幽門螺桿菌感染對(duì)慢性胃炎中醫(yī)證素與腸道菌群的影響

胡瑩瑩 ，林雪娟 ，李星慧 ，黃琰鈺 ，黃偉榮

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證研究基地，福建省2011中醫(yī)健康管理協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122； 2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院，福建 晉江 362200

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染是慢性胃炎最常見的病因，Hp可長(zhǎng)期定植于人體胃黏膜，并引起胃黏膜活動(dòng)性炎癥反應(yīng)[1-2]，進(jìn)而出現(xiàn)消化不良癥狀。中醫(yī)藥在根除Hp、減輕臨床癥狀及改善胃黏膜病理形態(tài)方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[3-5]。

胃腸道菌群被稱為“微生物器官”，對(duì)平衡人體微環(huán)境具有重要意義，通過參與人體生理活動(dòng)和病理過程調(diào)節(jié)人體健康，并對(duì)胃腸道疾病的產(chǎn)生有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，胃內(nèi)菌群的種類和豐度與Hp感染密切相關(guān)，Hp感染可改變?nèi)梭w胃腸道菌群的正常結(jié)構(gòu)，增加致病菌數(shù)量，降低腸道內(nèi)有益菌的豐度[6-9]。因此，胃腸道菌群分析可為Hp陽(yáng)性人群提供重要生物學(xué)指標(biāo)，胃腸道菌群變化特征可作為慢性胃炎中醫(yī)“證”的生物學(xué)基礎(chǔ)。

本研究探討Hp感染對(duì)慢性胃炎中醫(yī)證素與腸道菌群的影響及中醫(yī)證素與腸道菌群的相關(guān)性，為臨床辨治提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2021年3月－2022年1月就診于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院脾胃科門診及體檢中心的慢性胃炎患者180例，同時(shí)選取來(lái)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院體檢中心的健康志愿者30名作為對(duì)照。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

慢性胃炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《中國(guó)慢性胃炎共識(shí)意見（2017年，上海）》[10]。Hp感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《第五次全國(guó)幽門螺桿菌感染處理共識(shí)報(bào)告》[11]：13C/14C-尿素呼氣試驗(yàn)（UBT）、組織學(xué)光鏡檢查、快速尿素酶試驗(yàn)任意1 項(xiàng)診斷為陽(yáng)性，即可判定為Hp感染。

證素積分診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《證素辨證學(xué)》[12]。根據(jù)四診信息在診斷中的權(quán)重，以加權(quán)閾值法確定病理要素和證素。每一癥狀的輕重以中等程度為準(zhǔn)，該癥狀重時(shí)其定量診斷值乘1.5，該癥狀輕時(shí)乘0.7。各證素的診斷確定以100作為通用閾值，各癥狀對(duì)某證素貢獻(xiàn)度之和達(dá)到或超過100時(shí)即可診斷為該證素。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

Hp 陽(yáng)性組：①符合上述慢性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合Hp感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡18～70歲；④1個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素和質(zhì)子泵抑制劑者；⑤1個(gè)月內(nèi)未服用過黃連素、二甲雙胍或益生菌制劑者。

Hp陰性組：①符合慢性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；②Hp-；③年齡18～70歲；④1個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素和質(zhì)子泵抑制劑者；⑤1個(gè)月內(nèi)未服用過黃連素、二甲雙胍或益生菌制劑者。

健康組：①年齡18～70歲；②心理健康，身體無(wú)明顯不適癥狀；③Hp-；④證素積分均低于70分；⑤常見理化指標(biāo)如血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、心肌酶、心電圖或B 超等未見異常或無(wú)器質(zhì)性改變；⑥1個(gè)月內(nèi)未服用過抗生素、質(zhì)子泵抑制劑或益生菌制劑者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①合并心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病或影響其生存的嚴(yán)重疾病者，如腫瘤或艾滋病；②有嚴(yán)重認(rèn)知障礙、精神病患者；③其他胃腸道疾病患者，如胃癌、腸癌等消化道腫瘤者，慢性腸炎者，合并胃潰瘍或胃大部切除者；④妊娠或哺乳期婦女。

1.5 四診信息采集

參照“600常見癥狀的辨證意義”[13]，結(jié)合臨床調(diào)研與專家意見，制訂慢性胃炎四診信息采集表，由2位經(jīng)過培訓(xùn)的中醫(yī)人員依據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)四診方法進(jìn)行四診信息采集并記錄。

1.6 樣本采集

采用14C-UBT進(jìn)行Hp檢測(cè)，由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬晉江中醫(yī)院電子內(nèi)鏡室指派1名對(duì)胃鏡檢查有豐富操作和診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師進(jìn)行檢查，得出胃鏡檢查報(bào)告。

糞便采集：用取樣棉簽蘸取中段、內(nèi)部糞便樣品，放入糞便采樣管，并于采樣當(dāng)日移至-80℃冰箱保存。所有樣本送至杭州谷禾健康生物科技有限公司進(jìn)行腸道微生物高通量測(cè)序。

1.7 樣本提取與檢測(cè)

利用試劑盒提取樣本DNA，保證DNA濃度、純度滿足二代測(cè)序要求。選擇V4區(qū)為測(cè)序區(qū)域，使用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用磁珠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，用2%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，獲取文庫(kù)。用Qubit對(duì)回收的文庫(kù)進(jìn)行定量，用qPCR進(jìn)行接頭效率檢測(cè)，用Illumina NovaSeq測(cè)序。

1.8 數(shù)據(jù)分析流程與方法

測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控留下有效數(shù)據(jù)用于下一步分析。數(shù)據(jù)間通過overlap拼接成Tags，通過可操作分類單元（OTU）聚類方法獲得擴(kuò)增子序列變異（ASV）統(tǒng)計(jì)結(jié)果，并將原始序列比對(duì)回ASVs。使用97%的默認(rèn)參數(shù)挑選OTU的代表序列，通過qiime2基于silva138數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋，進(jìn)一步生成OTU列表，在kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。基于物種注釋結(jié)果及OTUs的豐度信息，進(jìn)一步行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析，統(tǒng)計(jì)并評(píng)估菌群物種的豐富度和多樣性。使用R stats 包Kruskal方法比較樣本間或組間各分類水平的差異。LEfSe分析使用線性判別分析（LDA）與非參數(shù)的 Kruskal-Wallis及 Wilcoxon秩和檢驗(yàn)相結(jié)合，檢測(cè)各組間分類單位上的差異。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布采用四分位數(shù)法進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

Hp陽(yáng)性組50例，其中男性26例、女性24例；Hp陰性組130例，其中男性70例、女性60例；健康人30名，其中男性16例、女性14例。年齡最小者18歲，年齡最大者70歲。

2.2 證素分布情況

Hp陽(yáng)性組常見病位證素依次為：胃、脾和肝。Hp陰性組常見病位證素依次為：胃、肝和脾。Hp陽(yáng)性組常見病性證素依次為：氣滯、濕、熱、痰、陰虛、陽(yáng)虛和氣虛。Hp陰性組常見病性證素依次為：熱、陰虛、氣滯、濕、痰、氣虛和陽(yáng)虛。見表1。

表1 Hp陽(yáng)性組、Hp陰性組證素分布

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

Hp陽(yáng)性組、Hp陰性組及健康組測(cè)序樣本共獲得6 392個(gè)OTUs，其中，3組共有的OTUs 5 241個(gè)，Hp陽(yáng)性組特有OTUs 35個(gè)，Hp陰性組特有OTUs 261個(gè)，健康組特有OTUs 131個(gè)，說(shuō)明不同組間存在大部分重合的群落。見圖1。

圖1 3組受試者OTU韋恩圖

2.4 多樣性分析

2.4.1 Alpha多樣性分析結(jié)果

Hp陽(yáng)性組Simpson和Shannon指數(shù)均低于Hp陰性組和健康組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明3組樣本在群落豐富度和群落異質(zhì)性上差異不顯著。見圖2。

圖2 3組受試者Alpha多樣性組間比較

2.4.2 Beta多樣性Anosim檢驗(yàn)結(jié)果

考慮到物種差異，使用非加權(quán)距離的Anosim分析，結(jié)果R=0.053，R值介于（-1，1）之間，說(shuō)明不同組間菌群結(jié)構(gòu)存在差異，且組間差異大于組內(nèi)差異；P=0.03，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 3組受試者非加權(quán)距離Anosim分析

2.5 組間物種組成情況

2.5.1 門水平組成分析

門水平上，3組絕大部分OTU屬于10個(gè)門，從高到低依次為：擬桿菌門Bacteroidota、厚壁菌門Firmicutes、 變形菌門Proteobacteria、 梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteriota、脫硫桿菌門Desulfobacterota、疣微菌門Verrrucomicrobia、巴氏桿菌門Patescibacteria、彎曲桿菌門Campilobacterota、互養(yǎng)菌門Synergistota。另外還有一些未識(shí)別分類的物種統(tǒng)一歸于一個(gè)門unidentified。見圖4。

圖4 3組受試者糞便樣本菌群門水平相對(duì)豐度

3組優(yōu)勢(shì)菌門在構(gòu)成上基本一致，但在豐度上存在差異：Hp 陽(yáng)性組變形菌門Proteobacteria 的豐度高于Hp陰性組和健康組（P＞0.05），梭桿菌門Fusobacteria的豐度低于Hp陰性組和健康組（P＞0.05）。見圖5。

圖5 3組受試者糞便樣本菌群門水平組成

2.5.2 屬水平組成分析

3組樣本在優(yōu)勢(shì)菌屬上的構(gòu)成相似，排名前10位的優(yōu)勢(shì)菌屬由高到低依次為：擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f、普雷沃氏菌屬Prevotella、糞桿菌屬Faecalibacterium、巨單胞菌屬M(fèi)egamonas、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium、 副 擬 桿 菌 屬Parabacteroides、梭桿菌屬Fusobacterium、羅氏菌屬Roseburia、毛螺菌屬Lachnospira、屬于毛螺菌科的Eubacterium_eligens_group 菌群。組間群落比較，健康組考拉桿菌屬Phascolarctobacterium和梭桿菌屬Fusobacterium的豐度較Hp陽(yáng)性組和Hp陰性組高，而巨單胞菌屬M(fèi)egamonas、副擬桿菌屬Parabacteroides在Hp 陽(yáng)性組表現(xiàn)更為富集。見圖6、圖7。

圖6 3組受試者糞便樣本菌群屬水平相對(duì)豐度

圖7 3組受試者糞便樣本菌群屬水平組成

通過Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)各菌屬進(jìn)行豐度比較，3組樣本擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f（P＜0.01）、嗜膽菌屬Bilophila（P＜0.05）、厚壁菌門未知菌屬Firmicutes|c（P＜0.05）、經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia（P＜0.05）、毛螺菌屬Lachnospira（P＜0.05）、毛旋螺菌科UCG-010 群Lachnospiraceae_UCG-010（P＜0.01）、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium（P＜0.05）、薩特氏菌屬Sutterella（P＜0.05）、巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g（P＜0.01）差異顯著。與健康組比較，Hp陽(yáng)性組巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g豐度明顯減少（P＜0.01），擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f、厚壁菌門未知菌屬Firmicutes|c、考拉桿菌屬Phascolarctobacterium上豐度減少（P＜0.05）；Hp陰性組擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f豐度減少（P＜0.01）。與Hp陰性組相比，Hp陽(yáng)性組經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia豐度明顯減少（P＜0.01）， 毛螺菌屬Lachnospira、薩特氏菌屬Sutterella豐度減少（P＜0.05）。 Hp 陽(yáng)性組毛旋螺菌科UCG-010 群Lachnospiraceae_UCG-010 豐度低于Hp 陰性組（P＜0.05）、健康組（P＜0.01）。見表2。

表2 3組受試者腸道菌群屬水平豐度比較［M（Q1，Q3），%］

通過LEfSe分析獲得組間差異標(biāo)記物。默認(rèn)LDA＞2、P＜0.05，共獲得39個(gè)顯著差異標(biāo)記物，其中，Hp陽(yáng)性組特有12個(gè)重要微生物類群，Hp陰性組有27個(gè)重要微生物類群。Hp 陽(yáng)性組差異類群在變形菌門Proteobacteria、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、腸桿菌科Enterobacteriaceae、巨球形菌屬M(fèi)egasphaera豐度較高；Hp 陰性組差異類群在毛螺菌目Lachnospirales、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳桿菌科Lactobacillaceae 及乳桿菌屬Lactobacillus豐度較高。見圖8。

圖8 Hp陽(yáng)性組與Hp陰性組患者LEfSe物種標(biāo)記物

2.6 Hp陽(yáng)性、Hp陰性慢性胃炎證素與腸道菌群相關(guān)性比較

將Hp陽(yáng)性與Hp陰性患者證素與腸道菌群的菌屬豐度做相關(guān)性比較，發(fā)現(xiàn)同一菌屬與不同證素之間相關(guān)性不同。Hp陽(yáng)性組毛螺菌屬Lachnospira與肝呈正相關(guān)，與痰呈負(fù)相關(guān)；薩特氏菌屬Sutterella與陰虛呈正相關(guān)。Hp陰性組薩特氏菌屬Sutterella與肝、氣滯呈正相關(guān)，與熱呈負(fù)相關(guān)。見表3。

表3 Hp陽(yáng)性、Hp陰性慢性胃炎證素與腸道菌群屬水平豐度相關(guān)性（r）

3 討論

3.1 幽門螺桿菌感染對(duì)病位、病性影響

本研究顯示，在病位證素分布上，Hp陽(yáng)性患者胃的頻率最高，其次是脾、肝；Hp陰性患者頻率最高的亦是胃，其次是肝、脾。可見，Hp感染對(duì)脾的影響較大，與相關(guān)研究結(jié)果一致[14-16]。一方面，脾胃共居中焦，為氣血生化之源、氣機(jī)升降之樞。生理上，二者納運(yùn)相得，升降相合，以助水谷運(yùn)化，精微布散。病理上，二者互結(jié)相兼，胃腑受邪，水谷不化，胃失和降，亦傷脾臟，脾不升清，精微不散；Hp為外來(lái)邪氣，Hp感染可傷胃腑，亦犯脾臟。另一方面，肝與脾胃密切聯(lián)系。肝主疏泄，調(diào)暢脾胃氣機(jī)，助脾胃升降相濟(jì)，納運(yùn)相得，化生氣血，涵養(yǎng)肝木。若肝氣郁結(jié)，乘脾犯胃，納運(yùn)失和，飲食積滯，胃腑壅滯為病。故慢性胃炎患者病位在胃，亦傷肝木，克伐脾土。

在病性證素分布上，Hp陽(yáng)性組以氣滯、濕、熱、痰等實(shí)性證素為主，而Hp陰性組熱、陰虛等證素占比較高。脾胃為氣機(jī)升降之樞，二者功能失常，升降失調(diào)則飲食內(nèi)停，阻滯氣機(jī)。氣滯加重脾胃運(yùn)化失司，水飲內(nèi)停，邪壅成滯，痰濕內(nèi)生，日久可郁而化熱，導(dǎo)致氣滯、濕邪、熱邪、痰邪相兼為患。研究表明，Hp感染與慢性胃炎濕熱證的發(fā)生存在相關(guān)性，感染Hp可出現(xiàn)胃腑濕、熱的相關(guān)癥狀，濕熱之邪內(nèi)生，痰濕內(nèi)盛，阻滯氣機(jī)，郁而化熱，進(jìn)一步加重濕熱之證[17-19]。Hp為外來(lái)之邪，外邪犯胃，正氣未虛，病程較短，因此，陰虛等虛性證素占比較低。臨床治療中，Hp感染初期，應(yīng)于辨證論治的基礎(chǔ)上佐以行氣、化濕、清熱、祛痰類中藥，防止Hp感染對(duì)胃腑的進(jìn)一步損傷。而Hp陰性組多為胃腑功能失調(diào)，飲食積滯，久積則郁而化火，煎灼陰液，日久則陰虛，陰虛則熱，二者相兼為病，故Hp陰性組可出現(xiàn)熱等實(shí)性證素，又可見陰虛等虛性證素。臨床治療慢性胃炎應(yīng)于辨證論治的基礎(chǔ)上佐以滋陰清熱之品，防止胃腑陰津耗傷，虛熱內(nèi)生。

3.2 幽門螺桿菌感染對(duì)腸道菌群影響

本研究發(fā)現(xiàn)，Hp陽(yáng)性組、Hp陰性組與健康組的優(yōu)勢(shì)菌門相同，均為擬桿菌門Bacteroidota、厚壁菌門Firmicutes、 變形菌門Proteobacteria、 梭桿菌門Fusobacteria、放線菌門Actinobacteriota，與目前研究發(fā)現(xiàn)人胃內(nèi)5大優(yōu)勢(shì)菌門相同[20]。雖然3組優(yōu)勢(shì)菌門在構(gòu)成上基本一致，但在豐度上存在差異，Hp陽(yáng)性組和Hp 陰性組變形菌門Proteobacteria 的豐度高于健康人群，結(jié)合組間差異標(biāo)記物結(jié)果，推測(cè)變形菌門Proteobacteria可能是感染Hp的慢性胃炎患者的特征性菌門。

在屬水平上，與健康人相比，Hp陽(yáng)性患者考拉桿菌屬Phascolarctobacterium、毛旋螺菌科UCG-010群Lachnospiraceae_UCG-010、巴斯德菌科未知菌屬Pasteurellaceae|g、擬桿菌目未知菌屬Bacteroidales|f上豐度較低。考拉桿菌屬厚壁菌門，該菌屬會(huì)增加Bacteroides、Odoribacter（被報(bào)道能有效降低腸道炎癥、抑制結(jié)腸癌的發(fā)生[21]）、Peptococcaceae等在胃腸道的豐度。毛旋螺菌科UCG-010群Lachnospiraceae_UCG-010的存在有助于改善胃腸黏膜屏障完整性，降低局部和全身炎癥風(fēng)險(xiǎn)。擬桿菌屬能產(chǎn)生抗炎介質(zhì)，抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、釋放促炎細(xì)胞因子，幫助維持胃腸道生物穩(wěn)態(tài)。研究顯示，擬桿菌屬過低會(huì)導(dǎo)致炎癥性胃腸道疾病的發(fā)生，如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎等[22]。我們推測(cè)Hp感染引起胃腸道菌群失調(diào)的原因，可能由于Hp感染引起胃黏膜萎縮和壁細(xì)胞顯著減少，導(dǎo)致胃酸分泌減少、pH值升高，胃內(nèi)環(huán)境改變，顯著抑制益生菌的生長(zhǎng)，使胃內(nèi)正常菌所占比例下降，對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用降低，胃內(nèi)的弱勢(shì)菌厭氧菌數(shù)量顯著增加，成為Hp感染患者胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌，從而導(dǎo)致胃內(nèi)微生態(tài)平衡破壞，慢性胃炎等疾病的發(fā)生。經(jīng)黏液真桿菌屬Blautia、毛螺菌屬Lachnospira、薩特氏菌屬Sutterella在Hp陰性患者胃腸道中豐度較高，而在Hp陽(yáng)性患者胃腸道豐度降低，推測(cè)可能與Hp定植對(duì)其抑制作用有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3 慢性胃炎證素與腸道菌群相關(guān)性

對(duì)慢性胃炎主要證素與腸道菌群各菌屬的豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Hp陰性組薩特氏菌屬Sutterella豐度與肝和氣滯呈正相關(guān)，與熱呈負(fù)相關(guān)。肝失疏泄可致氣滯，可見肝氣郁滯有利于薩特氏菌屬Sutterella富集，而“熱”對(duì)其富集具有抑制作用。Hp陽(yáng)性組毛螺菌屬Lachnospira豐度與肝呈正相關(guān)，與痰呈負(fù)相關(guān)。毛螺菌屬Lachnospira為腸道有益菌，肝氣疏泄助脾胃氣機(jī)調(diào)暢，表明肝氣調(diào)達(dá)有利于毛螺菌屬Lachnospira生長(zhǎng)。Hp致病特點(diǎn)與中醫(yī)濕熱之邪相似，濕邪內(nèi)阻，久郁化火，煉津?yàn)樘担禎駜?nèi)擾，表明痰濕可能是導(dǎo)致毛螺菌屬Lachnospira豐度降低的重要因素。

綜上所述，Hp感染對(duì)脾影響較大，易出現(xiàn)氣滯、濕、熱、痰等實(shí)性證素。Hp感染影響腸道菌群的構(gòu)成，降低中性菌及有益菌的豐度。本研究可為Hp感染患者臨床診治提供參考。