延齡草總皂苷對卒中后認知障礙大鼠學習記憶能力和神經元突觸損傷的影響

王剛 ，楊丹 ，段壬澤 ，楊麗君 ，陳娟 趙方毓 ，陳顯兵

1.湖北民族大學附屬民大醫院，湖北 恩施 445000； 2.湖北民族大學醫學部，湖北 恩施 445000

卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是指在卒中后6個月內發生的從輕度認知損害到癡呆的一系列綜合征，是臨床常見的腦血管病變及神經退行性疾病[1]。2020年發布的《中國卒中報告》顯示，我國卒中患病率為1.11%，年發病率為0.25%，病死率為0.15%，其中約1/3的卒中患者會經歷PSCI[2]。

PSCI發病機制復雜，目前普遍認為，腦血管病變引起腦部缺血或出血，進而導致腦神經解剖結構損害是其主要發病機制[3]。在卒中期間，被剝奪正常代謝底物耗氧和耗能的神經元在幾秒內停止正常運作，并在2 min內顯示出結構性損傷的跡象[4]。隨著能量依賴過程的加重，神經元無法維持其正常生理功能，導致細胞凋亡，最終損害感覺和運動功能。近年來，隨著神經外科手術的發展，越來越多的患者在急性腦卒中后幸存下來，但大多數患者術后仍患有持續的感覺運動和認知功能障礙[5]。

延齡草為百合科延齡草屬植物延齡草Trillium tschonoskiiMaxim的干燥根莖，味甘，性平，有小毒。研究發現，延齡草總皂苷具有抗氧化、延緩衰老、促進學習記憶等作用[6-7]，但其對腦卒中后引發的神經疾病的作用研究較少。本研究采用改良線栓法制備PSCI大鼠模型，初步探討延齡草總皂苷對PSCI大鼠學習記憶能力及海馬神經元突觸損傷的影響及作用機制，為PSCI臨床治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級6～7周齡雄性SD大鼠60只，體質量（200±20）g，三峽大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK （ 鄂） 2017-0012， 動物合格證號42010200005116。飼養于湖北民族大學醫學部清潔動物房，溫度23～25 ℃，相對濕度50%～60%，適應性飼養1周。本研究經湖北民族大學醫學倫理委員會審批（202159）。

1.2 藥物

延齡草采自恩施，由湖北民族大學中藥實驗室鑒定為百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖。藥材潔凈后，經干燥、粉碎、提取、藥液過濾、濃縮干燥，最終得含量為61.48%的延齡草總皂苷，稱取1 g延齡草總皂苷，加入100 mL雙蒸水溶解備用。鹽酸多奈哌齊片，批號0000001782，浙江華海藥業，5 mg/片，將5 mg藥片研粉，加入111 mL雙蒸水溶解備用。

1.3 主要試劑與儀器

TUNEL細胞凋亡試劑盒（批號E-CK-A321，武漢伊萊瑞特生物），高爾基染色液（批號GMS80020.3，美國GENMED），尼氏染色液、SDS-PAGE快速配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Akt抗體（批號分別為C0117、P0012AC、P0010、AA326，上海碧云天生物），PSD95 抗體、SYN 抗體、Caspase-3 抗體、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG（批號分別為ab18258、ab52636、ab32351、ab6721、ab6789，英國Abcam），Bcl-2抗體、Bax抗體（批號分別為A19693、A19684，武漢ABclonal），PI3K抗體、p-Akt 抗體（批號分別為4255S、4060S，美國Cell Signaling Technology），β-actin抗體（批號66009-1-Ig，武漢三鷹生物）。

JSZ5B型體視顯微鏡（江南公司），Top Scan2.00水迷宮系統（美國Clever Sys），VT1200S震蕩切片機（德國Leica Biosystems公司），1510型全波長酶標儀（美國Thermo公司），Tanon-5200全自動化學發光成像系統（上海天能科技公司），5810R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Western blot電泳及轉膜裝置（美國Bio-Rad公司）。

1.4 分組、造模及給藥

60只大鼠隨機分為造模組50只和假手術組10只，造模組參照文獻[8]采用改良線栓法制備PSCI大鼠模型，假手術組僅切開皮膚，分離左側頸總動脈后立即縫合切口，不插入線栓。術后按照Longa 5分法[8]對大鼠進行神經功能評分，評分1～3分為造模成功，共得到30只造模成功大鼠。將成模大鼠隨機分為模型組、延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組，每組10只，延齡草總皂苷組予10 mg/mL延齡草總皂苷溶液100 mg/kg灌胃，鹽酸多奈哌齊組予0.045 mg/mL鹽酸多奈哌齊溶液0.45 mg/kg灌胃，灌胃體積10 mL/kg，假手術組和模型組予等體積雙蒸水灌胃，連續28 d。

1.5 Morris水迷宮實驗

給藥結束當天開始定位航行實驗，系統自動將圓形水面分為4個象限，求生平臺放在第3象限低于水面0.6～1 cm處，將大鼠面向池壁分別于第1、2、4象限放入，系統自動記錄大鼠60 s內尋找平臺所需時間，即逃避潛伏期。每日1次，連續5 d，第6日休息。第7日上午進行正式定位航行實驗，將大鼠沿第1象限放入，記錄大鼠逃避潛伏期。下午進行空間探索實驗，撤去平臺，將大鼠沿第1象限放入，記錄大鼠60 s內穿越平臺次數及目標象限停留時間比（第3象限停留時間÷總時間×100%）。

1.6 HE、尼氏染色

行為學實驗結束后，每組隨機選取2只大鼠，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，經心臟灌注多聚甲醛固定后，斷頭取全腦，沿大腦視交叉處做4～5 mm冠狀切片，將切片置于4%多聚甲醛中固定48 h。常規脫水、石蠟包埋后，行4 μm 石蠟切片，經HE、尼氏染色后，中性樹膠封片，掃描切片，觀察腦組織病理變化。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片常規脫蠟后置于PBS中備用，滴加適量蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃反應20 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加適量1×DNaseⅠ Buffer工作液，室溫平衡5 min，滴加適量DNaseⅠ工作液，37 ℃孵育10～30 min。PBS洗滌切片3次，每次5 min，滴加適量TdT Equilibration Buffer覆蓋組織，37 ℃孵育10～30 min。滴加適量陽性標記工作液，濕盒37 ℃避光反應60 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加適量DAPI，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌切片4次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察海馬CA1區神經元凋亡情況。

1.8 高爾基染色

行為學實驗結束后，每組隨機選取3只大鼠進行高爾基染色。大鼠經心臟灌注生理鹽水后，沿海馬區冠狀位做5 mm切塊進行媒染，2周后將組織放入震蕩切片機中，行40 μm切片，嚴格按試劑盒說明書將切好的組織依次放入染液中染色，明膠封片。采用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行分析，計算樹突棘密度。

1.9 Western blot檢測

將各組剩余5只大鼠麻醉，斷頭取腦，冰上分離左側海馬，按1 mg組織加入9 μL裂解液、0.09 μL蛋白酶抑制劑進行組織勻漿、超聲，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。制備12%分離膠，每孔上樣4 μL，依次進行電泳、轉膜、血清封閉15 min、TBST洗膜，將膜置稀釋后的一抗中（PI3K 1∶1 000、p-Akt 1∶2 000、Akt 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、Bax 1∶1 000、Caspase-3 1∶5 000、SYN 1∶5 000、PSD-95 1∶1 000），4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜，置于稀釋后的二抗中，室溫孵育1 h，TBST洗膜，滴加ECL顯色液進行曝光，采用GIS 1D圖像分析軟件計算蛋白灰度值。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 延齡草總皂苷對模型大鼠學習記憶能力的影響

與假手術組比較，模型組大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期顯著增加，穿越平臺次數及目標象限停留時間比顯著減少（P＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期顯著減少，穿越平臺次數及目標象限停留時間比顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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2.2 延齡草總皂苷對模型大鼠腦組織病理變化的影響

假手術組大鼠海馬CA1 區及皮質區神經元飽滿豐富、排列整齊、數量較多，細胞核著色清晰，未見明顯細胞壞死及空泡化現象；模型組大鼠海馬CA1區及皮質區神經元排列紊亂、數量較少，出現核固縮，尼氏體數量減少；延齡草總皂苷組及鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬CA1 區及皮質區神經元較飽滿、數量增多，空泡化及壞死細胞明顯減少，尼氏體數量增加。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腦組織形態（HE染色，標尺=50 μm）

圖2 各組大鼠腦組織形態（尼氏染色，標尺=50 μm）

2.3 延齡草總皂苷對模型大鼠海馬CA1區神經元凋亡的影響

TUNEL 染色藍色為細胞核，綠色為凋亡細胞。與假手術組比較，模型組大鼠海馬CA1區凋亡神經元數量增加；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬CA1 區凋亡神經元數量減少。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區神經元凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

2.4 延齡草總皂苷對模型大鼠海馬組織樹突棘密度的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織樹突棘密度顯著減小（P＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織樹突棘密度顯著增加（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠海馬組織樹突棘密度比較（高爾基染色，×1 000，±s，每組3只）

2.5 延齡草總皂苷對模型大鼠海馬組織蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2、SYN、PSD-95、PI3K、p-Akt蛋白表達顯著降低（P＜0.01），Bax、Caspase-3蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，延齡草總皂苷組和鹽酸多奈哌齊組大鼠海馬組織Bcl-2、SYN、PSD-95、p-Akt蛋白表達顯著升高（P＜0.01），Bax、Caspase-3蛋白表達顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），延齡草總皂苷組PI3K蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。見圖5、表2。

圖5 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白免疫印跡

表2 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、SYN、PSD-95、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

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3 討論

認知是腦的高級功能，海馬及大腦皮層是大腦記憶網絡的重要組成部分。大腦缺血后可引起海馬體及皮質區神經元損傷，從而導致認知功能減退或永久性記憶損害，是腦卒中最嚴重的功能障礙之一[9-10]。本研究采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學習記憶能力，結果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加，目標象限停留時間比顯著減少，表明造模后大鼠出現認知功能障礙。經延齡草總皂苷干預后，大鼠逃避潛伏期顯著減少，目標象限停留時間比顯著增加，表明延齡草總皂苷對急性腦缺血引起的認知功能障礙具有明顯改善作用。

神經元損傷的常見原因之一是缺氧誘導的細胞凋亡[11-12]。急性缺血性腦卒中后，大腦中動脈供血區域的循環氧氣輸送減少，造成局部神經元快速凋亡。本研究采用HE染色及尼氏染色對大鼠缺血側腦組織進行觀察，模型組大鼠大腦皮質區由缺血、缺氧造成的神經元壞死最為明顯，核固縮及空泡化現象突出，海馬CA1區出現神經元排列疏松、尼氏體數量減少、核固縮現象。經延齡草總皂苷干預后，大腦皮質區神經元空泡化及核固縮現象減輕，海馬CA1區空泡化不明顯，說明延齡草總皂苷對缺血、缺氧造成的神經元丟失及損傷具有抑制作用。

細胞凋亡在腦缺血發作數小時后開始，受Bcl-2家族、Caspase家族等多基因調控，Bcl-2是抗凋亡蛋白，可被Bax干擾，導致細胞凋亡。Caspase-3是大腦發育的重要蛋白，在介導神經元凋亡中起著重要作用。腦缺血后，Bcl-2表達減少，Bax表達增加，Bcl-2和Bax結合形成凋亡二聚體，從而激活Caspase，觸發依賴性凋亡級聯反應，誘導細胞凋亡。本研究發現，模型組大鼠海馬CA1區凋亡細胞明顯增加，延齡草總皂苷干預后，海馬CA1區凋亡細胞明顯減少；Western blot結果顯示，延齡草總皂苷能上調海馬組織Bcl-2蛋白表達，下調Bax及Caspase-3蛋白表達，提示延齡草總皂苷能抑制神經元凋亡，對神經元起保護作用。

神經元和突觸是海馬依賴性學習記憶的生物學基礎。研究顯示，缺血性腦卒中損害神經網絡和細胞間信號傳遞的完整性，并導致認知障礙[13]。PSD-95 和SYN是突觸可塑性的重要指標，參與興奮性突觸的成熟和突觸接觸的穩定[14]。樹突棘的可塑性是認知功能的結構基礎，與神經元回路的重新連接有關，樹突棘可塑性增強有助于皮質功能恢復[15]。PI3K/Akt信號通路是細胞代謝、生長、凋亡等生理活動的經典通路，可通過調控氧化應激、細胞凋亡等過程參與缺血性腦卒中發生發展[16-17]。缺血性腦卒中發生后，人體釋放神經細胞生長因子、整合素等激活酪氨酸激酶受體，磷酸化PI3K和Akt，觸發PI3K/Akt通路激活。本研究發現，模型大鼠予延齡草總皂苷后，海馬組織PSD-95、SYN、PI3K、p-Akt蛋白表達和樹突棘密度均顯著增加，表明延齡草總皂苷可以激活PI3K/Akt信號通路，從而對PSCI 大鼠海馬神經元突觸損傷發揮保護作用。

綜上所述，延齡草總皂苷可以改善PSCI大鼠學習記憶能力，減輕神經元突觸損傷，其機制可能與激活PI3K/Akt信號通路，上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax、Caspase-3蛋白表達，抑制細胞凋亡有關。本研究從神經元凋亡和突觸損傷角度初步探討延齡草總皂苷對PSCI大鼠的保護作用及機制，鑒于PI3K/Akt信號通路調控靶點的復雜性及中藥治療多靶點、多途徑等特點，今后將從其他途徑進行深入研究。