HLA-G基因敲除人滋養(yǎng)層干細(xì)胞模型構(gòu)建

王思東，程延飛，曹丹丹，崔馨元，莊白妹，張博倫，姚元慶2，*

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院研究生院,北京 100853;2.中國人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科,北京 100010;3.深圳市生育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,香港大學(xué)-深圳醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心,深圳 518053;4.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院,天津 300071)

諾貝爾獎(jiǎng)得主Peter Medawar在1953年提出:胎兒的一半基因來源于父代,但這種外源基因的存在不會(huì)引起妊娠女性免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒的排斥。自此,該問題一直是熱點(diǎn)研究話題。1986年,人們首次發(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)[1]。近幾十年的研究表明,HLA-G是介導(dǎo)母胎免疫耐受的重要分子,屬于非經(jīng)典Ⅰ型主要組織相容性復(fù)合物(class Ⅰ major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)。不同于經(jīng)典的MHC-Ⅰ類分子,HLA-G表現(xiàn)出有限的多態(tài)性,并且特異性表達(dá)在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillous trophoblasts,EVT)中。目前發(fā)現(xiàn)HLA-G有7個(gè)亞型,其中HLA-G1、G2、G3和G4為膜結(jié)合型,HLA-G5、G6和G7為可溶型[2]。

在正常胎盤組織內(nèi),HLA-G特異性表達(dá)在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中[3],與NK細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面受體相互作用以建立母胎界面的免疫耐受,促進(jìn)螺旋動(dòng)脈重塑和胎兒生長(zhǎng)[4]。已有研究表明,HLA-G的基因多樣性和HLA-G蛋白含量與反復(fù)流產(chǎn)[5-8]、反復(fù)種植失敗[9-10]、子癇前期[11-13]和胎兒生長(zhǎng)受限[14-15]有關(guān)。因此研究母胎界面HLA-G的作用和機(jī)制對(duì)于獲得及維持正常妊娠非常重要。

近年來,將滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cell,TSC)分化為絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化技術(shù)趨向于成熟,可作為研究HLA-G的穩(wěn)定研究模型。本研究基于TSC向EVT誘導(dǎo)分化體系,利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了TSC的HLA-G基因,建立了穩(wěn)定的HLA-G-/--TSC細(xì)胞系,初步探究HLA-G對(duì)TSC向EVT分化能力的影響,為進(jìn)一步研究HLA-G基因提供基礎(chǔ)。

材料和方法

一、研究材料

1.細(xì)胞系:本研究所需人滋養(yǎng)層干細(xì)胞源于M1人擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞(human expanded potential stem cell,hEPSC)[16],由香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院劉澎濤教授團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng)。

2.儀器:B2生物安全柜(ESCO,新加坡);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo,美國);相差顯微鏡(Zeiss,德國);電轉(zhuǎn)儀(NEPA GENE,日本);激光共聚焦顯微鏡(Zeiss,德國);熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國)。

3.試劑:DMEM/F-12、青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液、2-巰基乙醇、TrypLETMExpress 酶及KnockOutTM血清替代物(Gibco,美國);L-抗壞血酸及Triton-X100(Sigma,美國);重組人表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)、丙戊酸(VPA)、Laduviglusib(CHIR-99021)、A83-01、Y27632抑制劑及SB431542(MCE,美國);重組人神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(rhNRG1-β1)(Cell Signaling Technology,美國);生物基質(zhì)膠Matrigel(Corning,美國);pSpCas9(BB)-2A-Puro(湖南豐暉生物);DH5α感受態(tài)、細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化);電轉(zhuǎn)杯(NEPA GENE,日本);嘌呤霉素(北京碧云天);2×Rapid Taq Master Mix、RNA-easy Isolation Reagent、HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR及通用型SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊);4%多聚甲醛、DAPI及抗熒光淬滅封片劑(武漢賽維爾);兔源Cytokeratin-7一抗、兔源GATA3一抗及兔源TEAD4一抗(Abcam,英國);鼠源HLA-G一抗、驢抗兔Alexa FluorTM488、羊抗鼠Alexa FluorTM488(Invitrogen,美國);μ-Slide 8孔腔室載玻片(ibidi,德國);全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶);SDS-PAGE上樣緩沖液(北京康為世紀(jì));Meilunbio飛克特超敏ECL發(fā)光液(大連美侖生物)。

二、研究方法

1.TSC的培養(yǎng):對(duì)已發(fā)表的人TSC培養(yǎng)基配制方法[17]進(jìn)行修改:在DMEM/F12中添加50 μmol/L 2-巰基乙醇、0.3% BSA、0.5%青霉素-鏈霉素、1% ITS-X補(bǔ)充劑、0.2% FBS、50 μg/ml L-抗壞血酸、50 ng/ml rhEGF、2 μmol/L CHIR99021、0.5 μmol/L A83-01、1 μmol/L SB431542、10 μmol/L VPA和5 μmol/L Y27632。6孔板以1% Matrigel 37℃下預(yù)包被。當(dāng)TSC密度達(dá)到80%的融合度時(shí),以TrypLETMExpress酶消化細(xì)胞,以每孔0.5×105細(xì)胞的密度接種于預(yù)包被6孔板中。每孔加入2 ml TSC培養(yǎng)基后于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng),每2 d換液。

2.載體構(gòu)建與基因敲除:按照之前文獻(xiàn)方法[18]由上海生工合成2條小向?qū)NA(sgRNA)(表1),分別將其克隆至pSpCas9載體。將載體轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂于LB固體培養(yǎng)基平板,37℃倒置過夜,挑單克隆菌落,擴(kuò)繁后送上海生工測(cè)序。擴(kuò)繁構(gòu)建成功的菌液,根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒。采用電轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒導(dǎo)入TSC內(nèi),電轉(zhuǎn)染后48 h加入2 μg/ml嘌呤霉素篩選,48 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)5 d,挑取單克隆細(xì)胞群落,傳代至48孔板,擴(kuò)增待用。取適量細(xì)胞根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取DNA進(jìn)行PCR和電泳,將擴(kuò)增片段短的PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。

表1 sgRNA及目的基因引物序列

3.HLA-G-/--TSC的特征基因鑒定:實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR):當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%的融合度時(shí),消化離心細(xì)胞。根據(jù)RNA提取試劑說明書進(jìn)行RNA提取。以提取的RNA為模板參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制逆轉(zhuǎn)錄體系。以合成的cDNA為模板,按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書配制qPCR反應(yīng)體系,所有qPCR試驗(yàn)均在Bio-Rad Primer PCR儀器上進(jìn)行。以GAPDH作內(nèi)參,以ΔCt的方法計(jì)算基因表達(dá)水平。引物序列見表2。

表2 目的基因引物序列

免疫熒光:1% Matrigel預(yù)包被μ-Slide 8孔腔室載玻片。接種細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%的融合度時(shí)用于免疫熒光染色。棄培養(yǎng)基,以PBS清洗,4%多聚甲醛室溫固定10 min,PBS清洗后加入含0.3% Triton-100的PBS破膜5 min,再清洗后加入2% FBS室溫下封閉1 h。細(xì)胞與一抗工作液(1∶200)4℃孵育過夜。次日PBS清洗后加入二抗工作液(1∶500),室溫孵育30 min。PBS清洗后加入DAPI,避光孵育2 min,PBS清洗后加入抗熒光淬滅封片劑。共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

4.TSC誘導(dǎo)分化為EVT:配制EVT培養(yǎng)基-1:在DMEM/F12中添加0.5%青霉素-鏈霉素、0.3% BSA、1% ITS-X補(bǔ)充劑、50 μmol/L 2-巰基乙醇、7.5 μmol/L A83-01、10 μmol/L Y27632、100 ng/ml rhNRG1、4% KnockOutTM血清替代物和2% Matrigel;配制EVT培養(yǎng)基-2:在DMEM/F12中添加0.5%青霉素-鏈霉素、0.3% BSA、1% ITS-X補(bǔ)充劑、50 μmol/L 2-巰基乙醇、7.5 μmol/L A83-01、10 μmol/L Y27632、4% KnockOutTM血清替代物和0.5% Matrigel;配制EVT培養(yǎng)基-3:在DMEM/F12中添加0.5%青霉素-鏈霉素、0.3% BSA、1% ITS-X補(bǔ)充劑、50 μmol/L 2-巰基乙醇、7.5 μmol/L A83-01、10 μmol/L Y27632和0.5% Matrigel。

當(dāng)TSC密度達(dá)到80%的融合度時(shí),消化離心TSC,以每孔1.5×105細(xì)胞的密度接種在1% Matrigel預(yù)包被6孔板中,每孔加入3 ml EVT培養(yǎng)基-1;第3天,更換為EVT培養(yǎng)基-2;第6天,將EVT細(xì)胞1∶2傳代至新的1% Matrigel預(yù)包被6孔板中,每孔加入3 ml EVT培養(yǎng)基-3;第8天可收取EVT細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

5.WB驗(yàn)證HLA-G基因敲除:分化第8天,將EVT消化離心至1.5 ml離心管,PBS清洗3次。按照全蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行樣品蛋白提取,根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品與SDS-PAGE上樣緩沖液以4∶1比例混勻,90℃加熱10 min。樣品冷卻至室溫,3 000 rpm離心30 s。取適量上清進(jìn)行常規(guī)電泳。電轉(zhuǎn)膜后,以5%脫脂牛奶封閉90 min,脫脂牛奶配置HLA-G一抗工作液(1∶2 000),4℃震蕩孵育過夜。以TBST震蕩清洗3次(10 min/次)后加入二抗工作液(1∶10 000),室溫震蕩孵育1 h。以TBST震蕩清洗3次(10 min/次),加入超敏ECL發(fā)光液后曝膜拍照。

6.EVT特征基因檢測(cè):qPCR:分化第8天收取EVT細(xì)胞按前述步驟進(jìn)行qPCR試驗(yàn),引物序列見表2。免疫熒光:分化第6天將適量EVT細(xì)胞傳代至1% Matrigel預(yù)包被μ-Slide 8孔腔室載玻片中,第8天按前述步驟進(jìn)行免疫熒光染色。共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、建立HLA-G-/--TSC細(xì)胞模型

HLA-G基因敲除TSC(HLA-G-/--TSC)與野生型TSC(WT-TSC)均呈鵝卵石樣克隆(圖1A)。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)及瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證基因敲除,結(jié)果顯示HLA-G基因片段缺失,單一條帶表明該敲除細(xì)胞為純合型(圖1B)。基因測(cè)序結(jié)果表明,HLA-G基因的CDS區(qū)缺失179 bp堿基序列(圖1C)。

A:WT-TSC和HLA-G-/--TSC的明場(chǎng)圖像(標(biāo)尺=100 μm);B:瓊脂糖凝膠電泳顯示HLA-G基因缺失;C:DNA測(cè)序證實(shí)HLA-G基因缺失,紅色箭頭指示處為缺失的堿基序列。圖1 HLA-G基因敲除的驗(yàn)證

免疫熒光染色顯示,在蛋白水平上,人滋養(yǎng)層干細(xì)胞的標(biāo)志基因(KRT7GATA3TEAD4)在HLA-G-/--TSC與WT-TSC中均有表達(dá)(綠色熒光)(圖2A)。qPCR結(jié)果顯示,WT-TSC的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因(NANOGSOX2OCT4)表達(dá)受抑制,顯著低于人EPSC(P<0.05)。HLA-G-/--TSC的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)水平亦顯著低于人EPSC(P<0.05),與WT-TSC無顯著差異(P>0.05)(圖2B)。

A:TSC標(biāo)志基因的免疫熒光染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm);B:不同細(xì)胞中胚胎干細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的qPCR分析:與EPSC比較,*P<0.05,#P<0.001。圖2 HLA-G基因敲除后TSC相關(guān)特征鑒定

二、HLA-G基因敲除不影響TSC向EVT分化

在EVT誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,HLA-G-/--TSC仍可分化為紡錘形EVT樣細(xì)胞(圖3)。WB結(jié)果顯示HLA-G-/--TSC來源的EVT樣細(xì)胞無HLA-G蛋白的表達(dá)(圖4)。免疫熒光結(jié)果顯示,HLA-G-/--TSC來源的EVT樣細(xì)胞表達(dá)滋養(yǎng)層細(xì)胞標(biāo)志蛋白KRT7(綠色熒光),不表達(dá)HLA-G蛋白(紅色熒光)(圖5)。qPCR結(jié)果顯示,HLA-G基因敲除的EVT樣細(xì)胞(HLA-G-/--EVT)表達(dá)其他EVT標(biāo)志基因(ITGA1MMP2FN1),表達(dá)量顯著高于HLA-G-/--TSC(P<0.05),且與野生型EVT(WT-EVT)無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

圖3 WT-EVT和HLA-G-/--EVT的明場(chǎng)圖像(標(biāo)尺=100 μm)

圖4 WB證實(shí)HLA-G蛋白缺失

圖5 WT-EVT和HLA-G-/--EVT的免疫熒光染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)

兩種EVT分別與其來源的TSC比較,*P<0.05,***P<0.001,#P<0.000 1。圖6 EVT標(biāo)志基因表達(dá)的qPCR分析

討 論

HLA-G在胚胎著床及妊娠過程中發(fā)揮重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn),不孕患者進(jìn)行IVF/ICSI治療時(shí),胚胎培養(yǎng)液中能檢測(cè)到HLA-G的胚胎有更高的種植率和臨床妊娠率[19]。還有研究發(fā)現(xiàn),反復(fù)流產(chǎn)患者胎盤組織中HLA-G蛋白表達(dá)量降低[5]。中孕期血液中可溶型HLA-G含量顯著下降的女性,在晚孕期患子癇前期或胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的風(fēng)險(xiǎn)增大[14]。然而HLA-G在其中的角色及作用機(jī)制仍需深入研究。

實(shí)驗(yàn)研究表明,HLA-G介導(dǎo)母胎免疫耐受,下調(diào)HLA-G基因表達(dá)可促進(jìn)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[20-21]。HLA-G5可與受體LILRB1和KIRDL4結(jié)合,通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲[22]。表達(dá)HLA-G的LCL721.221細(xì)胞可使蛻膜NK細(xì)胞分泌更多血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[23],促進(jìn)血管生成。然而,針對(duì)HLA-G的體外研究多以絨毛膜癌細(xì)胞系JEG3作為研究對(duì)象,但癌細(xì)胞存在染色體數(shù)目異常且轉(zhuǎn)錄組譜與正常人EVT相差甚遠(yuǎn)[24]。HLA-G基因轉(zhuǎn)染的LCL721.221細(xì)胞無法準(zhǔn)確模擬生理狀態(tài)下細(xì)胞間相互作用。小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)有HLA-G的同源基因。原代EVT的獲取不易且無法體外擴(kuò)增,也并非理想的研究模型。因此,使用準(zhǔn)確且穩(wěn)定的HLA-G研究工具非常必要。

2018年,Okae等[17]從人囊胚及早期妊娠的胎盤中成功分離出滋養(yǎng)層干細(xì)胞,通過激活Wnt、表皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路和抑制Rho相關(guān)蛋白激酶(ROCK)、組蛋白去乙酰化酶、TGF-β的活性,滋養(yǎng)層細(xì)胞可以在體外培養(yǎng)、繁殖及傳代并表達(dá)滋養(yǎng)層干細(xì)胞的特性。當(dāng)去除Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑-CHIR99021時(shí),TSC可分化為HLA-G蛋白陽性的EVT細(xì)胞,其轉(zhuǎn)錄組譜與原代EVT相似。之后的研究中,擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞[16]、na?ve態(tài)多能干細(xì)胞[25]、primed態(tài)多能干細(xì)胞[26]等也可誘導(dǎo)分化為TSC,TSC來源的多樣性為體外研究胎盤發(fā)育及疾病發(fā)展提供了便利。本研究成功構(gòu)建了HLA-G基因敲除TSC模型,加入EVT培養(yǎng)基后可分化為不表達(dá)HLA-G蛋白的EVT樣細(xì)胞,為研究HLA-G在母胎界面的作用及機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

后續(xù)研究中,可利用HLA-G-/--TSC構(gòu)建胎盤類器官,與人的子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)模擬母胎界面,探究HLA-G對(duì)胚胎粘附及侵襲能力的影響。HLA-G-/--TSC來源的EVT可與蛻膜NK細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等胎盤免疫細(xì)胞共培養(yǎng),研究其相互作用機(jī)制。本研究只對(duì)單一來源的TSC進(jìn)行了HLA-G基因敲除,后續(xù)需要利用多種不同來源的TSC模型進(jìn)一步驗(yàn)證研究結(jié)果。