不同產地金花白茶滋味代謝物組成及差異分析

孫紅玉，陳義琴，石琳琳，羅娟，趙楠楠，肖力爭，3，4*

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學 植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學 農業農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南 長沙 410128）

金花白茶是采用白茶為原料，融合“發花”技術制成的緊壓白茶產品。“發花”是指以采用合適茶葉原料蒸壓成緊壓茶后，在烘房中通過控制外界溫、濕度等環境條件，促使優勢微生物——冠突散囊菌（Eurotium cristatum）生長繁殖的過程[1]。冠突散囊菌在茶磚或茶餅內產生，形似米蘭花，色澤金黃艷麗金黃色閉囊殼（俗稱“金花”）。冠突散囊菌是一種常見于茯磚茶中的益生菌，隨著對其研究的深入，學者們發現在其他茶類上均能培育出冠突散囊菌[2-3]，且能夠改善粗老茶葉的品質，“發花”具有提高中低檔白茶品質的潛能[1，4-5]。非靶向代謝組學側重于檢測盡可能多的代謝物組，在分析茶葉等復雜食品時是一種有價值的工具，能應用于分析茶葉的品質差異性和風味特征，已經被應用于研究綠茶、紅茶、烏龍茶、青磚茶、黑茶[6-10]等茶葉中的差異代謝物和代謝物的變化規律。目前，對金花白茶的研究主要集中在通過氣相色譜-質譜聯用儀測定香氣和液相測定兒茶素組分，來探究“發花”對白牡丹和壽眉等白茶原料的風味品質影響[1，4，11]。福建政和白茶是由國家級良種福安大白茶的鮮葉加工而成的產品，香氣較清純，滋味清鮮醇爽[12]；湖南汝城白茶的加工品種為湖南四大地方特色茶樹種質資源之一的汝城白毛茶[13]，該品種呈現水浸出物和茶多酚含量高[14]等品種特點，花香濃郁持久，滋味鮮、甜醇；云南景谷白茶是以景谷大白茶為原料加工而成的產品，具有甜香和果香，滋味甜醇鮮爽[15]，是云南特色茶葉產品。本研究以福建、湖南和云南3 個省的經典白茶為原料，融合“發花”工藝，基于感官審評、代謝組學分析并結合多元統計分析的方法，探討不同原料的金花白茶代謝物組成及差異，研究結果將有助于進一步了解不同原料加工的金花白茶成品品質風味的形成和差異性，為金花白茶品質分析及保健功能的挖掘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗采用的3 種白茶原料分別來自福建政和、湖南桑植和云南景谷3 個產地。政和白茶（M-ZH）、汝城白茶（M-RC）和景谷白茶（M-JG）分別由福安大白茶、汝城白毛茶和景谷大白茶茶樹品種的鮮葉制成。所有白茶均為2021 年9～10 月在相應的產區用一芽三葉鮮葉加工制成的白茶，隨后于2021 年11 月按照發花工藝（原料→篩分整理→汽蒸→渥堆→稱茶和蒸壓→發花→干燥→成品）加工制得金花白茶，分別稱為政和金花白茶（J-ZH）、汝城金花白茶（J-RC）和景谷金花白茶（J-JG），按照五點取樣法取樣后，-4 ℃低溫密封保存備用。

1.2 儀器與試劑

甲醇、甲酸、醋酸銨（色譜純）：德國賽默飛世爾科技公司；Vanquish UHPLC/Q ExactiveTMHF 液相色譜-質譜聯用儀、Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱：德國賽默飛世爾科技公司；D3024R 低溫離心機：美國Scilogex 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金花白茶加工工藝和樣品處理

工藝參數以湖南安化茯磚“發花”工藝為基礎，結合預試驗及生產實際確定基本加工工藝為白茶（50 kg）→1 次汽蒸（145 ℃、10 s）→渥堆（13 h）→2 次汽蒸（145 ℃、10 s）→手筑壓制（選用500 g 手筑茶磚模具）→發花（調溫控濕自動化烘房，歷時12 d）→干燥（18 d）→成品金花白茶。

選用3 個產地的白茶加工成金花白茶作為樣品，參照GB/T 8302—2013《茶取樣》，取成品金花白茶150 g，采用液氮固樣方式后，-4 ℃低溫冰箱密封保存，試驗前通過微型植物粉碎機粉碎茶樣待用。

1.3.2 茶葉感官評價

茶葉感官評價由5 名茶葉審評專家組成審評小組，成員均已取得國家高級評茶員職業資格。按國家標準GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》進行感官審評。

1.3.3 代謝組學檢測方法

茶樣檢測的前處理方法：取100 mg 液氮研磨的組織樣本，置于EP 管中，加入500 μL 的80%甲醇水溶液；渦旋振蕩均勻后，冰浴靜置5 min，15 000 r/min、4 ℃離心20 min；取一定量的上清液加水稀釋至甲醇含量為53%；15 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液，進樣，采用液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法進行分析。

質量控制樣的制備：從每個試驗樣本中取等體積樣本混勻作為質量控制樣本（quality control，QC）。空白對照樣的制備：53%甲醇水溶液代替試驗樣本，前處理過程與試驗樣本相同。色譜條件為柱溫40 ℃，流速0.2 mL/min；流動相條件為正模式，流動相A 為0.1%甲酸，流動相B 為甲醇；負模式：流動相A 為5 mmol/L 醋酸銨，pH9.0，流動相B 為甲醇。

質譜條件：掃描范圍選擇m/z100～1 500；電噴霧離子源的設置為噴霧電壓3.5 kV；鞘氣流速0.241 MPa；輔助氣流速）10 L/min；離子傳輸管溫度320 ℃。

1.4 數據處理

將下機數據導入Compound Discoverer3.1 搜庫軟件后，對每個代謝物進行保留時間、質荷比等參數的簡單篩選，然后通過分子離子峰和碎片離子進行分子式的預測并與mzCloud、mzVault 和Masslist 數據庫進行比對，用blank 本去除背景離子，并對原始定量結果進行標準化處理，最后得到代謝物的鑒定和相對定量結果。應用軟件SMICA14.1 進行主成分分析（principal component analysis，PCA）、層次聚類分析（hierarchical clustering，HCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA），進而得到變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值并計算代謝物在兩組間的差異倍數（fold change，FC）[16]。差異代謝物篩選的標準為VIP>1，P 值<0.05 且FC≥2。

2 結果與分析

2.1 金花白茶滋味品質特征感官分析

白茶和金花白茶的感官評價結果見表1。

表1 白茶和金花白茶樣品的感官品質評價Table 1 Sensory quality evaluation of white tea and Jinhua white tea samples

由表1 可知，白茶均呈自然的萎凋狀態，其中M-RC 干茶色澤最淺，M-JG 色澤最深，這與湯色相對應，M-ZH 湯色黃，M-RC 湯色淺黃，M-JG 湯色則為橙黃色，其中M-RC 的湯色最為明亮。在香氣方面，白茶香氣各具特色，整體香氣新鮮愉悅，其“清香花香”顯露出來，M-ZH 較清純略帶花香，M-RC 花香顯，M-JG 花香較濃郁。白茶的滋味以醇為主，M-ZH 滋味較醇厚，M-RC 內含物豐富，滋味醇，較鮮爽，M-JG 滋味較濃厚且帶花香。從葉底來看，M-ZH 和M-RC 的葉底較勻整，色綠褐，而M-JG 的葉底為尚嫩勻，有嫩梗，色紅褐，三者以M-RC 的葉底最為壯實、葉肉肥厚。

3 種白茶制成的金花白茶外形端正，松緊適度，內部金花（冠突散囊菌）尚茂盛，J-ZH、J-RC 和J-JG 的干茶色澤分別為棕褐、灰褐和紅褐。J-ZH 湯色呈橙紅，較亮，J-RC 為橙黃，較亮，J-JG 則是紅亮。J-RC 和JJG 的香氣以菌香混合原茶香為主，而J-ZH 主要是菌花香顯。葉底方面，J-ZH 綠褐，尚勻；J-RC 黃褐尚軟嫩；J-JG 紅褐帶綠尚嫩軟，有嫩梗。滋味方面，J-ZH 滋味較醇厚，有菌香，J-RC 滋味較醇厚，帶花香，J-JG 滋味較醇厚，略澀；茶葉的感官品質主要依賴于其次生代謝產物，由此可初步推斷，3 種金花白茶代謝產物差異較大，值得進一步探究。

2.2 代謝組學鑒定結果

金花白茶樣品的PCA 分析和HCA 聚類分析結果見圖1。

圖1 3 個產地樣品和QC 樣本的PCA 主成分分析圖和HCA 聚類圖Fig.1 PCA score plot and HCA clustering plot for three origin samples and QC samples

由圖1 可知，對J-ZH、J-RC 和J-JG 的代謝物進行高覆蓋檢測和正、負離子合并分析，政和金花白茶檢測到代謝物1 406 個，汝城金花白茶1 209 個，景谷金花白茶1 227 個，三者相同的代謝物有616 個。為了確定3 種金花白茶的代謝物的差異情況，對檢測到的代謝物進行主成分分析（PCA），其擬合參數R2X 為0.793，主成分1 和主成分2 的貢獻率分別為37.5%和28.2%，3 組樣品的PCA 分析見圖1，同一種金花白茶的6 個重復樣品距離較近，不同品種金花白茶的則相距較遠，說明數據重復性較好。J-ZH、J-RC、J-JG 分別位于不同象限，具有明顯區分，因此可以通過PCA 區分不同產地的茶樣。通過HCA 聚類圖1 可得，不同原料制成的金花白茶有明顯區分，這也和感官評價結果相對應。

2.3 代謝組學差異分析

PLS-DA 是一種廣泛使用的監督模式識別方法，政和金花白茶、汝城金花白茶和景谷金花白茶茶樣通過PLS-DA 進行兩兩比對和置換檢驗后，以VIP>1，P值<0.05 且FC≥2 進行代謝物篩選，與此同時結合與茶葉品質密切相關的成分，例如氨基酸類、酚酸類、黃酮類、鞣質類和生物堿類等[17]，共篩選出149 個差異代謝物。3 種金花白茶的差異代謝物種類與變化情況見表2。149 個主要差異代謝物的相對含量分布見圖2。

圖2 差異代謝物的熱圖分析Fig.2 Heatmap analysis of differential metabolites

表2 差異代謝物種類與變化情況Table 2 Differential metabolite species and variation

由表2 可知，兩種金花白茶相比得到的差異代謝物相對含量更多稱為高表達，低表達則相反。包括JZH 相對于J-JG 有78 個差異代謝物，64 個呈高表達，14 個呈低表達；J-RC 相對于J-JG 有65 個差異代謝物，23 個呈高表達，42 個呈低表達；J-RC 相對于ZH有74 個差異代謝物，42 個呈高表達，32 個呈低表達。3種金花白茶中差異代謝物最多的為黃酮類，J-ZH、JRC 和J-JG 分別有27、25 個和29 個代謝物，最少是維生素，分別為3、2 個和1 個代謝物。

3 種金花白茶的重要呈味物質有79 個，見表3。

表3 重要呈味代謝物Table 3 Important taste metabolites

由圖2 可知，橫向代表茶樣，縱向代表化合物，紅色代表化合物在茶樣中含量高于平均值，藍色則相反，顏色深淺代表含量高低程度，3 種金花白茶被分離并聚類為3 類，與HCA 的結果一致。3 種金花白茶的差異代謝物中有4 個為三者相同的差異代謝物，分別是表沒食子兒茶素（（-）-Epigallocatechin，EGC）、原兒茶醛（3，4-Dihydroxybenzaldehyde）、對香豆素（N-p-Coumaroylagmatine）、茶黃素-3，3'- 雙沒食子酸（Theaflavine-3，3-digallate），前3 種代謝物在RC 中相對含量較高，可以作為區分汝城金花白茶和其它兩種金花白茶的標志性化合物。

續表3 重要呈味代謝物Continue table 3 Important taste metabolites

2.3.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物是影響茶葉顏色和滋味的主要物質，冠突散囊菌能夠顯著提高白茶中黃酮類物質的總量[18]，3 個產地樣品共鑒定出55 個黃酮類化合物，如圖2a 所示，政和金花白茶中，甲基橙皮苷（Methyl-Hesperidin）、橙皮素（Hesperetin）、柚皮素（Naringenin）、山奈酚苷（Kaempferide）、牡荊素-4-O-葡萄糖苷（4'-OGlucosylvitexin）、槲皮素-3，4'-O-二β-吡喃葡萄糖苷（Quercetin-3，4'-O-di-beta-glucopyranoside）、槲皮素-3-α-L-阿拉伯氨基呋喃苷（Quercetin 3-alpha-L-arabinofuranoside）、楊梅素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（myricetin 3-O-beta-D-galactopyranoside）、芹菜素-C-戊糖苷（Apigenin-C-pentoside）等黃酮苷類物質含量顯著高于其他兩種金花白茶；表沒食子兒茶素（（-）-Epigallocatechin）、（-）-兒茶素沒食子酸酯（CG，（-）-Catechin Gallate）和兒茶素（Catechin，C）這3 種兒茶素在汝城金花白茶中含量顯著高于政和和景谷金花白茶的含量；景谷金花白茶與其他樣品相比，茶黃素-3，3'-雙沒食子酸（Theaflavine-3，3-digallate）、茶黃素（Theaflavin）、沒食子酸甲基酯（Methyl gallate）、原花青素A2（Procyanidin A2）、蘆丁（Rutin）、山奈酚（Kaempferol）、雙-C，C-戊糖基-芹菜素（di-C，C-pentosyl-apigenin）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷-6''-乙酯（Quercetin-3-O-beta-glucopyranosyl-6'-acetate）等代謝物呈高表達。

兒茶素類是茶葉多酚類的主體部分，會引起口腔起皺的收斂性和粗糙的口腔感覺的澀味[19]，原花青素是一類由（+）-兒茶素和（-）-表兒茶素組成的低聚類黃酮，具有苦味，茶黃素、茶黃素-3，3'-雙沒食子酸具有皺縮澀味，這些化合物的增加會促進茶葉沖泡的強度和澀味[10]，由表3 可知，其相對總量呈J-RC>J-ZH>J-JG。黃酮醇常與糖結合生成糖苷，黃酮醇O-糖苷在低閾值濃度下，黃酮醇苷具有引起口腔干燥、絲滑、和柔軟收斂性的澀味，且其呈味閾值濃度非常低，濃度范圍從0.001～19.800 mmol/L[20]，其相對總量呈J-JG>JZH>J-RC。橙皮素為具有獨特的風味的淡黃色固體和柚皮素均有增甜的作用[21]，相對總量呈J-ZH>J-RC>JJG。3 種金花白茶滋味較醇厚，但從黃酮類化合物的組成和相對含量可以推測，汝城金花白茶的收斂性稍強，景谷金花白茶口感更順滑，政和金花白茶滋味則更甜醇。

2.3.2 氨基酸及其衍生物

氨基酸是鮮味的主要來源，氨基酸組分和其他化合物的含量比例與茶葉清、鮮、醇、厚等滋味特征的均表現關系密切，氨基酸多為小分子狀態，這種趨勢可能是由于冠突散囊菌在生長繁殖過程中能分泌各種水解酶，使茶葉中的蛋白質水解所致[22]。由圖2c 可知，3 種金花白茶相比較，政和金花白茶中的L-（+）-精氨酸（L-（+）-Arginine）、2-羥基苯丙氨酸（2-Hydroxyphenylalanine）、L-蘇氨酸（L-Threonine）、（S）-谷氨酸（（S）-Glutamic acid）、L-谷氨酸（L-Glutamic acid）、對稱性二甲基精氨酸（SDMA）、S-腺苷高半胱氨酸（S-Adenosylhomocysteine）、L-丙氨酰-L-色氨酸（Ala-trp）、4-羥基異亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine）、組氨酸（Histidine）、N6-乙酰-L-賴氨酸（N6-Acetyl-Llysine）、L-丙氨酰甘氨酸（Ala-Gly）、D-（-）-谷氨酰胺（D-（-）-Glutamine）等呈高表達；汝城金花白茶的氨基酸類物質主要有N-乙酰-L-苯丙氨酸（N-Acetyl-Lphenylalanine）、甘氨酰-L-苯丙氨酸（Gly-Phe）、S-（5-腺苷）-L-高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine）、N-甲基蘇氨酸（N-Methylthreonine）呈高表達；景谷金花白茶有N-乙酰-L-天門冬氨酸（N-Acetylaspartate）、N-乙酰-L-酪氨酸（N-Acetyl-L-Tyrosine）、N-乙酰-DL-谷氨酸（N-Acetyl-DL-glutamic acid）、N-乙酰天門冬氨酸（N-Acetylaspartic acid）、N-（3-吲哚乙酰基）-L-丙氨酸（N-（3-Indolylacetyl）-L-Alanine）、吲哚-3-乙酸-谷氨酸（IAA-Asp）等氨基酸呈高表達。

由表3 可知，不同的氨基酸會呈現不同的味道，其中谷氨酸、谷氨酰胺、茶氨酸、蛋氨酸呈鮮味[23-24]，纈氨酸、絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸呈鮮味、甜味[23]，蘇氨酸呈甜味[25]，呈鮮味和甜味的氨基酸的相對總量為J-ZH>J-RC>J-JG。組氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸均為苦味[24]，呈苦味的氨基酸的相對總量為J-RC>J-ZH>J-JG。故此汝城金花白茶的茶湯苦澀味略重。

2.3.3 糖類

茶湯中的甜度很大程度上來自于可溶性糖[23]。淀粉、果膠等大分子糖在果膠酶等物質的水解作用下形成單糖、雙糖溶于茶湯，茯磚茶加工研究表明，冠突散囊菌在發花期間會產生纖維素酶和果膠酶，促進粗纖維物質轉化形成小分子糖類[26]，政和金花白茶中呈高表達的糖類化合物種類較多，由圖2b 可知，包括α-乳糖（α-Lactose）、異麥芽糖（Isomaltose）、麥芽四糖（Maltotetraose）、麥芽糖醇（Maltotriitol）、麥芽五糖（Maltopentaose）、N-乙酰-D-乳糖胺（N-Acetyl-D-lactosamine）、6-水楊酸乳糖（6-Sialyllactose）、D-（+）-阿拉伯糖醇（D-（+）-Arabitol）、L-（-）-阿拉伯糖醇（L-（-）-Arabitol）、卡那霉素水解物（Kanosamine）、C-戊糖基-木犀草素-C-己糖苷（C-pentosyl-luteolin-C-hexoside）等；汝城金花白茶的代謝物呈高表達的有N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-Acetylglucosamine）、苔黑酚葡萄糖苷（Orcinol glucoside）、當藥甙（Sweroside）、霉菌赤蘚醛糖（Nystose）；景谷金花白茶中則是D-葡糖酸（DSaccharic acid）和咖啡酸O-葡糖苷（Caffeic acid Oglucoside）呈顯著高表達。D-木糖、麥芽三糖等均是呈現甜味物質的單糖或者二糖，N-乙酰-D-氨基葡萄糖可以作為糖尿病患者甜味劑，3 種金花白茶中呈甜味的糖類物質的相對總量為J-ZH>J-RC>J-JG，因此政和金花白茶的滋味甜度較高。

2.3.4 有機酸和芳香物質

有機酸在生化反應中作為糖類分解的中間產物，由圖2d 可知，政和金花白茶中主要是2-異丙基蘋果酸（2-Isopropylmalic acid）、DL-蘋果酸（DL-Malic acid）、5-O-對香豆酰莽草酸（5-O-p-Coumaroyl shikimic acid）、α-乳香酸（α-Boswellic acid）等呈高表達，汝城金花白茶中呈更高表達的有機酸類代謝物包括3，4，5-三甲氧基肉桂酸（3,4，5-Trimethoxycinnamic acid）、O-對香豆酰-O-水楊酰奎尼酸（O-p-coumaroyl-O-salicyloyl quinic acid）、矮茶素（Bergenin）等。綠原酸（Chlorogenic acid）、D（+）-苯乳酸（D（+）-Phenyllactic acid）等在景谷金花白茶相對含量較高。蘋果酸具有天然果實的酸味特征，具有更加醇厚的味覺，酸味柔和綿長[27]，如表3，蘋果酸的相對含量呈J-ZH>J-JG>JRC，三者中政和金花白茶的口感更醇厚。

芳香差異物質一共鑒定出4 種，包括具有溫柔的辛香和丁香香氣的甲基丁香酚和乙酸丁香酚酯，有強烈的麝香氣的麝香酮（Muscone），以及呈優雅的茉莉花香和芹菜籽香氣的茉莉酮（Jasmone）。由表3 可得，前三種芳香物質在J-ZH 中的相對含量顯著高于其他兩種金花白茶，而茉莉酮在J-RC 中相對含量最高，推測其是汝城金花白茶茶湯中帶花香的重要組成成分。

3 結果與討論

本研究運用感官審評和代謝組學的方法，對不同原料（政和白茶、汝城白茶和景谷白茶）的金花白茶的差異代謝物進行了分析，共篩選出差異代謝物149 個，三者共有差異代謝物4 個，重要呈味代謝物79 個，3種金花白茶在黃酮、氨基酸和糖類化合物中都有明顯的區分。結果顯示3 種金花白茶差異顯著，政和金花白茶的菌花香最為純正且滋味更甜，汝城金花白茶湯帶花香具有明顯特色，景谷金花白茶的茶湯更順滑且湯色最深，三者均滋味醇厚。

汝城金花白茶和景谷金花白茶聚為一類，區別于政和金花白茶，推測是受到了鮮葉原料來源的影響，汝城白毛茶種群遺傳多樣性與云南大葉茶親緣關系較近[13]。景谷金花白茶中茶黃素類物質相對含量較高，這可能是由于原料本身兒茶素類物質含量豐富，在鮮葉加工成白茶過程中茶多酚類物質氧化和后期毛茶經過“發花”工藝進一步發酵，促使茶黃素和茶黃素-3，3'-雙沒食子酸的相對含量顯著高于其他兩種金花白茶。汝城金花白茶兒茶素類代謝物相對含量較多，黎娜等[13]研究發現汝城白毛茶的茶多酚、兒茶素含量與云南大葉種、江華苦茶、城步峒茶和云臺山種茶樹品種相比，含量較高，就此而言汝城金花白茶的滋味品質受原料影響較大。金花白茶是白茶市場上的新產品，不同白茶加工而成的金花白茶各具特色，三者相比政和金花白茶表現最優。后續有待研究金花白茶的香氣，不同的發花工藝和發花環境等參數的變化對金花白茶品質的影響，該研究為金花白茶滋味品質的代謝物輪廓提供了依據，所檢測到的物質可為政和金花白茶、汝城金花白茶和景谷金花白茶的品質差異和鑒別產地提供數據支持。