醫病癥結合動物模型的研究提供參考。

本實驗從動物水平上觀察了不同劑量的ORN對雄性大鼠附睪及睪丸生殖系統的影響,為更全面、更深入地了解其對附睪及睪丸生殖功能的影響提供基礎,同時也為弱精子癥及少弱精子癥動物模型的構建提供了更多思路。