羌活勝濕湯指標(biāo)成分含量測定方法建立及量值傳遞研究

高文雅 ，徐赫 ，周嚴(yán)嚴(yán) ，趙海譽 ，王宏潔 ，邊寶林 ，楊健 ，魏曉露 ，范志昆 ，司南

1.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700； 2.葵花藥業(yè)集團(tuán)（貴州）宏奇有限公司，貴州 六盤水 553400

羌活勝濕湯由羌活、獨活、藁本、防風(fēng)、甘草、川芎、蔓荊子7味藥組成，是祛風(fēng)勝濕止痛的代表方劑，已被國家中醫(yī)藥管理局《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》收錄。羌活勝濕湯出自《內(nèi)外傷辨惑論》，主治腰痛、項強、頭痛、肩背痛等疼痛類病證[1]。后世記載羌活勝濕湯的各類中醫(yī)古籍文獻(xiàn)近百種，大多遵從《內(nèi)外傷辨惑論》的方劑組成、用量、主治，延伸和擴(kuò)展了該方的臨床應(yīng)用，以羌活勝濕湯之名沿用至今。羌活勝濕湯長于祛風(fēng)勝濕止痛[2]，以辛苦溫散之品為主組方，共奏祛風(fēng)勝濕之效，使客于肌表之風(fēng)濕隨汗而解，主治風(fēng)濕在表之頭身重痛而表證不明顯者，以頭身重痛或腰脊疼痛，苔白脈浮為辨證要點?，F(xiàn)代醫(yī)家將羌活勝濕湯應(yīng)用于內(nèi)科、骨科、婦科等，辨證為風(fēng)濕在表者均可以該方為基礎(chǔ)方加減治療[1]，適用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生癥、強直性脊柱炎等屬風(fēng)濕在表者[3]，充分體現(xiàn)了異病同治的中醫(yī)特點，具有重要的臨床應(yīng)用價值和意義。

目前，羌活勝濕湯尚無成藥流通于市場，對該方的研究多集中于臨床應(yīng)用方面，有研究者采用HPLC建立了羌活勝濕湯的指紋圖譜[4-5]，但鮮有反映該方含量測定的研究。因此，為更好地控制羌活勝濕湯的質(zhì)量，本研究運用HPLC，以升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸、蛇床子素為指標(biāo)成分建立多成分含量測定方法，為全面控制羌活勝濕湯的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-2030C 3D 高效液相色譜儀，日本島津公司；KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；YS-04B-小型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；XA105 型十萬分之一、ML-104T/02型萬分之一分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；2L美味世家煎藥鍋電砂鍋，永達(dá)基電器廠；C21-WT2112T、 SK2106 C21-SK2105、 RT-2135 C21-RT2135美的多功能電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司；CHRIST ALPHA 1-2LD PLUS臺式凍干機(jī)，德國CHRIST公司。

升麻素苷、甘草酸銨、異歐前胡素、阿魏酸、蛇床子素、羌活醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111522-201712、 110731-200615、 111827-201812、 110733-201614、 111822-201710、 111820-201705、 111523-201610、111610-201607，純度分別為98%、99%、99.5%、99.0%、99.5%、99.9%、96.1%、93.1%。色譜級乙腈、甲醇，質(zhì)譜級甲酸，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；娃哈哈純凈水。

羌活、獨活、藁本、防風(fēng)、甘草、川芎、蔓荊子藥材及飲片均由葵花藥業(yè)集團(tuán)（貴州）宏奇有限公司提供，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院何希榮主管藥師鑒定，分別為傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T.Chang 的干燥根莖和根，傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescensK Maxim. f.biserrataShan et Yuan的干燥根，傘形科植物遼藁本Ligusticum jeholenseNakai et Kitag.的干燥根莖和根，傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根，傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，馬鞭草科植物單葉蔓荊Vitex trifoliaL. var.simplicifoliaCham.的干燥成熟果實。藥材產(chǎn)地信息見表1。各藥材均按2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）方法加工成飲片。

表1 羌活勝濕湯組方藥物來源

2 方法與結(jié)果

2.1 羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品制備

15批組方藥物飲片隨機(jī)組合，稱取羌活4 g、獨活4 g、藁本2 g、防風(fēng)2 g、炙甘草2 g、川芎2 g、蔓荊子1.2 g粉碎制成的最粗粉于不銹鋼鍋中，加水400 mL，浸泡30 min，1 600 W加熱至沸騰，調(diào)至500 W，煎煮35 min，趁熱過濾，濾液冷凍干燥至干，粉碎，即得。

2.2 含量測定方法建立

2.2.1 色譜條件

采用SilGreen C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0～40 min，2%～25%A；40～70 min，25%～45%A；70～80 min，45%～60%A；80～90 min，60%～100%A；90～100 min，100%A），流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，檢測波長254、328 nm。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取基準(zhǔn)樣品粉末0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液25 mL，稱定質(zhì)量，密塞，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取15 min，放涼，補足減失質(zhì)量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 空白試驗

根據(jù)2020年版《中國藥典》各藥含量測定項下描述，升麻素苷、阿魏酸、甘草酸、蛇床子素、異歐前胡素分別為防風(fēng)、藁本、川芎、炙甘草、獨活及羌活的指標(biāo)成分。色譜圖比對結(jié)果顯示，基準(zhǔn)樣品中阿魏酸來源主要為藁本、川芎和羌活。按“2.1”項下方法分別制備防風(fēng)陰性、羌活陰性、獨活陰性、藁本+川芎+羌活陰性和炙甘草陰性對照基準(zhǔn)樣品。各陰性對照基準(zhǔn)樣品按“2.2.2”項下方法分別制備相應(yīng)陰性對照溶液，進(jìn)行分析，色譜圖見圖1。該色譜條件下各陰性對照均無干擾，出峰良好，表明方法專屬性良好。

圖1 羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品及其組方藥物陰性對照基準(zhǔn)樣品HPLC圖譜比對

2.2.3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取升麻素苷1.81 mg、蛇床子素1.30 mg、異歐前胡素2.82 mg、甘草酸銨5.20 mg、阿魏酸18.91 mg于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋后得系列混合對照品溶液，精密吸取混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，每個濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，測定峰面積，以對照品濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。于254 nm波長處對升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素進(jìn)行檢測，328 nm波長處對阿魏酸、蛇床子素進(jìn)行檢測，結(jié)果升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸和蛇床子素5種成分均在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見表2。

表2 羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品中5種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.3.3 精密度試驗

取羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品（批號JZYP-01），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸、蛇床子素峰面積RSD 分別為0.10%、0.12%、0.34%、0.10%、0.16%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗

精密稱取羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品（批號JZYP-01）6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，同時測定升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸和蛇床子素5種成分峰面積，RSD 分別為0.23%、0.40%、1.04%、0.24%、0.76%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，于室溫放置，按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、4、8、12、20、24、30、36 h進(jìn)樣，測定各指標(biāo)成分的峰面積，升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸、蛇床子素峰面積的RSD 分別為0.21%、0.28%、0.48%、0.26%、0.25%，表明供試品溶液中5種被測成分含量至少在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.6 加樣回收率試驗

精密稱取5種對照品，用甲醇溶液制成每mL分別含有升麻素苷1.04 μg、甘草酸銨9.96 μg、異歐前胡素0.26 μg、阿魏酸3.02 μg、蛇床子素1.24 μg的溶液，即得加樣溶液。精密稱取羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品（批號JZYP-01）0.05 g，共6份，按“2.2.2”項下方法（其中70%甲醇溶液用上述加樣溶液替代）制備供試品溶液，進(jìn)行分析，計算回收率。結(jié)果升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸和蛇床子素平均回收率分別為101.84%、96.61%、96.98%、98.93%、97.41%，RSD分別為1.95%、2.72%、1.98%、1.83%、1.71%，符合方法學(xué)要求。

2.3 樣品測定及成分傳遞

2.3.1 樣品含量測定

取按“2.1”項下方法制備的15批羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品（JZYP-01～JZYP-15），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定，計算升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸及蛇床子素5種成分含量，結(jié)果見表3。按羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品干燥品計算，升麻素苷、甘草酸、異歐前胡素、阿魏酸、蛇床子素含量分別為0.37～0.51 mg/g、4.81～6.11 mg/g、0.07～0.18 mg/g、1.30～1.74 mg/g、0.42～0.78 mg/g。

表3 15批羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品5種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

2.3.2 飲片-基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分傳遞

計算指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率（基準(zhǔn)樣品中含量與飲片中含量的比值），15批飲片-基準(zhǔn)樣品的傳遞結(jié)果見表4?？梢姡娠嬈交鶞?zhǔn)樣品的過程中，脂溶性較強的異歐前胡素和蛇床子素的轉(zhuǎn)移率低于10%，升麻素苷及甘草苷的轉(zhuǎn)移率均大于50%。

表4 15批羌活勝濕湯飲片-基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率（%）

3 討論

羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang 或?qū)捜~羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.的干燥根及根莖，羌活的歷代本草沿革與2020年版《中國藥典》的功能主治、采收加工及產(chǎn)地信息基本一致。通過實地調(diào)研，發(fā)現(xiàn)野生品多為羌活，而種植品種多為寬葉羌活。在市場流通領(lǐng)域調(diào)研藥材采收過程，發(fā)現(xiàn)市場以羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang為主流流通品種。在本研究的色譜條件下，筆者發(fā)現(xiàn)羌活和寬葉羌活中羌活醇與異歐前胡素的含量存在明顯差異，與文獻(xiàn)報道[6]一致。提示使用不同基源的藥材可能使指標(biāo)性成分的含量范圍波動。結(jié)合上述歷史沿革及市場流通情況考證結(jié)果，羌活勝濕基準(zhǔn)樣品所用的羌活藥材基原確定為傘形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H. T. Chang。

國家中醫(yī)藥管理局《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》所載羌活勝濕湯組成及劑量為羌活、獨活各一錢，藁本、防風(fēng)、甘草（炙）、川芎各五分，蔓荊子三分。由于歷史的變遷，度量衡不盡相同?！斗絼W(xué)》羌活勝濕湯的表述為：羌活、獨活各一錢（6 g），藁本、防風(fēng)、甘草（炙）各五分（3 g），蔓荊子三分（2 g），川芎二分（1.5 g）[7]，可見其換算比例為：1錢=6 g，1兩=60 g?，F(xiàn)代度量衡中，1兩=50 g?！吨袊鴼v代度量衡簡表》中，金代1錢約為4 g，1兩約為40 g。文獻(xiàn)普遍認(rèn)為宋代1兩為40～41.3 g[8-13]。金代與宋度量衡基本一致，因此按該方法折算，處方用量為：羌活、獨活各一錢為4 g，藁本、防風(fēng)、炙甘草、川芎各五分為2 g，蔓荊子三分為1.2 g。

羌活勝濕湯的組方藥味在2020年版《中國藥典》有HPLC含量測定項目的成分為羌活醇、異歐前胡素、蛇床子素、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、阿魏酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸及蔓荊子黃素。前期試驗對處方中7味藥的10個成分含量進(jìn)行了初步測定，分析其HPLC圖譜的分離情況。甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、羌活醇有雜峰干擾，分離情況不好；蔓荊子黃素峰形好、無干擾，但峰極小。升麻素苷、阿魏酸在328 nm波長處，甘草酸在254 nm波長處峰形好且無干擾。蛇床子素及異歐前胡素在2個波長處均峰形好且無干擾。根據(jù)分析結(jié)果，秉持盡量多地體現(xiàn)處方藥味的原則，通過方法學(xué)驗證，最終選擇異歐前胡素（羌活）、蛇床子素（獨活）、阿魏酸（藁本、川芎）、升麻素苷（防風(fēng)）及甘草酸（甘草）5種成分進(jìn)行含量測定。后續(xù)將建立羌活勝濕湯特征圖譜，對蔓荊子藥味進(jìn)行質(zhì)量控制。

考察不同色譜柱（SilGreen、YMC Hydrosphere C18）及不同色譜儀（安捷倫1260、島津LC-2030C、島津LC20A）對5種成分測定的系統(tǒng)適用性。由于基準(zhǔn)樣品成分復(fù)雜，用同一色譜條件進(jìn)行含量測定過程中，除個別型號色譜柱拖尾因子略有逸出外，該方法系統(tǒng)適用性良好。根據(jù)3種儀器多個不同色譜柱的實驗結(jié)果，同時參照2020年版《中國藥典》規(guī)定，限制本方法中理論塔板數(shù)，按升麻素苷峰計應(yīng)不低于2 000。

從飲片-基準(zhǔn)樣品指標(biāo)成分傳遞結(jié)果可以看出，由水提濃縮制成的基準(zhǔn)樣品，水溶性成分提取率高，而脂溶性成分提取率低。阿魏酸是2020年版《中國藥典》藁本及川芎的含量測定指標(biāo)成分，然而僅針對這2味藥進(jìn)行質(zhì)量傳遞考察得到的傳遞率為155.64%，大于100%。經(jīng)HPLC圖譜比對，本處方羌活中阿魏酸峰較為明顯，含量較高。但阿魏酸不是2020年版《中國藥典》羌活藥材的含量測定指標(biāo)成分，故未將其納入轉(zhuǎn)移率計算。后續(xù)將建立羌活藥材及飲片中阿魏酸含量測定方法，對羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品中阿魏酸的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行補充。

按照藥典通則描述，對羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品分別進(jìn)行高溫（60 ℃）、高濕（相對濕度90%±5%）及強光照射（4 500 lx±500 lx）試驗，于第5、10日取樣檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高濕條件下（濕度92.5%、1～2 d；75%、2～3 d）樣品吸潮明顯、呈果凍狀，不適合檢測；高溫（60 ℃）及強光照射條件下，異歐前胡素及蛇床子素的含量均相應(yīng)減少。因此，對羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品貯存條件應(yīng)為遮光、密封、防潮。

本研究建立了在同一HPLC條件下同時測定經(jīng)典名方羌活勝濕湯基準(zhǔn)樣品中5種指標(biāo)成分含量方法，通過全面方法學(xué)驗證，簡便易行，可為全面控制該方質(zhì)量提供依據(jù)。