基于藥物研發的藥學綜合實驗設計

韓金娥，周 瑩，蔣 敏，錢建瑛，高越穎，李 會

（江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇無錫 214122）

0 引 言

為主動應對新一輪科技革命和產業變革，實現國家產業轉型升級，教育部積極推動“新工科”建設、“雙一流”建設，要求高校打破傳統學科之間的壁壘，推進學科交叉與跨界融合，以培養適應國家戰略需求的高素質、應用型和復合型的創新人才［1-3］。實驗實踐教學作為高校人才培養的關鍵載體，是高水平人才培養不可或缺的重要支撐，在新時代人才培養模式改革中，實驗實踐教學無疑是重要的突破口和切入點。

制藥工藝綜合實驗是我院專業課程體系的重要組成部分，是培養學生實驗技能，鞏固理論知識及提高學生綜合素質的重要環節。然而，該課程仍存在設計性、研究型實驗比例偏低；實驗內容缺乏系統性和整體性，各學科“各自為政”，缺乏交叉滲透、相互融合等缺點，無法滿足“新工科”的理念，即強調學科的實用性、交叉性與綜合性［4］。由此，實驗教學團隊對該課程的實驗項目進行了改革，注重各學科在邏輯和結構上的聯系與組合，加強實驗內容的綜合化、一體化及多學科知識的交叉融合，將藥物化學、藥物分析、藥理學和藥物制劑四大主干課程知識進行銜接和交叉融合，形成連貫性、一體化的實驗教學體系［5-6］。制藥工藝綜合實驗分為化學制藥和生物制藥兩條線，現以化學制藥中的綜合性實驗“撲熱息痛的合成及表征、質量分析、藥效學評價、劑型制備及質量評價”為例加以探討。

撲熱息痛，又名對乙酰氨基酚，臨床上用于普通感冒或流行性感冒引起的發熱、緩解頭痛、神經痛、牙痛等，是最常用的解熱鎮痛藥之一［7］。撲熱息痛屬于乙酰苯胺類解熱鎮痛藥，藥理作用是通過抑制環氧化酶，選擇性抑制下丘腦體溫調節中樞前列腺素的合成，導致外周血管擴張、出汗而達到解熱的作用；通過抑制前列腺素等的合成和釋放，提高痛閾而起到鎮痛作用，屬于外周性鎮痛藥，僅對輕、中度疼痛有效，無明顯抗炎作用［8-9］。市面上有對乙酰氨基酚的各種劑型，如對乙酰氨基酚片、對乙酰氨基酚緩釋片、對乙酰氨基酚顆粒、對乙酰氨基酚混懸液、對乙酰氨基酚栓等。以學生熟悉的經典藥物撲熱息痛為切入點，模擬藥物研發的整個歷程，開設了融合藥學四大主干課程知識的綜合設計性實驗，對提高學生藥品研發、生產、檢驗的整體認知，提升學生綜合運用知識解決問題的能力，培養高素質復合型藥學人才具有重要意義。

1 教學設計與安排

撲熱息痛綜合性實驗以模擬藥物研發為主線，旨在交叉融合藥學多學科理論知識與實驗操作，提高學生綜合運用所學知識分析解決問題的能力。實驗內容主要有合成撲熱息痛原料藥，并對其結構表征，灌輸藥化科研思維；根據藥典對合成的原料藥進行質量分析，包括鑒別、檢查、含量測定等，植入藥物質量分析的思想；考察原料藥對小鼠的鎮痛作用，引入藥效學評價理念；將原料藥制備成合適的劑型，并對制劑進行質量評價，各模塊之間相互影響、聯系，實驗設計思路如圖1所示。

圖1 撲熱息痛綜合實驗設計思路

該實驗項目面向制藥工程專業大學四年級學生開設，安排在大四上學期的綜合實訓環節。開課前2 周教師將實驗項目發給學生，讓學生自行查閱文獻、書籍等，設計整個實驗方案，實驗前指導老師與學生開展實驗方案的可行性研討會，結合實驗室安全及現有條件，最終確定具體的實驗方案。整個實驗過程遵循以學生為主，充分發揮學生的積極主動性，教師陪同引導，實驗結束時間由各組的具體進度決定。學生在實驗過程中需要認真觀察實驗現象、寫好實驗記錄，實驗操作認真、規范，實驗結束后及時完成實驗報告，最后各組進行PPT匯報總結。學生除了實驗課上跟老師交流，課外還可以通過企業微信跟老師探討問題。此外，實驗期間學院大型分析儀器平臺對教學開放，如質譜儀、核磁共振儀、高效液相色譜儀、紅外光譜儀等，以保證實驗的順利開展。

該實驗安排在連續2 周（10 天）內完成，每組學生4 或5 人，組內學生又可分為兩小組，每小組2 或3人，運用對比教學法，每小組學生進行不同合成方法、不同片劑的制備等，匯總組內和全班的實驗數據，進行組內、組間數據比較，分析，最終得出實驗結果。第1～3天完成撲熱息痛的合成、純化及表征；第4～5 天完成原料藥質量分析；第6 天完成撲熱息痛的鎮痛作用研究；第7～9 天完成撲熱息痛普通片、緩釋片的制備，質量檢查及溶出度測定；第10 天整理實驗數據，書寫實驗報告及制作實驗總結PPT。最后，各小組進行PPT匯報答辯，師生討論交流。實驗整體安排較為緊湊，環環相扣，需要各組學生相互配合，分工協作，勇于探索。

2 實驗部分

2.1 實驗原理

撲熱息痛的合成方法較多［10-12］，本項目以對氨基酚為原料，經過乙酸酐?；蟮玫侥繕水a物［7，13］，反應方程式如圖2 所示。

圖2 撲熱息痛的合成路線

撲熱息痛原料藥的質量分析按照藥典中的相關規定［14］，根據化合物分子中的酚羥基與鐵離子形成配位鍵而顯色；乙酰胺基水解后生成氨基，在亞硝酸鈉和堿性β-萘酚的作用下發生重氮化-偶合反應生成紅色的偶氮化合物。

撲熱息痛的體外鎮痛實驗采用化學刺激法或者熱板法，化學刺激法給小鼠腹腔注射一些化學物質刺激腹膜，引起深部的、大面積且較持久的疼痛反應，致使小鼠產生扭體反應；熱板法是通過熱刺激小鼠足部產生疼痛反應，即小鼠出現舔后足，測定小鼠出現疼痛舔后足的時間，比較給藥組與對照組的差異，判定藥物有無鎮痛作用。

由于對乙酰氨基酚的生物半衰期短，患者需要頻繁服藥，容易造成胃腸道刺激等不良反應，制成其緩釋制劑具有藥效持久，減少給藥次數，降低副作用，改善安全性等優點。緩釋片的釋放度測定，所用儀器和方法同普通片的溶出度測定，釋放度的測定采用3 個以上時間點取樣。實驗測定對乙酰氨基酚普通片的溶出度，及其緩釋片的釋放度，并且比較兩者實驗結果，進行緩釋作用評價。

2.2 實驗材料

試劑對氨基酚，醋酸酐，活性炭，亞硫酸氫鈉，三氯化鐵，亞硝酸鈉試液，堿性β-萘酚試液，溴化鉀，氯化鈉，硝酸銀試液，硫酸鉀，甲醇，乙酸鈉，對氨基苯酚，氫氧化鈉，乙酸，羥丙基甲基纖維素，乳糖，乙醇，硬脂酸鎂，鹽酸等，均為分析純。

儀器微波合成儀，超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜聯用儀，核磁共振譜儀，全反射傅里葉紅外光譜儀，高效液相色譜儀，熱板儀，壓片機，溶出儀，片劑硬度測試儀，脆碎度測試儀，分析天平，電子天平，磁力攪拌加熱器，循環水真空泵，pH 計，水浴鍋，注射器，鼠籠，灌胃針，恒溫干燥箱等。

動物ICR 小鼠，雌雄各半，體質量20～25 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，飼養溫度25℃，相對濕度55%。

2.3 實驗步驟

2.3.1 撲熱息痛原料藥的合成及表征［7，13］

向安裝配有攪拌子、溫度計、回流冷凝管的250 mL三頸瓶中加入44 g對氨基苯酚和120 mL純水，開啟攪拌，加熱到50 ℃；通過恒壓滴液漏斗逐滴加入48 mL乙酸酐然后升溫到80 ℃，維持該溫度反應2 h。冷卻到室溫，待結晶析出完全后，抽濾，用冰純水洗滌濾餅兩次，抽干得對乙酰氨基酚粗品。將粗品轉移至250 mL圓底燒瓶中，加入適量純水，加熱溶解，稍冷后加入4 g活性碳，回流15 min，事先在抽濾瓶中先加入1 g亞硫酸氫鈉，趁熱抽濾，濾液趁熱轉移至500 mL燒杯中，放冷析晶，抽濾，濾餅用0.5%亞硫酸氫鈉溶液洗滌2 次，抽濾，干燥，得到撲熱息痛原料藥。測熔點，計算收率，并通過質譜、氫譜和碳譜進行化合物的表征，以及高效液相色譜法進行純度檢測。

微波合成法是向250 mL三頸瓶中加入攪拌子，44 g對氨基苯酚和120 mL純水，稍加搖晃后放置微波合成儀中，安裝好回流冷凝管，設置好反應時間17 min，微波功率500 W，反應溫度100 ℃，滴加乙酸酐，同時開啟微波反應，反應完畢冷卻析晶，后續操作同上。

2.3.2 撲熱息痛原料藥的質量分析［14］

（1）鑒別。①取原料藥的水溶液，加三氯化鐵試液，樣品溶液顯藍紫色。②取原料藥約0.1 g，加稀鹽酸5 mL，水浴中加熱40 min，冷卻至室溫；取0.5 mL該溶液，滴加亞硝酸鈉試液5 滴，搖勻，加去離子水3 mL稀釋，加堿性β-萘酚試液2 mL，振搖，應顯紅色。③取原料藥干燥品1～2 mg，與200 mg左右的溴化鉀混合，研磨成細粉，在紅外壓片模具中壓成透明薄片，置于傅里葉紅外光譜儀中進行檢測，獲得的紅外光譜與標準圖譜進行對照。

（2）檢查。①酸度。取原料藥0.1 g，加水10 mL使溶解，使用校正好的pH 計，測定pH 值應為5.5～6.5。②氯化物。取原料藥2.0 g，加水100 mL，加熱溶解后，取濾液25 mL再加稀硝酸10 mL，置50 mL納氏比色管中，加水至約40 mL，搖勻，得到供試品溶液。另取5 mL標準氯化鈉溶液，分別加入硝酸銀試液1.0 mL，用水稀釋成約50 mL，搖勻，在暗處放置5 min，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察、比較。③硫酸鹽。量取氯化物檢查時剩余的濾液25 mL，與標準硫酸鉀溶液1.0 mL制成的對照液比較。

（3）含量測定。采用紫外分光光度法，取撲熱息痛原料藥約40 mg，精密稱定，置于250 mL容量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液50 mL溶解后，加水至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于100 mL量瓶中，加0.4%氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻。272 nm處進行紫外分光光度測定。

2.3.3 撲熱息痛的鎮痛作用研究［13］

采用化學刺激法取小鼠4 只，雌雄各半，稱重并編號，實驗組小鼠（雌雄各半）編號為1，2 號，皮下注射對乙酰氨基酚0.15 mL／10 g；對照組小鼠（雌雄各半）編號為3，4 號，皮下注射生理鹽水0.15 mL／10 g。30 min后，每只小鼠分別腹腔注射0.2 mL的0.8%乙酸，觀察15 min內每只小鼠發生扭體反應的次數。觀察小鼠給藥前后的表現，并仔細記錄觀察結果，計算鎮痛反應百分率（%）。

2.3.4 撲熱息痛片劑的制備及質量評價［13，15］

（1）處方。對乙酰氨基酚緩釋片和普通片的處方組成如表1 所示。

表1 撲熱息痛片劑的處方

（2）劑型制備工藝流程。對乙酰氨基酚普通片和緩釋片的制備采用濕法制粒，流程為原輔料粉碎—過篩—原輔料混合—制軟材—制粒—干燥—整?！旌稀獕浩?/p>

（3）撲熱息痛緩釋片、普通片質量研究。①外觀檢查。取20 片，平鋪于白底板上，置于75 W 光源下60 cm處，距離片劑30 cm，以肉眼觀察30 s。檢查結果應符合：完整光潔，色澤一致；80～120 目色點應＜5%，麻面＜5%，并不得有嚴重花斑及特殊異物。②重量差異限度檢查。取20 片，精密稱重總重量，求得平均片重后，再分別精密稱定各片的重量。每片重應與平均片重相比較，超出重量差異限度的藥片不得多于2 片，并不得有1 片超出重量差異限度的1 倍。③硬度檢查。取6 片，用片劑硬度測試儀測定硬度。④脆碎度檢查。取10 片，精密稱重，置于脆碎度測試儀，規定時間取出，除去粉末，精密稱重，減失重量不得超過0.8%，且不得檢出斷裂、龜裂及粉碎的片。⑤釋放度檢查。取自制緩釋片6 片，采用漿法，以900 mL 磷酸鹽緩沖液（pH5.8）為釋放介質，轉速為50 r／min，在5、10、20、30、60、90、120、180、210 min，分別取5 mL溶液，濾過，精密量取續濾液1 mL，加上述釋放介質稀釋50 mL，搖勻，照紫外-可見分光光度法，于波長257 nm處測量吸光度。⑥溶出度的測定。取自制普通片6片，采用轉籃法，以稀鹽酸24 mL 加水至1 000 mL 為溶出介質，轉速為100 r／min，分別于5、10、15、30、45、60 min取溶液5 mL，濾過，精密量取續濾液1 mL，加0.04%氫氧化鈉溶液至50 mL，搖勻，按照紫外-可見分光光度法，于波長257 nm處測量吸光度。

3 實驗結果與分析

3.1 撲熱息痛原料藥的合成與表征

對比兩種合成方法，微波合成法的反應時間大大縮短，操作簡便，收率略高。合成得到的撲熱息痛原料為白色結晶，計算收率為61%～75%，通過數字熔點儀測定熔點為169～170 ℃，與文獻值相符［16］。此外，學生需要預處理好樣品，在分析檢測平臺老師的指導下使用質譜儀、核磁共振儀、高效液相色譜儀等，完成對化合物的結構表征和純度分析，并通過譜圖解析，驗證產物結構及純度。

經質譜儀測定化合物相對分子質量為151，與對乙酰氨基酚相對分子質量相符，質譜圖如圖3 所示。

圖3 撲熱息痛的質譜圖

經核磁共振分析儀測試得到化合物的氫譜和碳譜，1H-NMR（400 MHz，CD3OD）：δ 7.3（d，2H）和δ 6.75（d，2H），這為苯環上的4 個氫；δ 4.8（s，2H）為氨基成銨鹽上的2 個氫；δ 2.1（s，3H）為甲基上的3 個氫；13C-NMR（400 MHz，CD3OD）：δ 170.0 為羰基碳，δ 154.0 為苯環上連接羥基的碳，δ 130.3 為苯環上連接氨基的碳，δ 122.0 和δ 114.8 為苯環上無取代基的4個碳，δ 22.1 為甲基碳，與對乙酰氨基酚結構相符，其氫譜、碳譜如圖4 所示。

圖4 撲熱息痛的核磁譜

采用高效液相色譜法進行純度測定，色譜柱為Waters XBridge C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相為甲醇－0.05 mol／L醋酸銨溶液（15∶85）；流速為1.0 mL／min；檢測波長為257 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為10 μL，面積歸一化法得到對乙酰氨基酚的純度達99.7%，如圖5 所示。

圖5 撲熱息痛原料藥的高效液相色譜圖

3.2 撲熱息痛原料藥的質量評價

3.2.1 鑒 別

撲熱息痛原料藥與三氯化鐵顯藍紫色；經酸解與亞硝酸鈉作用顯紅色；紅外光譜圖與文獻圖譜［17］基本一致，如圖6 所示。

圖6 撲熱息痛的紅外光譜圖

3.2.2 檢 查

撲熱息痛原料藥經酸度檢查合格，大部分學生的氯化物檢查、硫酸鹽檢查合格，少數學生的不合格，可能在制備原料藥的過程中使用了自來水，或者產品洗滌不充分而引起氯化物、硫酸鹽的殘留。

3.2.3 純度測定

撲熱息痛原料藥的含量在90%～105%，符合藥典規定，部分學生的數據如表2 所示。

表2 對乙酰氨基酚的含量

3.3 撲熱息痛原料藥的藥理學評價

統計全班小鼠的扭體次數，計算對乙酰氨基酚的鎮痛百分率，結果如表3 所示。由表可知，對乙酰氨基酚對小鼠有明顯的鎮痛作用。

表3 對乙酰氨基酚對小鼠的鎮痛作用

3.4 撲熱息痛普通片、緩釋片的制備及質量評價

制備得到的撲熱息痛普通片、緩釋片完整光潔，色澤一致，無花片裂片，外觀檢查合格；重量差異檢查合格，部分學生制備的緩釋片數據如表4 所示；普通片、緩釋片的硬度、脆碎度檢查均合格。

表4 撲熱息痛緩釋片的重量差異限度檢查

計算普通片、緩釋片在各取樣點的藥物溶出度及累積溶出度，繪制的累積溶出度-時間曲線圖如圖7 所示。由圖可知，撲熱息痛緩釋片較普通片藥物釋放明顯緩慢，在3 h 時累積釋放度為50%，達到了緩釋效果。

圖7 撲熱息痛累積溶出度-時間曲線圖

4 結 語

設計實驗從撲熱息痛原料藥合成，經藥品質量分析，再進行藥理學活性評價，到最后片劑的制備及質量評價，實驗內容豐富多樣，涉及的專業知識廣泛，涵蓋了多學科的理論知識及實驗技能，不僅讓學生對大學4 年所學知識進行了整體梳理和鞏固，還加深對新藥研發歷程的理解。此外，該課程對提升學生綜合實驗技能、專業知識的融會貫通、科研素養以及分析解決問題的綜合能力都大有裨益，也為學院培養應用型、復合型高素質藥學人才提供了重要支撐。經過3 年的教學實踐，取得了很好的教學效果，獲得師生的一致好評，已成為我院具有特色的專業實踐實訓課程。今后，該課程還會繼續更新完善，與時俱進，例如引入綠色合成新技術（微流控技術、電化學合成法等），增加不同劑型的制備（混懸劑、顆粒劑、栓劑等），同時融入更多的思政元素，培養學生“藥者仁心、精業濟世”的家國情懷和使命擔當。