基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究布地奈德治療IgA 腎病的作用機(jī)制

張康，趙婷婷，張波，高夢(mèng)琦，李昱熹，王邵鵬，趙文景*

IgA 腎病（immunoglobulin A nephropathy，IgAN）是世界范圍常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球腎炎［1］，占我國(guó)原發(fā)性腎小球腎炎的52.66%［2］，25%～30%的IgAN 患者在確診后20 年內(nèi)會(huì)進(jìn)展至終末期腎病［3］，成為家庭和國(guó)民經(jīng)濟(jì)的沉重負(fù)擔(dān)。目前尚無(wú)針對(duì)IgAN 有效且安全的治療方案。2021 年改善全球腎臟病預(yù)后組織（KDIGO）指南推薦IgAN 的治療重點(diǎn)是優(yōu)化支持治療，包括血壓管理、使用最大耐受劑量的腎素-血管緊張素系統(tǒng)抑制劑（renin-angiotensin system inhibitors，RASI）、 生活方式改變等；對(duì)于經(jīng)過(guò)了至少90 d 的優(yōu)化支持治療，仍有疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的IgAN 患者可以考慮為期6 個(gè)月的皮質(zhì)類(lèi)固醇治療［4］。然而，糖皮質(zhì)激素的長(zhǎng)期療效和安全性仍存在爭(zhēng)議，STOP-IgAN 研究顯示在高危IgAN患者中加強(qiáng)免疫抑制治療并不能延緩估算腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）下降，且不良反應(yīng)明顯增加［5］；TESTING研究顯示足量激素治療IgAN 可顯著減少蛋白尿，減少63%的腎衰竭事件，但嚴(yán)重不良事件風(fēng)險(xiǎn)增加4.63 倍［6］。

近年來(lái)針對(duì)IgAN 治療的新藥研究進(jìn)展迅速，其中靶向遲釋布地奈德膠囊是全球首個(gè)IgAN 對(duì)因治療藥物。2022 年10 月，布地奈德腸溶膠囊的Ⅲ期臨床試驗(yàn)NeflgArd 公布了其研究結(jié)果，表明布地奈德腸溶膠囊在降低蛋白尿方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，且腎功能穩(wěn)定，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)發(fā)生，但其治療IgAN 的作用機(jī)制尚未完全明確［7］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索布地奈德治療IgAN 的作用靶點(diǎn)，進(jìn)行藥物-疾病靶點(diǎn)相互作用分析、基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，為布地奈德治療IgAN 的臨床實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 布地奈德基本信息的獲取 通過(guò)Chemical Book（https://www.Chemical Book.com/）獲取布地奈德的分子式和結(jié)構(gòu)式。

1.2 布地奈德作用靶點(diǎn)的篩選及靶點(diǎn)信息的規(guī)范化 布地奈德相關(guān)基因通過(guò)人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https://www.genecards.org/）輸入關(guān)鍵詞“Budesonide”獲得，數(shù)據(jù)庫(kù)更新截止時(shí)間為2023 年3 月。利用DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca）與TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://db.idrblab.net/ttd/）對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)一步補(bǔ)充，所預(yù)測(cè)的藥物靶點(diǎn)信息與Uriprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行規(guī)范化處理后確定為布地奈德主要靶點(diǎn)。

1.3 獲取IgAN 相關(guān)靶基因 通過(guò)GeneCards 和CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ctdbase.org/），輸入關(guān)鍵詞“IgA nephropathy”，獲得IgAN 相關(guān)基因。通常在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，當(dāng)靶基因數(shù)目較多時(shí)可將Score 值＞中位數(shù)的靶基因作為疾病的潛在靶基因。本研究中通過(guò)GeneCards 獲得的相關(guān)靶基因數(shù)目中等，因此未進(jìn)行篩選，全部納入研究。其中得到Score 最大值為73.96，最小值為0.26。利用CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，并使用韋恩圖將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)果取交集獲得IgAN 的最終靶點(diǎn)。

1.4 布地奈德-IgAN 交集靶點(diǎn) 將布地奈德相關(guān)靶點(diǎn)與IgAN 靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0 網(wǎng)站（https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/Index.html），通過(guò)韋恩圖取交集獲得共同靶點(diǎn)。

1.5 藥物-疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將布地奈德和布地奈德-IgAN 共同靶基因?qū)隒ytoscape 3.9.1 軟件，構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。以“節(jié)點(diǎn)”表示藥物成分與作用靶點(diǎn)，以“邊”表示節(jié)點(diǎn)間的相互作用。

1.6 蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用（protain-protain interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）中輸入交集靶基因構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，利用CytoNCA 插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度值和介數(shù)，≥度值中位數(shù)的靶點(diǎn)被定義為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.7 GO 和KEGG 通路富集分析 通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org）對(duì)共同靶基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分。篩選條件Min Overlap 為3；P Value Cutoff 為0.01；Min Enrichment為1.5，并用微生信平臺(tái)（http://www.bioinformatics.com.cn/）可視化分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 布地奈德及IgAN 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選 藥物布地奈德的基本信息見(jiàn)圖1。共獲得布地奈德靶點(diǎn)242 個(gè)，IgAN相關(guān)基因1 443 個(gè)。通過(guò)韋恩圖取并集獲得146 個(gè)布地奈德-IgAN 共同靶基因，約占總數(shù)的9.5%，見(jiàn)圖2。

圖1 布地奈德基本信息Figure 1 Basic information of budesonide

圖2 布地奈德-IgAN 共同靶點(diǎn)韋恩圖Figure 2 Venn diagram of the intersection of budesonide and IgA nephropathy targets

2.2 布地奈德-IgAN 共同靶基因網(wǎng)絡(luò)分析 以布地奈德和146 個(gè)布地奈德-IgAN 共同靶基因構(gòu)建“藥物-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，中心橙色節(jié)點(diǎn)代表布地奈德，周邊146 個(gè)綠色節(jié)點(diǎn)代表布地奈德治療IgAN 的潛在靶點(diǎn)，146 條邊代表布地奈德-IgAN 之間的相互作用，見(jiàn)圖3。

圖3 布地奈德-IgAN 靶基因網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Budesonide-IgAN target genes network

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 于STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入146 個(gè)布地奈德-IgAN 共同靶基因，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置篩選條件后獲得143 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 022 條邊，見(jiàn)圖4。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件中，利用CytoNCA 插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的度值和介數(shù)的中位數(shù)分別為34.0、810.67，以≥度值中位數(shù)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，共獲得15 個(gè)關(guān)鍵靶基因：白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）、白介素10（IL-10）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）等，見(jiàn)圖5、表1。

表1 PPI 網(wǎng)絡(luò)15 個(gè)關(guān)鍵靶基因及其拓?fù)鋮?shù)Table 1 15 core target genes of PPI network and their topological parameters

圖4 布地奈德-IgAN 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 PPI network map of the intersection of budesonide and IgAN targets

圖5 15 個(gè)關(guān)鍵靶基因Figure 5 15 core target genes

2.4 GO 富集分析 應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)將146 個(gè)交集靶基因進(jìn)行GO 功能富集，共得到1 646 個(gè)BP，62 個(gè)CC 及127 個(gè)MF，其中BP 主要涉及炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、磷酸化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of phosphorylation）、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cell motility）等；CC 主要涉及囊腔（vesicle lumen）、細(xì)胞質(zhì)囊泡腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）等；MF主要涉及信號(hào)受體激活活性（signaling receptor activator activity）、 信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性（signaling receptor regulator activity）、 受體配體活性（receptor ligand activity）等。使用微生信平臺(tái)按照P 值排序?qū)⑴琶?0 的富集分析結(jié)果繪制出氣泡圖，圖中圓點(diǎn)大小代表基因個(gè)數(shù)，顏色對(duì)應(yīng)P 值大小，見(jiàn)圖6～8。

圖6 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-BP 富集分析Figure 6 GO-BP enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

圖7 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-CC 富集分析Figure 7 GO-CC enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

圖8 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO-MF 富集分析Figure 8 GO-MF enrichment analysis of core targets of IgAN treated with budesonide

2.5 KEGG 信號(hào)通路富集分析 將146 個(gè)交集靶基因通過(guò)Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 富集分析，共獲得174條信號(hào)通路。對(duì)前20 條信號(hào)通路制作KEGG 信號(hào)通路柱狀圖（圖9），縱坐標(biāo)是信號(hào)通路的名稱(chēng)，橫坐標(biāo)是富集在每條通路上基因的數(shù)目，不同的顏色代表不同的P 值，顏色越紅，P 值越小，富集越明顯，說(shuō)明此通路與疾病的相關(guān)性越大。結(jié)果顯示富集基因較多且富集明顯的通路包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、白介素17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、癌癥中的通路（pathways in cancer）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等。

圖9 布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵信號(hào)通路Figure 9 Key signaling pathways of IgAN treated with budesonide

3 討論

黏膜免疫缺陷導(dǎo)致半乳糖缺陷IgA1 分子（galactose-deficient IgA1，Gd-IgA1）的產(chǎn)生在IgAN 發(fā)病機(jī)制中具有重要意義［8］，因此，從病因出發(fā)尋找新型治療方案是當(dāng)前IgAN 的研究重點(diǎn)。

近年來(lái)，作為黏膜免疫系統(tǒng)最廣泛、最重要的部位，腸道黏膜免疫系統(tǒng)在IgAN 發(fā)生、發(fā)展中的作用越來(lái)越受到關(guān)注［9］。腸道黏膜免疫系統(tǒng)擁有全身最廣泛的黏膜相關(guān)淋巴組織——腸道相關(guān)淋巴組織（GALT），對(duì)腸道局部和全身免疫均發(fā)揮作用。其中，派爾集合淋巴結(jié)是GALT 中抗原采集和免疫誘導(dǎo)的主要部位，也是人體IgA1 分子的主要來(lái)源［10］，有促進(jìn)B 細(xì)胞向分泌IgA 的漿細(xì)胞分化的微環(huán)境。B 細(xì)胞分化成IgA 漿細(xì)胞后，錯(cuò)位遷移至全身，導(dǎo)致循環(huán)Gd-IgA1 過(guò)多，可能是IgAN 發(fā)病的基礎(chǔ)和源頭［11］。布地奈德腸溶膠囊作為一種靶向腸道釋放的糖皮質(zhì)激素在IgAN 的治療中顯示出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其靶向釋放于回腸末端的黏膜B 細(xì)胞，達(dá)到從上游減少誘發(fā)IgAN 的Gd-IgA1 產(chǎn)生從而治療IgAN 的作用［7］。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)布地奈德治療IgAN的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。研究結(jié)果表明IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等處于布地奈德治療IgAN 關(guān)鍵靶點(diǎn)的核心位置。IL-6、TNF-α、IL-10 均屬于炎癥細(xì)胞因子，IgAN 患者血清IL-6、TNF-α、IL-10 水平顯著升高［12-13］。作為一種促炎細(xì)胞因子，IL-6 是腎上腺TOLL 樣受體（TLR）9 激活介導(dǎo)IgA1 過(guò)度生成的主要分子之一，IL-6 不僅可以誘導(dǎo)Gd-IgA1 的過(guò)量產(chǎn)生，亦可介導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖和基質(zhì)擴(kuò)張，并促進(jìn)腎臟炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，從而誘發(fā)疾病生成［14-15］；此外，臨床研究顯示IgAN 患者尿液IL-6 水平異常升高，與腎臟病理?yè)p傷呈正相關(guān)，提示IL-6 可作為一種無(wú)創(chuàng)性生物標(biāo)志物，反應(yīng)IgAN 的腎臟損傷情況［16］。TNF-α 可通過(guò)與IgAN 足細(xì)胞TNF-α 受體1（TNFR1）結(jié)合介導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，從而引發(fā)蛋白尿［17-18］。IL-10 在IgAN 腎內(nèi)的表達(dá)主要發(fā)生在腎小管區(qū)域，作為一種抗炎細(xì)胞因子，IL-10 可通過(guò)減少I(mǎi)L-1β 的合成來(lái)抑制炎癥反應(yīng)［19］，亦可下調(diào)TNF 的合成［20］。此外，一項(xiàng)在中國(guó)西北地區(qū)人群中展開(kāi)的研究表明IL-10 是IgAN 患者的易感基因［21］，IL-10 基因G-1082A 多態(tài)性與IgAN 進(jìn)展相關(guān)［22］。VEGFA 是一種重要的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，對(duì)維持腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和壁層上皮細(xì)胞的存活、分化和結(jié)構(gòu)至關(guān)重要［23］，腎小管VEGFA 產(chǎn)生的增加會(huì)導(dǎo)致纖維化和腎小球病變［24］。VEGFA 在IgAN患者腎臟頂葉上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、足細(xì)胞和系膜細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，尿液VEGFA 水平與腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化顯著相關(guān)，是IgAN 的獨(dú)立預(yù)后因素［25］。EGFR 是一種多功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，過(guò)量的EGFR 可激活PI3K/Akt 通路，增加TGF-β1 的含量，促進(jìn)腎臟纖維化，并增加炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生［26］。

對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，其中BP 主要涉及磷酸化的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的正向調(diào)節(jié)等，CC 主要涉及細(xì)胞質(zhì)囊泡腔、囊腔、分泌顆粒腔等，MF 主要涉及信號(hào)受體激活活性、信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性、受體配體活性等。KEGG 富集分析顯示，布地奈德可通過(guò)多條信號(hào)通路調(diào)控IgAN，其中細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體相互作用的通路在布地奈德治療IgAN 中起到了關(guān)鍵作用。細(xì)胞因子作為機(jī)體內(nèi)最具有活性的可溶性多肽，從生物酶活力、細(xì)胞膜通透性、細(xì)胞骨架蛋白功能、基因表達(dá)等多方面參與機(jī)體生理病理狀態(tài)，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體網(wǎng)絡(luò)是機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，也是藥物干預(yù)的靶點(diǎn)和核心環(huán)節(jié)［27］。IgAN 與黏膜感染相關(guān)，常伴有細(xì)胞因子升高，IgAN 患者細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路在細(xì)菌感染宿主的炎癥過(guò)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。其中IL-6 作為促炎因子，在機(jī)體發(fā)生感染時(shí)可發(fā)出炎癥信號(hào)，促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖分化。在IgAN 患者中，IL-6 可通過(guò)調(diào)節(jié)ST6GALNAC2和C1GALT1 的基因表達(dá)及酶活性，上調(diào)IgA1 分子的半乳糖缺失，進(jìn)而增加免疫復(fù)合物形成、促進(jìn)疾病進(jìn)展［28］。因而，布地奈德通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路抑制Gd-IgA1 合成在IgAN 的治療中具有重要意義。

綜上所述，本研究初步探討了布地奈德治療IgAN的藥理學(xué)機(jī)制。布地奈德可能通過(guò)IL-6、TNF、IL-10、VEGFA、EGFR 等靶點(diǎn)作用于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、白介素17 信號(hào)通路、癌癥中的通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等多條信號(hào)發(fā)揮IgAN 治療作用，為布地奈德治療IgAN 進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)，后續(xù)可通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：張康設(shè)計(jì)文章的思路與框架，繪制圖表，撰寫(xiě)論文初稿；張波、高夢(mèng)琦進(jìn)行文獻(xiàn)收集、整理和提煉；李昱熹、王邵鵬進(jìn)行論文的修訂；趙婷婷、趙文景負(fù)責(zé)論文終稿的審定，文章的質(zhì)量控制及審校；張康、趙文景對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。