一種靶向DAT的氘代正電子探針的制備與表征

胡潛岳, 唐 婕, 方 毅, 劉春儀, 陳正平,*

(1. 南京醫科大學 藥學院,江蘇 南京 211166; 2. 江蘇省原子醫學研究 國家衛生健康委員會核醫學重點實驗室,江蘇省分子核醫學重點實驗室,江蘇 無錫 214063)

中樞神經系統的多巴胺轉運體(DAT)是許多神經退行性疾病的潛在靶點,如帕金森病(PD)[1]、精神分裂癥[2]和抑郁癥[3]等。腦內DAT數量的變化可以間接反映腦內多巴胺能神經元的變化。為了使DAT可視化,研究者已經開發了各種成像技術,如正電子發射斷層掃描(PET)是一種無創的成像技術,具有靈敏度高,特異性強及安全性好的優點。而研發正電子核素(如11C、18F)標記的靶向DAT的分子探針進行PET成像有助于對相關疾病的診斷、療效監測和疾病機理研究。

目前,大量11C或18F標記的放射性探針已被開發用于PET成像[4]。與11C標記的探針相比,18F標記的探針具有更低的正電子能量和合適的半衰期,是廣泛用于PET成像的正電子核素。靶向DAT的探針[18F]FP-CIT是目前國內外臨床應用最廣泛的18F標記的正電子探針,因具有半衰期適宜、親和力和特異性高等優點,被用于PD和多種與多巴胺能神經變性相關的成像,在臨床中應用廣泛[5]。然而,[18F]FP-CIT在體內細胞色素P450酶的作用下,N-氟丙基易代謝脫烷基而產生[18F]氟烷基代謝物,這些放射性代謝產物能夠進腦,從而影響PET成像的準確性[6]。因此,開發出體內穩定性高、DAT靶向性好的PET探針,將有助于PET技術對腦內DAT進行精準成像和定量分析,從而更有利于對DAT相關疾病的基礎與臨床研究。

將藥物易代謝物部位的C—H用C—D取代從而制得氘代藥物,能夠降低藥物在體內的代謝速度,提高體內穩定性,改善藥代動力學。氘代技術已在某些藥物(例如Austedo)取得了成功的應用[7]。在放射性藥物領域,已有文獻報道了幾個成功的氘代探針[8-10]。基于此,本研究利用氘代策略,設計并合成了一種[18F]FP-CIT的氘代結構[18F]FP-CIT-d6([18F]7),預期新氘代探針[18F]7在保持DAT靶向性的同時,還能減緩探針的體內代謝速度,減少放射性代謝產物的產生,從而提高PET顯像的準確性。化學合成方法為:利用丙二酸二乙酯(化合物1)在重水中通過氘氫交換得到化合物2,用氘代氫化鋁鋰還原化合物2得到氘代丙二醇(化合物3),化合物3再經過磺酰化制得磺酸酯(化合物4),化合物4和四丁基氟化銨(TBAF)發生親核取代反應得到化合物5,化合物5與化合物6反應得到非放射性靶向DAT的化合物FP-CIT-d6(7);化合物3經磺酰化反應后得到化合物8,化合物8與化合物6進行親核取代反應得到化合物9,再與甲基磺酸酐發生磺酰化反應得到標記前體化合物10。采用質譜、核磁共振氫譜、碳譜和氟譜對合成的中間體、非放射性化合物與標記前體化合物進行了結構表征。利用前體化合物10與18F-在堿性環境中進行一步法標記得到放射性探針[18F]FP-CIT-d6([18F]7);利用放射性HPLC測定了其放射性化學純度,并驗證放射性探針的結構。本文還測定了探針[18F]7在磷酸鹽緩沖液(PBS)和胎牛血清(FBS)中的體外穩定性,用搖瓶法測定了[18F]7脂水分配系數(LogP),為探針后續體內生物活性研究提供基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Avance III 400MHz型核磁共振儀(溶劑:氘代氯仿,CDCl3;內標物:四甲基硅烷,TMS);SQ Detector 2型電子噴霧離子質譜儀;住友H7型回旋加速器;Waters 1525 Binary型高效液相色譜儀;Waters 1525 Plus Binary型半制備型高效液相色譜儀;Waters 2998型雙通道紫外可見光檢測器;Gabi Nova型放射檢測器。

丙二酸二乙酯(化合物1)、重水(D2O)、氘代氫化鋁鋰(LiAlD4)、對甲苯磺酰氯(TsCl)、 4-二甲氨基吡啶(DMAP)、吡啶(Py)、四丁基氟化銨(TBAF)、甲基磺酸酐(Ms2O)、 2-甲基-2-丁醇(TAA)均購自安耐吉化學試劑有限公司;乙醚(分析純)、正己烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、四氫呋喃(THF)、甲苯(PhMe,分析純)、二氯甲烷(CH2Cl2,分析純)均購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈(CH3CN,色譜純)、甲醇(色譜純)、三乙胺(TEA,色譜純)、三氟乙酸(TFA,色譜純)均購自北京百靈威科技有限公司;2β-甲酯基-3β-(4-碘苯基)去甲基托烷(化合物6)參照文獻[11-12]自制。

1.2 合成

非放射性化合物7和標記前體化合物10的合成路線如圖1～2所示。

圖2 標記前體化合物10的合成路線

(1) 化合物2的合成

化合物2參照文獻[13]步驟合成,在丙二酸二乙酯(化合物1, 1.60 g, 10.00 mmol)的D2O(20.0 mL)加入無水碳酸鉀(K2CO3, 0.14 g, 1.00 mmol),反應液在室溫下攪拌24 h,反應結束后用乙醚萃取,有機相用無水硫酸鈉干燥,除去溶劑后得到1.26 g化合物2:無色透明液體,產率78%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 4.13(q,J=7.2 Hz, 4H), 1.21(t,J=7.2 Hz, 6H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 166.48, 61.30, 41.06(quint.,JC,D=20.1 Hz), 13.92; ESI-MSm/z: Calcd for C7H10D2NaO4{[M+Na]+} 185.08, found 185.24。

(2) 化合物3的合成

化合物2(1.94 g, 11.97 mmol)的3 mol/L THF溶液在0 ℃下,緩慢滴加到1.0 mol/L LiAlD4(0.60 g, 14.36 mmol)的THF溶液中,反應液加熱回流8 h,室溫下攪拌過夜。緩慢滴加1.2 mol/L氫氧化鈉的D2O(0.20 mmol)溶液,過濾沉淀,乙醚洗滌,濾液除去溶劑后得到0.49 g淡黃色油狀液體化合物3,產率47%。

(3) 化合物4的合成

根據文獻[14]報道的方法合成化合物4。將化合物3(0.67 g, 8.22 mmol)、 DMAP(0.10 g, 0.82 mmol)和TEA(3.30 g, 32.80 mmol)溶于CH2Cl2(10.0 mL)中,在0 ℃下滴加TsCl(3.84 g,20.22 mmol)的CH2Cl2(30.0 mL)溶液,反應液升至室溫攪拌24 h,加飽和NaCl溶液(20.0 mL)淬滅反應,CH2Cl2(2×20.0 mL)萃取,有機相用無水硫酸鈉干燥,過濾除去溶劑后得到白色固體,在90 ℃下用乙醇重結晶,得到化合物4:白色固體1.34 g,產率42%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.3 Hz, 4H), 7.35(d,J=8.0 Hz, 4H), 2.46(s, 6H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 145.09, 132.62, 129.98, 127.88, 21.66; ESI-MSm/z: Calcd for C17H14D6O6NaS2{[M+Na]+} 413.10, found 413.38。

(4) 化合物5的合成

將化合物4(0.67 g, 1.70 mmol)溶于CH3CN(8.0 mL)中,滴加TBAF(3.0 mL),加熱至90 ℃反應2 h,除去溶劑后,利用硅膠柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=4 ∶1,V∶V)分離純化得到0.20 g化合物5:無色透明液體,產率50%,1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.82～7.77(m, 2H), 7.36(d,J=7.6 Hz, 2H), 2.45(s, 3H);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 144.99, 132.86(d,JC,F=3.02 Hz), 129.95, 127.89, 78.8(m,JC,D=24.16 Hz), 65.51(m,JC,D=6.04 Hz), 29.05(quint,JC,D=19.63 Hz), 21.64;19F NMR(376 MHz, CDCl3)δ: -223.29; GC-MSm/z: Calcd for C7H7D6FO3S 238.09, found 238.1。

(5) 化合物7的合成

將化合物5(0.24 g, 1.01 mmol)、化合物6(0.31g, 0.82 mmol)、 TEA(0.8 mL)溶于30.0 mL甲苯中,在115 ℃下反應4 h,除去溶劑后通過柱層析(乙醚 ∶正己烷 ∶三乙胺=10.0 ∶7.0 ∶0.1,V∶V∶V)分離純化得到0.19 g化合物7:白色固體,產率53%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.57(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.00(d,J=8.1 Hz, 2H), 3.66(d,J=3.9 Hz, 1H), 3.49(s, 4H), 3.01～2.73(m, 2H), 2.52(t,J=10.9 Hz, 1H), 2.15～1.91(m, 2H), 1.78～1.57(m, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 171.76, 143.03, 136.88, 129.49, 91.02, 63.12, 61.32, 52.67, 50.97, 33.89, 33.86, 26.03, 25.93;19F NMR(376 MHz, CDCl3)δ: -222.84; ESI-MSm/z: Calcd for C18H18D6FINO2{[M+H]+} 438.12, found 438.39。

(6) 化合物8的合成

根據文獻[14]報道的方法合成化合物8。在0 ℃下,向化合物3(0.50 g, 6.00 mmol)的CH2Cl2(3.0 mL)溶液滴加TsCl(1.26 g, 6.60 mmol)和吡啶(0.5 mL, 6.60 mmol)的CH2Cl2(3.0 mL)溶液,反應液升至室溫攪拌4 h,加飽和NaCl溶液(30.0 mL)淬滅反應,CH2Cl2(3×30.0 mL)萃取,有機相用無水硫酸鈉干燥,過濾除去溶劑后通過硅膠柱層析(正己烷 ∶乙酸乙酯=50 ∶50,V∶V)純化,得到0.75 g化合物8:無色透明油狀液體,產率53%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.75(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33(d,J=8.0 Hz, 2H), 2.61(dd,J=7.9 Hz, 4.4 Hz, 1H), 2.41(s, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 144.98, 132.78, 129.95, 127.80, 67.03(quint.,JC,D=23.2 Hz), 57.28(quint.,JC,D=22.1 Hz), 32.52(quint.,JC,D=19.5 Hz), 21.60; ESI-MSm/z: Calcd for C10H9D6O4S {[M+H]+}237.11, found 237.06。

(7) 化合物9的合成

將化合物6(0.07 g, 0.20 mmol)、化合物8(0.04 g, 0.15 mmol)、 TEA(15 μL)溶于CH3CN(3.0 mL)中,于80 ℃加熱回流4 h,除去溶劑后,加CH2Cl2(5.0 mL)溶解殘余物,再用5%氫氧化鈉(5.0 mL)洗滌,收集有機相,除去溶劑后干燥得到0.05 g化合物9:淡黃色油狀液體,產率69%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.55(d,J=8.3 Hz, 2H), 6.96(d,J=6.5 Hz, 2H), 4.73(s, 1H), 3.61(d,J=17.8 Hz, 2H), 3.49(dd,J=3.4 Hz, 1.6 Hz, 3H), 2.97(dd,J=12.9, 5.0 Hz, 1H), 2.89(s, 1H), 2.51(t,J=12.7 Hz, 1H), 2.17～1.98(m, 2H), 1.78～1.57(m, 3H);13C NMR(101 MHz, CDCl3)δ: 172.08, 142.28, 136.98, 129.46, 91.31, 64.65, 59.32, 52.98, 51.39, 33.87, 33.61, 26.36, 24.91; ESI-MSm/z: Calcd for C18H19D6INO3{[M+H]+} 436.13, found 436.43。

(8) 化合物10的合成

將化合物9(0.05 mg, 0.10 mmol)溶解在CH2Cl2(0.5 mL)中,加入甲基磺酸酐(0.04 g, 0.23 mmol)。攪拌24 h后,用高效液相色譜監測。反應完全后加入2.0 mL乙醚沉淀,除去分離出的懸濁液,殘余物用1.0 mL的CH2Cl2溶解,再次加入乙醚,重復洗滌3次。將殘余物真空干燥,得到0.04 g甲磺酸鹽前體化合物10:白色固體,產率72%;1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 8.77(s, 1H), 7.64(d,J=7.9 Hz, 2H), 6.96(d,J=8.0 Hz, 2H), 4.32(s, 2H), 3.51～3.36(m, 4H), 3.17(s, 3H), 3.08(d,J=6.3 Hz, 1H), 2.86(s, 4H), 2.59(s, 1H), 2.44(s, 1H), 2.28～2.07(m, 2H), 1.96(d,J=14.7 Hz, 1H);13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ: 173.99, 137.84, 137.78, 129.45, 93.29, 63.60, 62.24, 52.68, 49.06, 39.39, 37.24, 34.16, 31.84, 24.47, 23.56; ESI-MSm/z: Calcd for C19H20D6INO5S {[M+H]+} 514.10, found 514.29。標記前體化合物10的高效液相色譜和質譜如圖3所示。根據圖4中標記前體化合物10的核磁共振氫譜所知,δ值為8.77(s,1H), 3.17(s, 3H)處的信號峰為甲磺酸鹽上的氫;圖5中核磁共振碳譜δ值為39.39處的信號峰對應甲磺酸鹽上的碳。

m/z

δ

δ

1.3 探針[18F]7的放射性合成

探針[18F]7的放射性合成路線如圖6所示。回旋加速器產生18F離子經氮氣傳輸被吸附在陰離子交換柱(QMA)上,用1.1 mL淋洗液(含15 mg K222和3 mg K2CO3的10%乙腈水溶液)洗脫18F離子至反應管中,乙腈干燥2次后,加入4 mg標記前體化合物10(溶解于100 μL CH3CN和1.0 mL TAA中),100 ℃反應20 min。反應結束后采用半制備型HPLC分離,液相條件為甲醇∶水∶三乙胺=75.0 ∶25.0 ∶0.1(V∶V∶V),接峰組分用水稀釋,通過C18柱吸附標記探針[18F]7,洗去多余的18F離子,再用2.0 mL乙醇淋洗進西林瓶,即得純化后探針[18F]7的乙醇溶液。取探針[18F]7(10 μCi, 5 μL)與化合物7(5 μL)共進樣,用配備放射性檢測器和紫外檢測器的HPLC分析其結構和放射性化學純度。

圖6 探針[18F]7的放射合成路線

1.4 探針[18F]7的體外穩定性測定

采用放射性HPLC測定體外穩定性。取適量探針分別與PBS(pH 7.4)和FBS在37 ℃下孵育不同時間(0, 1, 2, 4, 6 h)。在每個時間點取樣稀釋至濃度為100 μCi/mL,取10 μL進樣,利用放射性HPLC分析放射性化學純度。HPLC條件為甲醇 ∶水 ∶三氟乙酸=40.0 ∶60.0 ∶0.1(V∶V∶V)。

1.5 探針[18F]7的脂水分配系數測定

取探針(1 μCi)加入到含有正辛醇(3.0 mL)和PBS(3.0 mL, pH 7.4)的離心管中,室溫下渦旋振蕩5 min,離心(4000 r/min,5 min)后分別取正辛醇(1.0 mL)和PBS(1.0 mL)于γ計數管中測定放射性計數(CPM),取1.0 mL正辛醇相加入到含正辛醇(2.0 mL)和PBS(3.0 mL)的離心管中。重復上述操作5次,根據公式LogP=Log(CPM正辛醇/CPMPBS)計算得到探針的脂水分配系數,結果用平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 標記前體化合物10的化學結構分析

標記前體化合物10通過質譜和高效液相色譜進行初步表征,結果如圖3所示,HPLC保留時間為16 min,純度大于99%,質譜峰分子量514.29對應{[M+H]+}的分子離子峰。通過1H NMR和13C NMR進一步證明了標記前體化合物10的結構,結果如圖4～5所示。

2.2 探針[18F]7的放射性化學分析

采用前體化合物10進行一步法18F標記,經過半制備和C18純化得到探針[18F]7。探針[18F]7與化合物7共進樣,結果如圖7所示,探針[18F]7的保留時間與非放射性對照化合物7保留時間一致且探針結構正確,放射性化學性純度大于99%,放射性化學產率為5%。該標記方法可應用于市售的18F多功能合成模塊進行一步法自動化標記,有利于臨床上放射性藥物的生產和應用。

Time/min

2.3 探針[18F]7的體外穩定性

良好的探針體外穩定性有利于體內生物學活性的研究,探針[18F]7體外穩定性結果如圖8所示,探針[18F]7在PBS和FBS中6 h內僅有1個明顯的色譜主產品峰,未見其它放射性雜質,表明探針[18F]7在PBS和FBS中有較好的穩定性,有利于探針進一步的體內生物學研究。

Time/min

2.4 探針[18F]7的脂水分配系數

腦顯像探針的親脂性是保證藥物透過血腦屏障的重要因素之一,研究表明,脂水分配系數系數在1.0～3.5之間[15],易于透過血腦屏障。本文研制的探針[18F]7的LogP值為2.15±0.17,表明探針[18F]7親酯性較好,有透過血腦屏障的潛力。

本文采用氘代合成策略實現了一種DAT探針[18F]FP-CIT的氘代結構[18F]FP-CIT-d6([18F]7)的合成。首先合成非放射性對照化合物7和標記前體化合物10,再利用18F親核取代法標記制備了高純度的放射性探針[18F]7。體外理化性質測定結果表明:探針具有較好的體外穩定性和親酯性。簡便的標記方法和良好的理化性質,為探針[18F]7進一步的體內生物活性研究提供了堅實的基礎。