阿伐那非及其有關物質研究進展

吳小霞, 趙夢夢, 劉 虎, 孫允凱,3*

(1. 南華大學 化學化工學院,湖南 衡陽 421001; 2. 嘉實(湖南)醫藥科技有限公司,湖南 長沙 410220; 3. 常州工學院 化工與材料學院,江蘇 常州 213032)

勃起功能障礙(ED)作為成年男性常見的性功能障礙之一,是指無法達到或維持足夠的勃起而產生的令人滿意的性行為[1],表現為一種對生活質量有顯著負面影響的現象。ED影響了世界各地數以百萬計人的性生活及其妻子身心福祉和生活質量[2]。研究表明,加拿大存在40%的成年男性患有勃起功能障礙,而美國大約有1000～3000萬男性患有不同程度的ED[3]。2021年中國衛健委調查數據顯示,我國成年男性ED總體患病率高達40.5%。 ED的理想治療方法應該體現在易于給藥、無創、不疼痛、高效和副作用小等方面[4]。由于人類早期對勃起的基本生理生化機制了解有限,可采取的治療方法主要包括心理和激素策略,以及陰莖植入物和真空裝置的使用等。隨著人們對勃起機制的深入了解,研究人員開發了體內注射和口服5型磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑的策略。其中,口服PDE5抑制劑徹底改變了ED的治療方式,并因其有效性和良好的安全性成為一線治療方法[5-6]。

PDE5抑制劑在男性勃起功能障礙等疾病中具有廣泛應用。歐洲藥品局批準了3種治療ED的PDE5抑制劑[7],即西地那非、他達拉非和伐地那非。BOOLELL[8]最早提出用西地那非來治療男性勃起功能障礙,使其成為第1個用于治療男性勃起功能障礙的PDE5抑制劑[9]。該抑制劑經腸道迅速吸收,可在30～60 min后起效,1 h內達到峰值血漿濃度[10],半衰期(t1/2)為3～5 h,作用時間最長可達12 h[11]。西地那非雖然可以有效地改善勃起功能,但其與PDE6受體存在一些交叉反應性,而PDE6受體存在于視網膜光感受器中,因而會導致一些患者的色覺異常[12-13]。由于西地那非可經腸道吸收,若食用脂肪含量高的食物會減少其吸收,從而延長作用時間。在西地那非的研究基礎上,又推出了伐地那非和他達拉非,兩者均于2003年批準上市。伐地那非在給藥30 min后起作用,1 h內達到峰值血漿濃度,t1/2為4～5 h[14-15]。雖然伐地那非作用效果是西地那非的10倍,但高脂肪的食物同樣會降低其效果[16]。他達拉非在給藥30 min后有效,2 h內達到峰值血漿濃度[17]。然而,他達拉非的t1/2為17 h,因而其藥效作用持續時間長達36 h,且療效不受脂肪攝入量的影響[18]。他達拉非與PDE11有一定的交叉反應,同樣會給患者帶來副作用。之后研究人員又陸續開發了3個其他PDE5抑制劑:烏地那非[19](udenafil),米羅那非[20](mirodenafil)和阿伐那非。

阿伐那非作為治療男性勃起功能障礙的高效PDE5抑制劑,其安全性受到了人們的廣泛關注。除了定量藥物外,還必須了解藥品中雜質的來源和控制方法。研究人員開發了許多檢測藥品中PDE5抑制劑含量的方法,包括TLC和HPLC-PDA-MS[21]、 LC-ESI-MS/MS[22]、 LC-QTOF-MS[23]以及LC-MS/MS[24]等。為了滿足各藥物監管機構的要求,阿伐那非用藥限度應控制在毒理學的門檻以內[25]。合成藥物中的雜質主要源于起始底物、試劑、溶劑和副反應,其次在溫度、濕度和光照等因素影響下,藥品質量會隨時間發生變化,因而藥品穩定性測試是藥物審批過程中評估藥品質量的重要步驟。本文對阿伐那非合成過程中確定的有機雜質和阿伐那非的降解產物及控制分析方法進行總結,以便開發出更優的鑒定表征和控制阿伐那非有關物質限度的方法。

1 阿伐那非概述和合成

1.1 阿伐那非概述

阿伐那非(avanafil),化學名為(S)-4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(2-(羥甲基)-1-吡咯烷基)-N-(2-嘧啶基甲基)-5-嘧啶甲酰胺,分子式為C23H26ClN7O3,商品名為Stendra,是由三菱田邊制藥公司開發的一種cGMP特異性PDE5抑制劑,于2012年經美國FDA批準上市。藥品呈橢圓形、為刻有規格的淡黃色片劑,規格有50 mg、 100 mg和200 mg[26]。實際上,該藥品是一種白色的結晶粉末,可溶于甲醇和乙腈而幾乎不溶于水,可溶于0.1 mol/L鹽酸,pKa值為9.04。體外研究表明,阿伐那非對PDE5的選擇性比對其他已知的磷酸二酯酶的選擇性高,起效更快[27-28],副作用更少[29],因此,阿伐那非作為新型藥物,具有良好的市場前景。

1.2 阿伐那非的合成

迄今為止,許多文獻[30]報道了阿伐那非的合成路線。YAMADA課題組[31]最早提出了阿伐那非的制備過程(圖1)。該過程主要為:3-氯-4-甲氧基芐胺(SM1)與4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酸乙酯(1)發生親核取代反應合成4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲硫基嘧啶(2);化合物2被氧化得到氧化產物4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-甲基亞磺酰基嘧啶(2),化合物2與L-脯胺醇(SM2)發生親核取代反應生成(S)-4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-乙氧基羰基-2-(2-羥甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(4);化合物4經水解后得到化合物(S)-4-(3-氯-4-甲氧基芐基氨基)-5-羧基-2-(2-羥甲基-1-吡咯烷基)嘧啶(5);化合物5與2-氨甲基嘧啶(SM3反應制得阿伐那非。該合成方法所需試劑較多,操作工序和反應條件復雜,反應時間較長,產品收率不高。目前主流工業化生產是在該合成路線的基礎上,改變水解和取代的先后順序,可有效避免外消旋化,提高阿伐那非的產率和純度。

圖1 YAMADA[31]的阿伐那非合成路線

基于YAMADA課題組的阿伐那非制備方法,我國研究者對其進行了改進。2013年,許學農[32]在其專利中報道了阿伐那非的合成路線(圖2)。將6-氨基-1,2二氫嘧啶-2-酮-5-甲酸乙酯(6)與SM1反應生成6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-酮-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸乙酯(7);化合物7被SM2發生親核取代后,得到化合物(S)-4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(2-(羥甲基)吡咯烷-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸乙酯(8),化合物8水解后再與SM3反應制得阿伐那非。該路線符合綠色化學的原子經濟性理念,操作工序簡潔。但由于化合物6不屬于大宗工業化原料,導致制備阿伐那非的成本較高,且中間體8易水解,會使手性片段發生外消旋化,降低阿伐那非收率和純度。此外,許學農[33]還報道了一種以胞嘧啶(Cytosine)為起始原料,經過取代、縮合以及鹵代加成制備阿伐那非的方法。該法雖然原料易得,工藝簡單,但其鹵代試劑為液溴,當采用含鎳化合物做催化劑時,液溴和含鎳催化劑的使用會增加實驗安全風險且引入元素雜質,不利于工業生產。

圖2 許學農[33]的阿伐那非合成路線

2014年,程曉峰等[34]開發了一條適合工業化生產的阿伐那非合成路線(圖3)。將化合物1和SM1作為原料,經反應得到化合物2;將化合物2水解后得到6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氫嘧啶-5-甲酸(9);化合物9與SM3反應得6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-(甲硫基)-1,2-二氫嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(10);之后經m-CPBA氧化后得到6-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-2-甲基亞磺酰基-1,2-二氫嘧啶-N-嘧啶-5-甲酰胺(11);化合物11與SM2反應得到阿伐那非。與YAMADA課題組和許學農的合成路線相比,該合成路線采用先水解后酰胺化再進行取代的方法,可有效避免消旋化產物的生成,提高了反應的產率。

圖3 程曉峰[34]的阿伐那非合成路線

2015年,PRADHAN課題組[35]報道了一種通過在極性溶劑中還原(4-((3-氯-4-甲氧基芐基)氨基)-5-((嘧啶-2-基甲基)氨基甲酰基)嘧啶-2-基)-D-脯氨酸(12)來制備阿伐那非的方法(圖4)。起始物1和SM1發生取代反應生成化合物2,化合物2水解成酸后與SM3反應生成化合物10,經氧化后再與D-脯氨酸(SM4)反應得化合物12。該路線得到的阿伐那非純度高且產率高,其制備過程簡單,利于工業化生產。

圖4 PRADHAN[35]的阿伐那非合成路線

2016年,李志強等[36]提出了一條新的阿伐那非合成路線(圖5)。化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-5-甲酰氯(13)和SM3在-10～5 ℃反應條件下生成化合物4-氯-2-(甲硫基)嘧啶-N-(-2-甲基)嘧啶-5-甲酰胺(14);之后在0～3 ℃條件下,將化合物14與SM1反應得到化合物10;最后將化合物10與SM2在室溫條件下反應18～20 h得阿伐那非。該合成方法反應步驟少,產品收率高,但起始物料為非大宗化學品,將使成本升高。

圖5 李志強[36]的阿伐那非合成路線

2018年,楊虎星等[37]提出了一種阿伐那非的制備方法(圖6)。以甲基硫脲硫酸和乙氧亞甲基丙二酸二乙酯為初始原料,依次經過環合、氯化反應得到化合物1;將化合物1與3-氯-4-甲氧基芐胺SM1進行取代、水解后得化合物9;將化合物9與SM3反應得到關鍵中間體10,化合物10經氧化后與SM2反應生成阿伐那非。該路線具有原料易得、操作簡便,反應條件溫和,產品收率較高的優點。

圖6 楊虎星[37]的阿伐那非合成路線

湯俊等[38]提出了改進的阿伐那非合成路線(圖7)。將4-[(3-氯-4-甲氧基苯基)甲氨基]-2-[(S)-2-羥甲基吡咯-1-基]嘧啶-5-羧酸和2-氨甲基嘧啶經硼酸卟啉催化反應后得阿伐那非。反應結束后目標產物與催化劑易于分離,大大降低了后期產物分離提純的難度,回收的催化劑可以循環利用,整個催化反應具有簡單、綠色等特點。

圖7 湯俊[38]的阿伐那非合成路線

2 阿伐那非及其有關物質檢測

2.1 有關物質的定義及影響

有關物質是指化學結構與活性成分類似或具有淵源關系的有機雜質,包括副反應產物、中間體、聚合體、起始原料和貯藏過程中的降解產物等[39]。中國藥典上詳細記錄上市藥物的檢測方法和限度,其中有關物質的檢測是關鍵性的研究項目之一。而雜志的檢測需要結合藥品的工藝過程和結構特點來進行分析,從而檢測出可能的雜質來源,同時將雜質控制在一個安全、合理的限度范圍內[40]。通過雜質譜分析掌握藥品雜質的概貌,可評估雜質的風險水平,并建立有針對性的分析方法,從而盡可能檢測出各種潛在的雜質[41]。而對藥物的降解進行研究,能實現從雜質產生的源頭方面主動把控藥品雜質風險,保證對藥品質量的有效控制。阿伐那非結構具有酰胺、芳基氯和羥基等官能團,因而在水解過程中很容易變為有毒的降解物。根據ICH指南Q1A(r2)的要求,必須對阿伐那非及其有關物質進行徹底的化學穩定性研究,進而開發出適合阿伐那非高效、靈敏的控制分析方法。

2.2 高效液相色譜(HPLC)法

高效液相色譜(HPLC)是鑒別、量化和分離混合物成分最常用的技術[42],其在藥物分析的應用中為治療性藥物監測和臨床研究提供了一個強有力的工具[43-44]。近年來,研究人員開發了一系列的阿伐那非及其有關物質的檢測分析方法。例如,HEGAZY[45]建立了靈敏、簡單的反相HPLC法,并以他達拉非作為內標測定的同時對其進行了驗證。在EclipseC18柱(150.00 mm×4.60 mm, 5.00 μm粒徑)的運行時間內,使用流動相為乙腈:0.15%三乙胺(40 ∶60,V∶V),在7.0 min內實現了分離。分析阿伐那非在1.00 mL/min的流速下的熒光效果,檢測值為236/370 nm,達泊西汀的熒光檢測為236/410 nm。通過天然熒光測定,阿伐那非和達托霉素的響應值在0.05～40.00 μg/mL和0.01～30 μg/mL的范圍內呈線性變化,檢測限分別為0.043 μg/mL和0.007 μg/mL。

KUMAR課題組[46]提出了一種測定阿伐那非片中降解物和已知雜質的穩定性指示HPLC方法。阿伐那非片在酸、堿、氧化、光熱和潮濕條件下會觀察到明顯降解。通過對不同條件下阿伐那非的降解產物用RP-HPLC進行分離純化,在45 ℃時,采用慣性ODS3柱(3.00 μm, 4.60 mm×250.00 mm)。流動相A為0.10%三氟乙酸和三乙胺水溶液,流動相B為水和乙腈(20 ∶80,V∶V)。采用1.2 mL/min梯度的洗脫模式,并在245 nm處記錄峰值響應,最終得到了較好得分離色譜圖。雖從已知雜質中觀察到了分離出的降解物,但降解產物峰未較好地分離。該方法具有特異性、精確、穩健和線性,是一種準確測定雜質含量的穩定性指示方法,可用于生產樣品時常規分析以及雜質含量檢測。

2022年,本課題組[47]提出了一種新的穩定梯度超高效液相色譜法(UPLC),檢測了多個實驗室批次中含量為0.29%～1.63%的4種雜質(圖8),并且首次報道了Imp-D的合成路線。該UPLC方法采用HSSC18(50.00 mm×2.10 mm,粒徑1.80 μm)柱,柱溫35 ℃,流動相組成為甲酸銨(20.00 mM)和乙腈,采用梯度洗脫,檢測波長為239.00 nm。結果表明,該方法有很好得特異性、線性度、精密度、準確性和靈敏度,獲到的色譜也說明該方法對阿伐那非和有關物質優異的分離效果,符合監管機構要求的質量控制限度。

圖8 Imp-A、 Imp-B、 Imp-C和Imp-D的結構

2.3 基于QbD的HPLC法

(1) QbD用于HPLC藥物分析方法的建立

質量源于設計(quality by design, QbD)的概念是在人們將所有潛在風險融入到藥物研發和設計中而產生的。ICH Q8中明確指出QbD可用于新藥分析方法的建立和評估[48]。HPLC因其強大的分離能力而成為藥物分析強有力的工具,對于針對不同藥物而建立的HPLC法,需要對分析方法進行驗證并考察專屬性、線性、精確度和準確度等。而考察這類特性一般在研究的最后階段,同時需要投入大量的人力及物力。QbD便可用于解決此種問題,用風險管理的過程質量控制方法,將潛在風險融入到最初階段,從源頭解決問題。隨著QbD理念的引入及應用,研究者們已開始逐步在分析方法開發中運用QbD的理念[49]。

(2) 基于QbD的HPLC法檢測阿伐那非制劑

KOTHARI課題組[50]開發了用于檢測二元混合物和劑型中的阿伐那非和達泊西汀的多元紫外分光光度法和基于QbD的HPLC法,同時還提出了4種測定藥片中阿伐那非和達泊西汀的化學計量輔助方法(CLS、 PLS、 PCR和NPLS)。實驗過程中采用Box-Behnken設計優化了4個關鍵變量,即設計了1個實驗程序,揭示流動相比、溫度柱烘箱溫度、流速和pH對目標藥物的峰面積、對稱性、分辨率和保留時間的影響。該HPLC法雖能高效準確的測出藥片中的阿伐那非的含量,但卻無法測定降解產物以及阿伐那非中的雜質。

PATEL等[51]報道了一種基于QbD法的詳細穩定的HPLC-PDA方法。應用系統QbD方法,通過篩選和優化來推導阿伐那非全面的化學穩定性。主要參數篩選采用石川圖和風險評估方法,并通過中心復合設計(CCD)優化了4個關鍵因素:C18柱(250.00 mm×4.60 mm, 5.00μm),流動相為10mM醋酸銨緩沖液:ACN(60 ∶40,V∶V), pH為4.5,流速為0.90 mL/min,柱溫為20 ℃,從而獲得不同條件下阿伐那非的降解峰。阿伐那非的化學穩定性研究表明,在氧化、熱和酸堿性條件下阿伐那非容易降解。該方法有利于藥物在合成、保質期和有效期確定期間的藥物質量管理。

2.4 LC-MS法

(1) LC-MS/MS方法

液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)作為高效的分離鑒定分析方法,在有機合成、藥物分析和生物蛋白酶等方面有著重要的作用。PONTAROLO課題組[52]開發和驗證了一種基于LC-MS/MS的新的生物分析方法,可以同時測定6種人血漿中PDE5抑制劑(阿伐那非、洛地那非、西地那非、他達拉非、烏地那非和伐地那非)的含量。該方法采用XbriceC18柱,柱溫為40 ℃,以水和乙腈作為流動相(甲酸和甲酸銨)并按梯度模式進行分離。用乙醚提取人血漿,以磺基喹惡啉作為內標,得到完全分離的色譜。根據目前的指南,對該方法進行了驗證,發現PDE5抑制劑具有選擇性、線性且精確、無殘留和無基質效應,但該方法只能測定PDE5抑制劑的含量,不能檢測其他雜質。

PATEL等[53]針對阿伐那非開發了一種新型的LC-MS/MS兼容方法,鑒定和表征了其降解產物。根據LC-MS/MS產生的碎片離子數據,解析了16種降解產物的結構(圖9),進一步提出了阿伐那非在酸、堿性、氧化、光解和熱降解條件下的合理降解機制,從而表明其降解是由親核取代反應和酰胺水解引起的。從結構上可以看出,酰胺基容易水解,而芳基氯和氫氧基易發生光分解。該方法雖能分析阿伐那非的降解雜質并解析其結構,但降解產物的分離效果不是很理想。

圖9 16種降解產物的結構

(2) LCMS-IT-TOF法

CAN等[54]采用LC-DAD、 LC-MS/MS和LCMS-IT-TOF測定了藥物制劑中阿伐那非含量并對其降解產物做定性分析,鑒定新型降解產物。LC-DAD或LC-MS/MS技術均可以用于阿伐那非及其降解產物和達泊西汀的無干擾測定,同時可用于QC實驗室的常規分析。當采用LC-DAD和LC-MS/MS儀器時,該方法可分別在11.80 min和12.60 min范圍內檢測和定量阿伐那非。而采用LCMS-IT-TOF法首次鑒定出了在氧化條件下產生的新型降解產物(圖10)。阿伐那非的檢測時間約為14.70 min,而已知降解物Imp-E和Imp-F以及新的降解產物Imp-G的保留時間分別為13.30、 20.50和33.50 min,因此,LCMS-IT-TOF在新的降解產物的研究中具有優越性。

圖10 Imp-E、 Imp-F和Imp-G的結構

(3) LC-QQQ-MS法

由于阿伐那非在長期給藥后仍存在副作用,因此有必要對其藥代動力學和生物利用度參數進行研究。KAMMOUN課題組[55]建立了一種靈敏的高效液相色譜-三重四質譜法(LC-QQQ-MS),用于分析大鼠血漿和大腦中的阿伐那非。研究者建立、優化了液-液提取方法,并用于從血漿和腦勻漿中最大限度地回收阿伐那非。在NuncledurC18柱上進行分離,流動相由0.10%甲酸和乙腈(29 ∶71,V∶V)組成,流速為0.5 mL/min,采用QqQ-MS應用正多反應監測模式進行監測,最終得到分離完全的色譜。該方法性能良好,并成功地應用于大鼠血漿和腦組織勻漿中阿伐那非及相關代謝物的定性和定量分析,測定得到單劑量口服和經皮應用后其在大鼠血漿和腦組織中的藥代動力學參數。

HPLC、 LC-MS/MS、 LCMS-IT-TOF和LC-QQQ-MS等方法都能對阿伐那非與有關物質的含量進行準確檢測,并通過質譜數據進行結構解析。在探尋這些分析方法最優色譜條件的過程中,除了傳統的對照分析實驗外,研究人員還結合化學計量輔助方法,通過設計實驗程序去揭示流動相比、柱溫、流速和pH對峰面積、對稱性、分辨率和保留時間對阿伐那非與有關物質檢測過程的影響。高效液相與其他技術聯用的方法不僅能夠準確定量阿伐那非和有關物質,同時對有關物質結構特征和阿伐那非降解原理有了更深入的了解。

本文簡述了阿伐那非的合成工藝路線,論述近年來研究人員對合成路線的改進,并開發了針對阿伐那非及其有關物質的檢測分析方法。HPLC法與基于QbD的HPLC法,能夠準確測出阿伐那非的含量;穩定性指示HPLC法,能從雜質中清楚觀察到降解物;HPLC-PDA法成功分離出在不同降解條件下的降解物。研究人員開發了各種高效液相與其他技術聯用的分析檢測方法,通過LC-TOF-MS法,鑒定阿伐那非的有關物質和降解產物峰;用LC-MS/MS法成功分離阿伐那非在酸、堿性、氧化、光解和熱降解條件下的多種降解物,并解析了降解產物的結構;通過LC-QQQ-MS法,測定了阿伐那非給藥后的藥代動力學參數等。HPLC與其他技術的聯用作為高效的分析方法,將在藥物分析發展中發揮更加重要的作用。針對不同藥物建立高分辨、超微量的分析方法,保證藥品質量和用藥安全,促進原料藥研發質量水平的提高。