黃精多糖對糖尿病腎病大鼠鐵死亡的影響

劉赫 ，李函舟 ，張輝 ，呂樹泉 ，蘇秀海 ，潘紅梅，

1.河北中醫學院研究生院，河北 石家莊 050091； 2.承德醫學院，河北 承德 067000；3.河北中醫學院附屬滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病嚴重的微血管并發癥[1]，早期通常表現為微量白蛋白尿，隨后逐步發展為大量蛋白尿、腎小球濾過率進行性下降、血肌酐（SCr）進行性升高[2]。若不及時治療，可導致慢性進行性腎損傷，最終發展為終末期腎衰竭[3]。鐵死亡是鐵依賴的不飽和脂肪酸磷脂氧化累積導致的細胞死亡，主要表現為細胞內鐵離子依賴的脂質過氧化物超限蓄積[4]。研究發現，腎小管上皮細胞損傷與鐵死亡密切相關[5]。Wang等[6]發現，腎小管間質谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）表達與DN病情嚴重程度及進展關系密切。GPX4作為觸發鐵死亡程序的重要靶點，是氧化應激和細胞死亡信號的傳感器，GPX4表達降低會導致細胞內活性氧水平明顯升高[7]。因此，通過調控鐵死亡抑制腎小管上皮細胞死亡，緩解DN腎損傷可能是治療DN的有效策略。

黃精多糖是黃精中含量最高且具有重要藥理作用的一類成分，在改善DN腎功能及緩解炎癥反應等方面發揮重要作用[8]。Li等[9]研究發現，黃精多糖干預可明顯改善糖尿病小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素耐受。另有研究發現，黃精多糖干預后，DN模型小鼠血糖、24 h尿微量白蛋白、SCr和血尿素氮（BUN）水平明顯降低[10]。黃精多糖治療DN的具體作用機制尚不明確。本研究通過高糖高脂飼料喂養結合鏈脲佐菌素（STZ）注射建立DN大鼠模型，觀察黃精多糖對模型大鼠鐵死亡的影響，探討黃精多糖對DN的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠50只，體質量（200±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號SCXK（京）2021-0031。飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所，溫度（25±2）℃，相對濕度（50±15）%，12 h光暗周期，自由飲水進食。高糖高脂飼料（10%豬油、20%蔗糖、2.5%膽固醇、67.5%常規飼料）、普通飼料（4.8%脂肪、20%蛋白質及59.4%總糖），北京華阜康生物科技有限公司。本實驗經滄州中西醫結合醫院倫理委員會審批（CZX2022-KY-023）。

1.2 藥物及制備

黃精多糖（純度70%，批號S27804），上海源葉生物科技有限公司。用生理鹽水配制成濃度分別為200、800 mg/mL溶液。厄貝沙坦片（批號8A411），賽諾菲（杭州）制藥有限公司，用生理鹽水配制成30 mg/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

尿蛋白（批號C035-2-1）、SCr（批號C011-2-1）、BUN（批號C013-2-1）、丙二醛（MDA，批號C003-1-2）、谷胱甘肽（GSH，批號C006-2-1）、總鐵離子含量（批號A039-2-1）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；轉鐵蛋白（Transferrin）、鐵蛋白重鏈（FTH1）、GPX4、 β -actin 一抗（批號分別為ab278498、ab75973、ab252833、ab179467），英國Abcam公司。iMark680多功能酶標儀，美國Bio-Rad公司；Fresco17離心機，美國Thermo公司；5810型臺式冷凍離心機，德國Eppndorf 公司；ABI Prism?7500 熒光定量PCR儀，美國應用生物系統公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽，北京六一儀器廠；SH-523型化學發光成像系統，杭州申花科技有限公司。

1.4 造模、分組及給藥

大鼠適應性喂養1周后，隨機選取10只作為正常組，常規飼料喂養。剩余40只參照文獻[11]方法建立DN大鼠模型：高糖高脂飼料喂養7周后，大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ 30mg/kg。72 h后尾靜脈采血檢測隨機血糖，≥16.7 mmol/L為糖尿病造模成功。繼續高糖高脂飼料喂養1周，代謝籠收集大鼠24 h尿液，檢測尿蛋白定量。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖陽性、尿蛋白陽性，則DN模型制備成功[12]。

將造模成功大鼠隨機分為模型組、陽性藥組和黃精多糖低、高劑量組，每組10只。黃精多糖低、高劑量組按人與大鼠體表面積（1∶6.25）換算給藥劑量，予黃精多糖溶液200、800 mg/kg灌胃，陽性藥組予厄貝沙坦溶液30 mg/kg灌胃，灌胃體積1 mL/kg，正常組和模型組予等體積蒸餾水灌胃，1次/d，連續4周。每周周六晚禁食12 h，周日早8:00尾靜脈采血檢測空腹血糖（FBG），每2周稱量大鼠體質量并記錄。

1.5 指標檢測

1.5.1 腎功能指標檢測

給藥結束后，大鼠禁食不禁水，放入代謝籠中收集24 h尿液，檢測尿蛋白含量。過量麻醉處死大鼠，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測SCr、BUN水平。

1.5.2 腎組織病理染色

取腎組織，經10%福爾馬林溶液固定24 h，水洗20 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（5 μm），行HE染色。光學顯微鏡下觀察大鼠腎組織病理改變。

1.5.3 腎組織氧化應激指標及總鐵離子含量檢測

取腎組織，預冷PBS漂洗3次，剪碎后稱取0.1 g組織，加入900 μL生理鹽水低溫勻漿，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，試劑盒檢測腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量。

1.5.4 qPCR檢測

取凍存大鼠腎組織，冰浴勻漿，裂解，提取總RNA，反轉錄合成cDNA。按PCR試劑盒說明書步驟操作，熒光定量PCR 儀進行定量分析。反應條件：95 ℃、15 min，95 ℃、20 s，56 ℃、20 s，共40個循環。2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.5 Western blot檢測

取腎組織，加入RIPA裂解緩沖液150 μL，勻漿離心后留取蛋白上清液。采用BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度，將蛋白濃度進行均一化。取等量蛋白20 μg，8%～12% SDS-PAGE 進行蛋白分離，將其轉移至PVDF 膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Transferrin一抗（1∶2 000）、FTH1一抗（1∶3 000）、GPX4 一抗（1∶3 000）、β-actin 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗（1∶9 000），室溫孵育2 h。TBST洗膜，ECL法顯影檢測，使用Image J軟件對條帶灰度值進行分析，計算目的蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

采用SPSS Statistics 25.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，所有數據進行正態性和方差齊性檢驗，若滿足則采用t檢驗，若不滿足則采用非參數檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃精多糖對模型大鼠體質量和空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠體質量明顯減少（P＜0.01），FBG明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組大鼠體質量明顯增加（P＜0.05），各給藥組大鼠FBG差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠體質量和FBG比較（±s）

表2 各組大鼠體質量和FBG比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05

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2.2 黃精多糖對模型大鼠腎功能指標的影響

與正常組比較，模型組大鼠SCr、BUN及24 h尿蛋白含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組及黃精多糖高劑量組大鼠SCr、BUN及24 h尿蛋白含量明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠腎功能指標比較（±s）

表3 各組大鼠腎功能指標比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.3 黃精多糖對模型大鼠腎組織病理形態的影響

正常組大鼠腎小球、腎小管結構未見異常，系膜及系膜基質未見增生，無炎性細胞浸潤等現象；模型組大鼠可見腎小管局灶變性、萎縮，腎小球基底膜略增厚，系膜增生，腎小球、腎小管出現脂肪變性；各給藥組大鼠病變減輕，以陽性藥組和黃精多糖高劑量組改善更明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織形態（HE染色）

2.4 黃精多糖對模型大鼠腎組織氧化應激指標及總鐵離子含量的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織MDA、總鐵離子含量明顯增加，GSH含量明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和黃精多糖高劑量組大鼠腎組織MDA、總鐵離子含量明顯減少，GSH含量明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織MDA、GSH和總鐵離子含量比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.5 黃精多糖對模型大鼠腎組織鐵死亡相關基因表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 mRNA表達明顯升高，GPX4 mRNA表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃精多糖高劑量組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 mRNA表達明顯降低，陽性藥組和黃精多糖高劑量組GPX4 mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見表5。

表5 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4 mRNA表達比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4 mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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2.6 黃精多糖對模型大鼠腎組織鐵死亡相關蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 蛋白表達明顯升高，GPX4 蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和黃精多糖低、高劑量組大鼠腎組織Transferrin、FTH1 蛋白表達明顯降低，GPX4蛋白表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表6。

圖2 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白免疫印跡

表6 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白表達比較（±s）

表6 各組大鼠腎組織Transferrin、FTH1、GPX4蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

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3 討論

DN屬中醫學“腎消”“下消”“水腫”“尿濁”等范疇，病位主要在脾腎。脾為后天之本，主運化，水谷精微需腎中陽氣溫煦，腎為先天之本，主藏精，腎中精氣亦賴后天水谷精微的不斷補充與化生，脾腎兩臟互滋互養，相互為用。河北省名中醫蘇秀海主任醫師經多年臨證，總結DN中醫病機為脾腎虧虛，固攝失權，其中痰濕、瘀血、熱毒損及腎絡，造成精微物質漏泄，病久陰損及陽，致陰陽兩虛，濁毒內停，嚴重者發展為腎衰竭。黃精味甘，性平，具有補氣、養陰、健脾、潤肺、益腎功效，在治療DN中作用突出。基于此，本研究通過建立DN大鼠模型，明確黃精多糖對DN的治療作用，探討黃精多糖治療DN的作用機制。

本研究結果顯示，模型組大鼠血糖、SCr、BUN及24 h尿蛋白含量較正常組明顯升高，病理觀察發現，模型組大鼠腎組織出現明顯的腎小管萎縮及腎小球增生，同時有一定程度的炎性細胞浸潤，與DN病理學表現一致[13]。GSH和MDA是反映機體氧化損傷程度的重要指標。本研究發現，黃精多糖可不同程度改善DN大鼠腎功能相關指標，緩解腎組織病理變化，減輕機體氧化應激損傷，且以黃精多糖高劑量組最為明顯。提示黃精多糖對DN有一定治療作用。

鐵死亡與DN發生發展關系密切。糖尿病小鼠予鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1干預后，尿白蛋白肌酐比顯著降低，且Ferrostatin-1可顯著降低腎臟中鐵蛋白及腎小管鐵含量[14]。Transferrin是由結構相似的2個亞基組成的糖蛋白，是鐵死亡特異標志物之一，通常每個亞基可結合1個三價鐵離子，共結合2個三價鐵離子，組成三價載鐵Transferrin復合物（holo-Tf）[15]。holo-Tf與轉鐵蛋白受體（TfR）結合后通過受體介導的內吞作用進入細胞核形成核內體，因核內體酸化，holo-Tf/TfR復合物構象發生改變，鐵離子隨即從復合物中釋放進入胞質，參與合成各類含鐵酶，調控細胞生命活動[16]。鐵蛋白是機體最主要的鐵儲存倉，最重要的作用是為細胞提供鐵緩沖能力，通過儲存細胞內游離鐵離子維持細胞鐵穩態，由2 種多肽鏈組成：鐵蛋白輕鏈（FTL）和FTH[17]。FTH1有鐵氧化酶活性，能催化亞鐵氧化[18]。GPX4是清除脂質過氧化物的酶，在鐵死亡過程中發揮核心調控作用。抑制GPX4活性或其表達缺失會引發不受控制的多不飽和脂肪酸氧化和脂肪酸自由基生成，進一步通過脂質活性氧依賴性方式促進鐵死亡發生。反之，上調GPX4表達則可減少脂質活性氧誘導的細胞鐵死亡[19]。本研究中模型組大鼠腎組織總鐵離子含量增加，Transferrin、FTH1 mRNA和蛋白表達明顯升高，GPX4 mRNA和蛋白表達明顯降低，表明DN伴有鐵死亡發生。而黃精多糖可通過降低DN大鼠腎組織總鐵離子含量及Transferrin、FTH1表達，升高GPX4表達，抑制鐵死亡，從而發揮治療DN作用。