微球新制劑在藥學綜合實驗教學中的設計與應用

邱立朋，胡 笳，方文杰，陳敬華

（江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇無錫 214122）

0 引 言

在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)高速發(fā)展和利好政策的背景下，我國正在向藥物研發(fā)強國轉型，因此，創(chuàng)新型藥學應用人才的培養(yǎng)是促進我國提高醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)競爭力的關鍵［1-2］。實驗教學是藥學專業(yè)人才培養(yǎng)中的重要實踐環(huán)節(jié)，是培養(yǎng)學生綜合知識應用、科學性思路、創(chuàng)新精神和實踐動手能力的重要手段［3］。綜合型藥學實驗是在掌握專業(yè)理論知識和基本實驗操作后進行的多個知識點整合的專業(yè)實驗教學，其內容涉及多門課程知識或者藥物研發(fā)和科學研究中的綜合知識，突出對專業(yè)知識的靈活運用和行業(yè)發(fā)展的整體把握。目前，越來越多高校重視對藥學綜合型實驗教學的不斷改革與探索，不斷提高學生對專業(yè)的學習興趣，增強學生動手實踐能力和創(chuàng)新研究思維，為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)培養(yǎng)高素質創(chuàng)新性藥學專業(yè)人才而努力［4-5］。

微球是目前備受關注的藥物新劑型，它是將藥物通過物理或者化學方法溶解、分散或吸附在高分子載體材料中形成的微米級球狀實體［6］。微球能夠保護藥物不被非特異性細胞和組織改變其生物分布或排出體內，實現(xiàn)緩控釋放，降低全身血藥濃度，提高治療效果［7-9］。自2000 年注射用醋酸亮丙瑞林微球上市以來，微球制劑作為改良劑型的高端制劑代表，因獨特的技術與市場優(yōu)勢，受到醫(yī)藥企業(yè)的廣泛關注。阿霉素為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物，是一種臨床常用的化療藥物，主要用于急性白血病、支氣管肺癌、肝癌等的治療。然而，它有著較大的心臟毒性等副作用，臨床需嚴格限制其使用劑量，以減少其引起的不良反應［10］。因此，近年來藥學研究人員一直對阿霉素改良劑型進行研究［11-13］。白蛋白因其良好生物相容性和載藥能力被廣泛研究［14-15］，例如上市藥物紫杉醇白蛋白納米粒。目前被進行研究的白蛋白主要分為卵清蛋白、人血清白蛋白和牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）。BSA廉價易得，可以通過物理或化學手段制備成安全性好和可生物降解的微球制劑，從而增加難溶性藥物的溶解度、降低藥物的毒副作用，實現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向遞送和緩控釋放［16-18］。

實驗設計方法是科研過程中篩選和優(yōu)化處方工藝的常用手段，它可以科學合理地安排實驗，提高實驗效率，盡快得到最優(yōu)結果。因此，將科學前沿成果與本科實驗教學相結合，把Plackett-Burman 和正交設計法用于藥學綜合創(chuàng)新實驗“阿霉素白蛋白微球的制備與表征”。通過引入不同因素的篩選優(yōu)化和分析，培養(yǎng)學生科學研究思路和綜合運用知識的能力，利于他們把握行業(yè)研究現(xiàn)狀，開拓學習視野，激發(fā)科學研究的興趣。該實驗操作較為簡單，具有較強的新穎性和綜合性，使學生體驗新藥研發(fā)的思路，感受藥物新劑型的魅力，樹立為建設新藥強國的責任和信心。

1 實驗方法

1.1 材料與儀器

牛血清白蛋白（上海碧云天生物有限公司），鹽酸阿霉素（上海生工生物工程公司），司盤-80（上海阿達瑪斯試劑有限公司），吐溫-80（南京化學試劑股份有限公司），戊二醛、液體石蠟、無水乙醇、氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司），其他所用試劑均為分析純。

紫外可見分光光度計（UV-2550，日本島津公司），旋轉蒸發(fā)儀（RE-2000A，鄭州科泰實驗設備有限公司），電子分析天平（PR，奧豪斯儀器有限公司），集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司），光學倒置顯微鏡（DMIL LED，徠卡儀器有限公司），超聲細胞破碎儀（JY92-IIN，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 阿霉素標準曲線測定

取空白牛血清白蛋白溶液、鹽酸阿霉素溶液在200～800 nm 波長范圍內進行掃描，確定最大吸收波長。精密稱取鹽酸阿霉素25 mg，置于250 mL容量瓶中，配置0.1 g／L的標準液。然后，精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分別移入10 mL容量瓶中，配制成標準系列濃度，于最大吸收波長處測定吸光度，以吸光度（x）對濃度（y）進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.3 空白微球的制備

采用乳化-化學固化法制備白蛋白微球。精密稱取牛血清白蛋白溶于蒸餾水中，渦旋溶解，作為水相。液體石蠟為油相，司盤-80，吐溫-80 作為乳化劑。在適當轉速攪拌下，將水相逐滴加入油相中，繼續(xù)乳化得到W／O型初乳后，再加入適量戊二醛溶液攪拌固化。無水乙醇清洗，20 ℃真空干燥即得空白微球。

在預實驗基礎上，選擇Plackett-Burman 設計法進行處方優(yōu)化。選擇油水體積比、乳化劑的比例、交聯(lián)劑與白蛋白的比例、水相白蛋白濃度、乳化時間和固化時間6 個因素作為考察的對象，各因素及其水平如表1所示。

表1 Plackett-Burman設計因素與水平

1.4 阿霉素白蛋白微球的制備

精密稱取定量牛血清白蛋白和阿霉素避光溶解于蒸餾水中，渦旋溶解，作為水相，其余操作同空白微球制備方法。通過單因素初步確定影響因素后，采用四因素三水平L9（34）的設計正交實驗設計法，以微球的包封率和載藥率為指標，優(yōu)化處方和工藝。正交設計因素及水平見表2。

表2 正交設計因素與水平

1.5 微球性質表征

選擇光學顯微鏡輔助image J 進行微球的形態(tài)和粒徑的評價。粒徑分布計算式為SPAN ＝（D90－D50）／D10，數(shù)值越小表示粒徑分布寬度越窄。紫外分光光度法測定微球中藥物的包封率和載藥量：稱取阿霉素白蛋白微球和空白微球10 mg，加入20 mL 無水乙醇超聲破碎，在480 nm波長處分別測定吸光度，計算包封率和載藥量。動態(tài)透析法考察載阿霉素白蛋白微球的體外藥物釋放：選擇0.9%的氯化鈉溶液作為釋放介質，稱取5 mg阿霉素原料藥和阿霉素白蛋白微球分散后，裝于透析袋中（截面相對分子質量Mw＝3 500），置于裝有20 mL 釋放介質的EP 管中，分別于不同時間點吸取2 mL透析液，并補充等量新鮮介質。紫外分光光度法測定阿霉素含量并計算累計釋放度。

2 結果與討論

2.1 標準曲線建立

通過紫外分光光度計掃描確定鹽酸阿霉素在480.0 nm處有最大吸收，而空白BSA微球溶液在此波長無干擾，故選定480.0 nm 為檢測波長。以吸光度（x）對濃度（y）進行線性作圖，得到回歸方程為

表明藥物在0.01～0.06 g／L濃度線性范圍內檢測線性關系良好。

2.2 空白微球制備及優(yōu)化

采用Plackett-Burman 設計法對空白微球的制備進行篩選和優(yōu)化。以油水體積比（A）、乳化劑的比例（B）、交聯(lián)劑與白蛋白的比例（C）、水相白蛋白濃度（D）、乳化時間（E）、固化時間（F）為考察因素，微球粒徑和粒徑分布為響應進行篩選，根據(jù)Plackett-Burman試驗設計需求，G、H、J、K、L為未知的虛擬變量。實驗安排和結果如表3 所示。

表3 Plackett-Burman設計的粒徑和粒徑分布結果

采用Design-Expert?軟件（Version-12.0.3.0）進行試驗結果分析，以多項式回歸模型描述結果和因素之間的關系：因素前系數(shù)絕對值大小可以反映該變量對于響應的重要程度。結合表4 的F檢驗可見，各因素對粒徑影響的顯著性順序依次為：C≈D＞A＞B，其中乳化劑比例顯著相關（P＜0.05），交聯(lián)劑與白蛋白比例、白蛋白濃度和油水體積比這3 個因素極顯著相關（P＜0.01）。各因素對粒徑分布影響的顯著性順序依次為：C＞D＞F＞B＞E，其中固化時間、乳化劑比例、乳化時間這3 個因素顯著相關（P＜0.05），交聯(lián)劑與白蛋白比例和白蛋白濃度極顯著相關（P＜0.01）。

表4 Plackett-Burman設計的因素顯著性方差分析結果

帕累托圖表現(xiàn)效應對響應的估計影響，每條柱的值代表效應的估計絕對值除以t檢驗的t值，其中跨過參考線的條值在統(tǒng)計學上顯著。如圖1 所示，因素C和因素D在全部的6 個因素中對粒徑的影響極顯著，且因素C對粒徑分布的影響也極顯著。各因素顯著性順序與F檢驗結果一致，分析結果可靠。

圖1 Plackett-Burman設計標準化效應帕累托圖

為驗證回歸模型可有效預測實際試驗結果，表5和圖2 提供各次試驗的預測值與實際值的比較。除粒徑分布試驗3 外，試驗和預測結果的偏差均無統(tǒng)計學意義。這可以認為Plackett-Burman 設計回歸模型是基本符合事實的。

圖2 Plackett-Burman設計的響應殘差圖

表5 Plackett-Burman設計的粒徑和粒徑分布實際值和預測值對比

2.3 阿霉素白蛋白微球處方及優(yōu)化

采用正交實驗設計法對載藥微球的處方進行篩選和優(yōu)化。以藥物與蛋白質量比（σ）、蛋白濃度（β）、固化劑與蛋白比例（γ）和固化時間（δ）為考察因素，包封率和載藥量為篩選指標進行試驗。結果如表6 所示。

表6 正交試驗結果

對實驗數(shù)據(jù)進行極差分析，極差R的大小反應了各個影響因素對載藥率的影響程度。從結果中可以看出，各因素對微球載藥率的影響大小順序為：α ＞γ ＞δ ＞β，即藥物與白蛋白質量比對微球的載藥率影響最大，其次是固化劑與白蛋白之間的比例。由表6 可見，阿霉素白蛋白微球的最佳處方工藝為α1β3γ2δ1，即藥物與BSA質量比為1∶15，BSA 濃度為8%，固化劑與BSA比例為1∶25，固化時間為1 h。按照該工藝制備阿霉素白蛋白微球，通過紫外分光光度計測定載藥量和包封率分別為16.74 ±0.42%和97.67 ±0.63%。

2.4 微球制劑學表征

通過顯微鏡觀察白蛋白微球和阿霉素白蛋白微球的形態(tài)和粒徑。由圖3 可見，優(yōu)化后最終制備的空白微球多為圓球形，表面光滑，粒徑較均勻，由Image J計算平均粒徑為（8.81 ±4.69）μm。阿霉素白蛋白微球為紅色粉末，規(guī)則較為圓整，粒徑均勻，約在10～25 μm。

圖3 兩種微球的顯微圖像

阿霉素白蛋白微球的體外釋放如圖4 所示。微球制劑中藥物開始釋放速度較快，8 h 累積釋放量約30%，后來持續(xù)緩慢釋放，72 h 的釋放度達到（45.08±0.03）%。前期的突釋可能是吸附在微球表面的藥物引起的，而隨后釋放介質溶液滲入到微球內部，使得藥物緩慢溶出。此外，通過阿霉素原料藥的釋放曲線發(fā)現(xiàn)，游離藥物短時間內釋放超過80%，這表明阿霉素白蛋白微球能夠明顯延遲藥物的釋放速度，具有較好的緩釋效果。

圖4 游離藥物和載藥微球體外釋放曲線

3 結 語

本實驗教學將行業(yè)前沿研究、實驗教學和專業(yè)人才培養(yǎng)結合起來，設計阿霉素白蛋白微球制備的綜合性開放實驗，涵蓋制劑制備、藥物分析、基本性質表征和實驗設計方法的應用，使學生掌握新藥研發(fā)趨勢，綜合運用專業(yè)知識，掌握基本科研思路。該實驗通過Plackett-Burman和正交設計實驗方法對空白微球和載藥微球的處方和工藝進行篩選，然后對微球基本的粒徑形態(tài)、載藥量和體外釋放進行考察。結果表明，優(yōu)化后微球具有較為均一的粒徑、良好的包封率和藥物緩釋作用。通過該實驗，學生掌握制劑研發(fā)的基本流程，合理運用實驗設計法，熟悉知識的交叉運用，拓寬專業(yè)學習視野，提高實踐操作和綜合創(chuàng)新能力。